Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau
November 17th, 2013
Microfluïdische zuurstofcontrole biedt meer dan alleen gemak en snelheid ten opzichte van hypoxische kamers voor biologische experimenten. Vooral wanneer geïmplementeerd via diffusie door een membraan, kan microfluïdische zuurstof gelijktijdige vloeistof- en gasfase-modulaties op microschaalniveau bieden. Deze techniek maakt dynamische multi-parametrische experimenten mogelijk, die cruciaal zijn voor het bestuderen van eilandjespathofysiologie.
Het algemene doel van deze procedure is om minuten geschaalde intermitterende hypoxie toe te passen op micro geschaalde pancreas-oogjes om voorwaardeneffecten te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een multimodaal microfluïdisch apparaat te fabriceren met een dunne gasdoorlatende membraan. De tweede stap is het creëren van een geautomatiseerd zuurstofmodulatiesysteem.
Vervolgens worden oogjes zorgvuldig in het apparaat geladen en vervolgens worden vloeistof en zuurstof microfluidische systemen aangesloten. De laatste stap is het coördineren van microscopie met de multimodaal microfluidische systemen om de oogparameters te visualiseren die veranderen tijdens de zuurstofmodulatie. Uiteindelijk wordt de oogje, intermitterende hypoxie techniek gebruikt om aan te tonen dat de glucoserespons duidelijk verminderd is in hypoxie.
Terwijl temporele modulaties van hypoxie oogjes kunnen trainen om met minder beperking te reageren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals opgelost zuurstof of het gebruik van een hypoxische kamer, is dat nauwkeurige. Zuurstofconcentratie zou in snelle, minuscule tijdsintervallen aan de oogleden kunnen worden afgeleverd zonder schuurstress van ingewikkelde stromingen.
Het maakt ook real-time monitoring mogelijk met vloer en microscopie. Deze master kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het Alli-transplantatieveld, zoals het definiëren van hypoxische beperkingen op transplantatieplaatsen of conditioneringsregimes om transplantatieresultaten te verbeteren. Dus deze methode kan inzicht bieden in Alli-hypoxie.
Het kan ook worden toegepast op andere weefsels en systemen zoals het centrale zenuwstelsel, hartweefsels, de nieren en andere transplantaatorganen. Videodemonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat veel van de apparaatfabriek en oogjesverwerking. De stappen zijn moeilijk te leren vanwege de nieuwe interdisciplinaire aard van de techniek, maar inherent de uitdagende of vertrouwde Begin met het fabriceren van de deklaag van het microfluïdische apparaat.
Om dit te bereiken, giet DGAs vooraf gemengde PDMS tot een hoogte van 1,5 millimeter in een lege Petri-schaal en laat het twee uur uitharden bij 80 graden Celsius. Vervolgens wordt de glucosemicrofluidische laag gefabriceerd met de proefondervindelijke proefondervindelijke master door twee 350 micron dikke lagen van SU 8 21 50 te spincoaten om een enkele 700 micron laag op een vier inch siliconenwafer te vormen. Leg het vervolgens bloot aan UV-licht met behulp van de glucosemicrofluidische laag fotomasker om het microkanaalpatroon over te brengen op de SU acht-laag.
Spoel het onbedekte gebied weg met SU acht-ontwikkelaar. Giet vervolgens DGAs vooraf gemengde PDMS op de MA tot een hoogte van drie millimeter en laat het twee uur uitharden bij 80 graden Celsius. Eenmaal uitgehard, snijdt u de glucosemicrofluidische laag in vorm en gebruikt u een twee millimeter punch om de inlaat- en uitlaatpoorten te vormen, evenals een acht millimeter diameter punch voor de hoofdkamer.
Vervolgens wordt de microputtenmaster voor ooglidfixatie gefabriceerd door een 100 micron dikke laag van SU 8 2100 op een schone vier inch siliconenwafer te spincoaten, en vervolgens UV-litografie te gebruiken om het microputtenpatroon over te brengen op deze laag. Spoel de onbedekte gebieden weg met ontwikkelaar wanneer de microputtenmaster voltooid is. Voeg twee 100 micron lagen PDMS toe door te spincoaten bij 900 RPM gedurende 30 seconden en vervolgens 10 minuten uit te harden bij 80 graden Celsius om elke laag te produceren.
Nadat het voltooid is, pons u de twee millimeter diameter inlaat in de uitlaatpoorten. Ten slotte wordt de gasmicrofluidische master gefabriceerd door SU 8 2100 te spinnen tot 100 micron dikte zoals in de vorige laag, en overdracht de gasmicrofluidische patronen opnieuw met behulp van UV-litografie. Spoel het onbedekte gebied weg met ontwikkelaar.
Vervolgens giet u een 1,5 millimeter dikke laag PDMS op de gasmicrofluidische master en laat het twee uur uitharden bij 80 graden Celsius. Snijd vervolgens het PDMS in vorm met de scheermes. Ponset vervolgens twee millimeter diameter inlaat- en uitlaatpoorten in de deklaag om ze te laten aansluiten waar ze zich op de andere lagen bevinden om de meerdere lagen samen te hechten.
Bereid ze eerst voor door de oppervlakken schoon te maken met scotch tape, ze bloot te stellen aan een coronaboog en vervolgens de lagen met de hand uit te lijnen in de volgende volgorde. Plak eerst de membraan op de onderste gaslaag met de microputten naar boven. Plak vervolgens de glucosemicrofluidische laag op de microputtenmembraan.
Ten slotte wordt de inlaat- en uitlaag op de top gebonden, waarbij de hele samenstelling wordt ingekapseld. Help bij het vormen van een strakke binding door een gewicht van één kilogram bovenop de samenstelling te plaatsen en het drie uur te bakken bij 100 graden Celsius. Dan lekken.
Test het apparaat door water naar de waterige laag te laden, het apparaat onder water te zetten en lucht door de gaslaag te laten stromen met de spuit terwijl u op lekken let. Steriliseer ten slotte de lekvrije apparaten door 70% ethanol door de waterige laag te laten stromen gedurende één tot twee minuten. Stel de microdispensers in door eerst de besturingsdraden van de microdispensers aan te sluiten op de meegeleverde besturingseenheden.
Verbind vervolgens de bestuurders met de digitale IO-bord op poorten die overeenkomen met hun lab-weergavebesturingen. Verbind vervolgens vijf volt en 20 volt DC-voedingen met hun overeenkomstige contacten op de aandrijfunits en verbind de digitale IO met een laptop om lab-weergavecodes voor gascontrole uit te voeren zoals beschreven in de bijlage van het bijbehorende tekstprotocol. Verbind vervolgens één microdispenser met stikstof en de andere met perslucht, beide bevatten 5% kooldioxide en stel beide gassen in op twee PS.I. sluit de dispenseruitgangen aan in een T-splitsing voordat ze het microfluïdisch apparaat binnenkomen.
Monteer vervolgens het apparaat op de verwarmde trap van een omgekeerde microscoop met
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de toepassing van microfluïdische zuurstofcontrole voor dynamische modulatie van hypoxie in pancreaseilandjes. De techniek maakt real-time monitoring en nauwkeurige zuurstoflevering mogelijk, wat het begrip van eilandjefysiopathologie verbetert.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microfluidica
- Cellulaire biologie
- Eilandjefysiologie
Achtergrond
- Intermittente hypoxie kan de glucoserespons in pancreaseilandjes beïnvloeden.
- Traditionele hypoxische kamers zijn beperkt in precisie en snelheid.
- Microfluïdische apparaten kunnen gelijktijdige modulatie van zowel vloeistof- als gasfase bieden.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende weefsels buiten pancreaseilandjes.
Doel van de studie
- Om de voorwaardeneffecten van intermitterende hypoxie op pancreaseilandjes te onderzoeken.
- Om een microfluïdisch apparaat te ontwikkelen voor nauwkeurige zuurstofmodulatie.
- Om veranderingen in eilandjeparameters tijdens zuurstofmodulatie te visualiseren.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een multimodaal microfluïdisch apparaat met een gasdoorlatende membraan.
- Creatie van een gecomputeriseerd zuurstofmodulatiesysteem.
- Het laden van pancreaseilandjes in het apparaat voor experimenten.
- Real-time monitoring met behulp van microscopie tijdens zuurstofmodulatie.
Belangrijkste resultaten
- Glucoserespons in eilandjes is verminderd onder hypoxische omstandigheden.
- Tijdelijke modulaties van hypoxie kunnen de eilandjerespons verbeteren.
- De microfluïdische techniek maakt snelle en nauwkeurige zuurstoflevering mogelijk.
- Real-time monitoring biedt inzichten in eilandjegedrag onder verschillende zuurstofniveaus.
Conclusies
- De microfluïdische aanpak biedt aanzienlijke voordelen boven traditionele methoden.
- Deze techniek kan helpen bij het definiëren van hypoxische beperkingen in transplantatieplaatsen.
- Het heeft potentiële toepassingen in andere orgaansystemen en transplantatieonderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Precise, real-time modulation of oxygen microenvironments at the single islet level addresses a critical gap in modeling pathophysiological hypoxia relevant to islet transplantation and metabolic disease research. This microfluidic platform enables simultaneous control and monitoring of both gas and aqueous stimuli, supporting high-fidelity interrogation of stimulus-secretion coupling and cellular adaptation. The approach enhances predictive confidence for translational studies and informs risk-adjusted decisions in early discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by dissecting oxygen-dependent pathways in islet function.
- Supports functional target validation through real-time monitoring of calcium and KATP channel dynamics under hypoxic stress.
- Facilitates hypothesis testing on preconditioning regimens to improve transplant outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible microenvironment for quantitative assessment of glucose stimulus-secretion coupling.
- Delivers standardized, sub-minute oxygen modulation for robust assay development.
- Enables high-content, multimodal readouts via fluorescence microscopy and effluent analysis.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant hypoxic conditions for islet and other ex vivo tissue systems.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling real-time measurement of functional outputs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in metabolic and transplant research.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic technique integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling controlled, quantitative hypoxia studies at the single tissue level.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of oxygen-sensitive mechanisms in islet biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound or regimen evaluation under defined hypoxic conditions.
- Analytics: Delivers real-time, multimodal measurements of calcium, mitochondrial potential, and insulin secretion.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by mimicking transplant-relevant hypoxic microenvironments.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems and tissue types for broader R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in hypoxia-driven studies.
- Operational Value: Standardizes oxygen delivery and monitoring, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for preconditioning strategies and transplant interventions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic and transplant-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and multimodal microscopy.
- Demands access to precision gas control systems and fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for device handling and data interpretation.
- Adaptable to various tissue types with protocol modifications as supported by the source.
- Practical limitations include device fabrication complexity and the need for real-time oxygen verification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:59
Microfluidic Platform Fabrication
5:17
Microdispenser Setup
6:53
Isolation and Staining of Mouse Islets
8:25
Simultaneous Oxygen and Glucose Stimulations
9:19
Results: Intermittent Hypoxia Preconditioning Improves Islet Responses to Hypoxia
10:46
Conclusion
