Name: Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Leer hoe je microfluidische zuurstofmodulatie toepast op pancreas-eilandjes om preconditioneringseffecten te onderzoeken. Deze methode maakt real-time monitoring en nauwkeurige zuurstoflevering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416 (DTE) en Chicago Diabetes Project.

1. De muizeneilandjes voorbereiden
<ol>
	<li>Dissecteer C57BL/6-muizen en isoleer eilandjes door collageenase-digestie en scheiding op Ficoll-dichtheidsgradiënt. (Raadpleeg JOVE-artikelen vermeld in2,3).</li>
	<li>Incubeer eilandjes in RPMI-1640-medium bevattend 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 20 mM HEPES in petrischalen (37 °C, 5% CO2). Cultiveer de eilandjes 24 uur na isolatie voor gebruik in experimenten. Gebruik de eilandjes binnen 1-2 dagen om consistente resultaten te garanderen.</li>
</ol>
2. De Microfluidische Platform maken
<ol>
	<li>Genereer de microstructuren geometrieën op transparante fotomaskers voor elke apparaatlaag: 1) inlaat en uitlaat, 2) Glucose-microfluidische laag met perifusiekamer (8 mm diameter x 3 mm, 150 μl), 3) 200 μm membraan met microwellen (500 μm diameter, 100 μm diep), en 4) gas-microfluidische lagen.</li>
	<li>Om de inlaat- en uitlaatlaag te fabriceren, giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS tot een hoogte van 1,5 mm in een blanco petrischaal en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm.</li>
	<li>Om de glucose-microfluidische laag te fabriceren, draai twee lagen van 350 μm SU8-2150 om een enkele laag van 700 μm te vormen op een 4 inch siliconen wafer.
	<ol>
		<li>Blootstel UV-licht door de juiste fotomasker om het microkanaalpatroon over te brengen op de SU8 na ontwikkeling, waardoor een master van 700 μm hoog ontstaat.</li>
		<li>Giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master tot een hoogte van 3 mm en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Snijd deze PDMS met een scheermes in de gewenste vorm.</li>
		<li>Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm en de kamer met een diameter van 8 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Om de 200 μm membraan met microwellen te fabriceren, draai SU8-2100 tot 100 μm. Pas dezelfde UV-litografie toe om het microwellenpatroon over te brengen op deze master van 100 μm hoog.
	<ol>
		<li>Draai gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master bij 900 rpm gedurende 30 sec en laat 10 min uitharden bij 80 °C. Draai een tweede laag bovenop de eerste onder dezelfde omstandigheden, resulterend in een 200 μm PDMS-membraan met microwellenpatronen.</li>
		<li>Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm door dit membraan</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Om de gas-microfluidische laag te fabriceren, draai SU8-2100 tot 100 μm. Pas dezelfde UV-litografie toe om de gas-microfluidische patronen over te brengen op deze master van 100 μm hoog.
	<ol>
		<li>Giet gedegasseerde, voorgemengde PDMS op deze master tot een hoogte van 1,5 mm en laat 2 uur uitharden bij 80 °C. Snijd de PDMS met een scheermes in de gewenste vorm.</li>
		<li>Prik inlaat-/uitlaatpoorten met een diameter van 2 mm door deze laag</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Om de meerdere lagen te verbinden, bereid ze voor door ze schoon te maken met scotchtape, bloot te stellen aan een coronaboog en vervolgens met de hand te richten in de volgende volgorde.
	<ol>
		<li>Verbind het membraan met de onderste gaslaag met de microwellen naar boven.</li>
		<li>Verbind de glucose-microfluidische laag bovenop het membraan met microwellen.</li>
		<li>Verbind de inlaat- en uitlaatlaag bovenop het geheel, waardoor de hele assemblage wordt ingekapseld.</li>
		<li>Versterk de binding door er 1 kg gewicht bovenop te leggen en 3 uur te bakken bij 100 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test het voltooide apparaat op lekkage door water in de waterige laag te laden en het hele apparaat onder water te dompelen. Laat vervolgens lucht door de gaslaag stromen met een lege spuit.</li>
	<li>Steriliseer de lekvrije apparaten met 70% ethanol door de waterige laag en spoel daarna met PBS-buffer, waarin het apparaat bij 4 °C wordt bewaard tot gebruik.</li>
</ol>
3. Microdispenser Setup
<ol>
	<li>Verkrijg 2 microdispensers, 5 V en 20 V DC-voedingen en een digitale I/O-kaart om de zuurstofmix- en afleveringssetup te bouwen.
	<ol>
		<li>Verbind de besturingsleidingen van de microdispensers met de meegeleverde driver-eenheden.</li>
		<li>Verbind de drivers met de digitale I/O-kaart op poorten die overeenkomen met Labview-bediening.</li>
		<li>Verbind de 5 V en 20 V voedingen met de overeenkomstige contacten op de driver-eenheden.</li>
		<li>Verbind de digitale I/O met een laptop om Labview-codes voor gasregeling uit te voeren (bijlage).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verbind één microdispenser met stikstof en een andere met perslucht, beide met 5% CO2. Stel beide gassen in op 2 psi. Sluit de uitgangen van de dispensers aan in een T-splitsing voordat ze de microfluïdische apparaat binnenkomen.</li>
	<li>Gebruik een op lekkage geteste apparaat om de overgangsreactie van zuurstofmodulatie te karakteriseren door de microdispensers tussen 5-21% zuurstof te laten cyclussen, terwijl het opgeloste zuurstof in water wordt gemeten met een vezeloptische zuurstofsensor (zie materiaallijst en representatieve resultaten).</li>
</ol>
4. Opzetten bij de Microscopie
<ol>
	<li>Monteer het apparaat op de verwarmde stage op de omgekeerde microscoop.</li>
	<li

<ol><li>Lo, J. F., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Preconditioning+via+Multimodal+Microfluidic+Modulation+of+Intermittent+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+Collection+of+Pancreatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue.</a> J. Vis. Exp.. , e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pancreatic+Islet+Isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets.</a> J. Vis. Exp.. , e1343(2009).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Transplantation+in+Seven+Patients+with+Type+1+Diabetes+Mellitus+Using+a+Glucocorticoid-Free+Immunosuppressive+Regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen.</a> N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multi-Parametric+Islet+Perifusion+System+within+a+Microfluidic+Perifusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device.</a> J. Vis. Exp.. , e1649(2010).</li>
<li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
<li>Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Effects+Of+Intermittent+Hypoxia+In+Mice%3A+Steady+Versus+High+Frequency+Applied+Hypoxia+Daily+During+The+Rest+Period%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+-+Regu+Physiol%22%5BJournal%5D)">Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period.</a> AJP - Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+changes+in+glucose+and+insulin+regulation+during+intermittent+hypoxia+and+continuous+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia.</a> Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).</li>
<li>Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+aerobic+and+anaerobic+bacteria+and+mammalian+cells+with+a+microfluidic+differential+oxygenator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator.</a> Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).</li>
<li>Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+temporal+control+of+the+medium+gas+content+and+acidity+and+on-chip+generation+of+series+of+oxygen+concentrations+for+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures.</a> Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).</li>
<li>Mehta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+and+control+of+oxygen+levels+in+microfluidic+poly%28dimethylsiloxane%29+bioreactors+during+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture.</a> Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).</li>
<li>Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+integrated+microfluidic+platform+for+dynamic+oxygen+sensing+and+delivery+in+a+flowing+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium.</a> Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oxygen+gradients+in+microfluidic+devices+for+cell+culture+using+spatially+confined+chemical+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions.</a> Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).</li>
<li>Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+gradients+for+open+well+cellular+cultures+via+microfluidic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates.</a> Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meerdere modaliteiten geïntegreerd in deze eilandjehypoxietechniek presenteren verschillende punten die hier opgemerkt worden voor probleemoplossing. Ten eerste blijven de geïsoleerde eilandjes zich degraderen en desintegreren in cultuur vanwege spijsverteringsenzymen uit acinaire cellen. Het standaardiseren van experimenten tot 1-2 dagen na eilandje-isolatie is dus cruciaal om consistente resultaten te verkrijgen. Ten tweede werd de vloeistofstroom gestopt tijdens hypoxie en intermitterende hypoxie om convectief klar...

Dynamische hypoxie is belangrijk in de biologie, specifiek voor transplantaties Dynamische hypoxie is een belangrijke fysiologische en pathofysiologische parameter in vele biologische weefsels. Wijziging zuurstof, bijvoorbeeld een krachtige ontwikkeling signaal in angiogenese. Bovendien, ruimtelijke en temporele patronen in hypoxie moduleren HIF1-alfa en rollen in ziekten zoals pancreaskanker. Hypoxie is ook een verstorende factor die van invloed eilandje transplantatie uitkomsten. Onlangs, tijdelijk oscillaties van hypoxie, of intermitterende hypoxie (IH) hebben aangetoond voordelen in &quot;conditioneringscycli&quot; eilandjes 1. Echter, zowel statische als voorbijgaande hypoxie effecten op eilandje fysiologie moeten nog goed worden begrepen of bestudeerd, voornamelijk te wijten aan het ontbreken van passende hulpmiddelen voor micro eilandje te besturen. Eilandjes zijn goed gevasculariseerd in vivo Alvleesklier eilandjes zijn 50-400<html> 56, m bolvormige aggregaten van endocrine cellen, waaronder beta-cellen en alfa-cellen die verantwoordelijk zijn voor glucose homeostase zijn. Wanneer eilandjes worden blootgesteld aan stimulerende glucose in het bloed, opname en glycolyse leidt tot ATP productie, die ATP-gevoelige kaliumkanaal (KATP) kanalen en resulteert in calcium influx dat de exocytose van insuline korrels triggers opent. Zuurstof is belangrijk om dit zwaar stofwisseling rijden en insuline secretie significant beïnvloed door de dynamiek van de bloedstroom en zuurstof naast glucose gradiënten. Eilandjes Dit glucose-insulinerespons gemakkelijk uitvoeren vivo ze zijn zeer geperfundeerd in de alvleesklier, ieder binnen een cel lengte van een capillair vat. Echter, de dicht netwerk van capillairen intraislet verwijderd door collagenase gedurende eilandje isolatie 2,3. Bijgevolg worden zowel zuurstof en voedingsstoffen levert beperkt tot een 100 urn omtrek door diffusie beperkingen. stap &quot;&gt; De huidige technieken hebben beperkt succes in het herscheppen van eilandje micromilieu Inheemse zuurstof en glucose dynamiek, de sleutel tot het modelleren van fysiologische en pathofysiologische omstandigheden recreëren eilandje is, is moeilijk te bereiken met standaard hypoxische kamers die uitgebreide stroom nodig hebben en gebrek aan continue monitoring van eilandje functies. Bovendien transplantatie therapie voor type I diabetes geïsoleerde eilandjes blootstellen aan hypoxie in het hepatische portaalsysteem 4 die veel lager pO 2 (&lt;2%, 5-15 mmHg) heeft vergeleken met fysiologische pancreas (5.6%, 40 mmHg). Na de transplantatie, het eilandje enten neem twee weken of meer te gerevasculariseerd. Het is aangetoond dat hypoxische blootstelling schaadt glucose-insuline koppelingsmechanisme eilandje&#39;s. Onder de stimulus-secretie koppeling factoren, calcium signalering, mitochondriale potentials, en insuline kinetiek kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van microfluidics. Onze vorige microfluïdische techniek gedemonstreerd deze real-time monitoring met nauwkeurige modulatie van de waterige micro-omgeving rond enkele eilandje 5,6. Echter, kwantificering van hypoxische bijzondere eilandje wordt gehinderd door het ontbreken van gelijktijdige stimulatie en controle technieken. Daarom combineren microfluïdische controle van zuurstof en eilandje monitoring kan eilandje hypoxie studies te verbeteren. Microfluidics kan recreëren en moduleren de waterige en zuurstof micromilieu De standaardtechniek voor weefsel-kweek en hypoxie is gebaseerd op hypoxische kamers. In het algemeen, de hypoxische kamers bieden enkele zuurstofconcentraties met verevening keer in ~ 10-30 min, onverenigbaar met minuten opgeschaald dynamische hypoxie. Twee recente studies gebruikten kleine aangepaste kamers voor intermitterende hypoxie blootstelling op de hele muizen, met tegenstrijdige resultaten op glucose geïnduceerde insuline respons 7,8. Houd in gedachten dat op het gehele dier niveau, de ingeademde zuurstof niet direct trangepland om capillaire eilandje pO 2, als gevolg van controles in de luchtwegen. Bovendien hebben deze studies niet gestandaardiseerd zuurstofgehalte, noch hebben zij real-time maatregelen op het weefsel niveau van de eilandjes. Aan de andere kant, kan zuurstof microfluidics deze beperkingen overtreffen door het beheersen van zuurstof via gas kanaal netwerken. Bovendien microfluidics is compatibel met live-imaging tijdens zuurstof modulatie, een prestatie moment niet mogelijk met standaard hypoxische kamers. Een aantal van deze nieuwe microfluidics benadert gebruik maken van de gas-doorlaatbaarheid van polydimethylsiloxane aan zuurstofconcentraties lossen in microkanalen die media stromen over doelcellen 9-14. Deze apparaten zijn ook geïntegreerd meerdere discrete zuurstofconcentraties, fluorescentie gebaseerde zuurstof sensoren, en zelfs chemisch zuurstof generatie on-chip. Liquid-solvation gebaseerd microfluidics hebben een harde tijd het behoud van stabiele, continue gradiënten zoals ikt afhankelijk convectief mengen dat gevoelig is stromingsomstandigheden. Ter vergelijking: de techniek die we hier gebruiken richt zich op het verminderen van de verspreiding pad van zuurstof levering. Het gas solvatie en afschuifstroming worden geëlimineerd door direct te diffunderen zuurstof door een membraan bezaaid met cellen of weefsels eilandje. Dit verwijdert de extra microfluidics nodig om solvatie controle en voorkomt onnodige shear stress op de eilandjes, die zelf de afgifte van insuline kan leiden. Dit platform is gebruikt om reactieve zuurstof species (ROS) tonen opregulatie zowel hyperoxic en hypoxische extremen (2-97% O 2) in celkweek 1,15. Vanwege de directe levering van zuurstof en de verwijdering van schuifstroom onze-diffusie ondersteunde platform de optimale microfluïdische oplossing voor het bestuderen eilandje hypoxie. Multimodaal stimulatie en monitoring -Diffusie ondersteunde microfluidics brengt ook extra voordelen wanneer aangepast voor het bestuderen eilandje microphysiology. Door een membraan als een diffusiebarrière, kan de vloeistof worden geïsoleerd van de zuurstof modulaties, zodat controles waterige glucose stimulations onafhankelijk van hypoxische stimulaties. Dit creëert een sandwich-achtige simultane stimulatie die ruimtelijk pin-punten levering aan de eilandjes. Bovendien, als het gas wordt tijdelijk gemoduleerd via geautomatiseerde microinjectors, kunnen we de zuurstofconcentratie moduleren 21-0% digitaal met voorbijgaande tijd minder dan 60 sec. De dynamische elementen van zuurstof en glucose micromilieu in de microscoop mogelijk een real-time multimodale protocol dat onmogelijk of buitengewoon omslachtig zou zijn met standaard hypoxische kamers. Met behulp van dit apparaat, werden calcium signalering (Fura-AM), mitochondriale potentials (Rhodamine 123), en insuline kinetiek (ELISA) gecontroleerd om een ​​compleet beeld van de dynamische glucose-insuline respons onder hypoxie bieden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Laurell</td><td>WS-400</td><td></td></tr><tr><td>SU8</td><td>MicroChem</td><td>SU8-2150/SU8-2100</td><td></td></tr><tr><td>Digitaal verwarmingsplaat</td><td>PMC Dataplate</td><td>722A</td><td></td></tr><tr><td>UV-uithardingslamp</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td></td></tr><tr><td>PMDS</td><td>Dow Chemical</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Corona-wand</td><td>ETP</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumkamer</td><td>Bel-Art</td><td>420220000</td><td></td></tr><tr><td>Microdispensers</td><td>The Lee Company</td><td>IKTX0322000A</td><td></td></tr><tr><td>5 V en 20 V DC-voeding</td><td>Radio Shack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI USB</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td>Gilson</td><td>Minipulse 2</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofsensor</td><td>Ocean Optics</td><td>NeoFox</td><td></td></tr><tr><td>Fractiecollector</td><td>Gilson</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>Finnpipette II 100&mu;l</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde epifluorescentiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>DMI 4000B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml kegelbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 fluorescentiekleurstof</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123 fluorescentiekleurstof</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kweekmedium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RPMI-1640</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rundseraserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 inch siliconen slangen</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inch x 1/8 inch</td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorfbuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inch en 4 mm</td></tr><tr><td>Spuitconnectoren</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>vrouwelijke Luer-plug 1/16 inch</td></tr><tr><td>Rechte connectoren</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inch</td></tr><tr><td>Bochtconnector</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 inch</td></tr></tbody></table>

kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof micromilieu bij de single islet niveau

Quantitative and Temporal Control of Oxygen Microenvironment at the Single Islet Level

Gelijktijdige zuurstof en controle van de glucose stimulus-secretie koppeling factoren in een enkele techniek is van cruciaal belang voor het modelleren van pathofysiologische staten van eilandje hypoxie, vooral bij transplantatiepatiënten omgevingen. Standaard hypoxische kamer technieken kunnen niet beide stimulaties moduleren tegelijkertijd noch bieden real-time monitoring van glucose stimulus-secretie koppeling factoren. Om deze problemen aan te pakken, pasten wij een meerlagig microfluïdische techniek om zowel waterige als gasfase modulaties integreren via een diffusiemembraan. Dit zorgt voor een stimulatie sandwich rond de microscaled eilandjes binnen de transparante polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat, waardoor monitoring van de genoemde koppeling factoren via fluorescentie microscopie. Bovendien is de gasinvoer gecontroleerd door een paar microdispensers, die kwantitatieve sub minuten modulaties zuurstof tussen 0-21%. Deze intermitterende hypoxie wordt toegepast op een nieuw fenomeen eiland onderzoekent preconditionering. Bovendien, gewapend met multimodale microscopie, waren we in staat om te kijken naar gedetailleerde calcium en K ATP-kanaal dynamiek tijdens deze hypoxie. We zien microfluïdische hypoxie, vooral deze simultane dual fase techniek, als een waardevol instrument bij het ​​bestuderen eilandjes evenals vele ex vivo weefsels.

Centraal in deze techniek voor islet-hypoxie is het vermogen om stimulatie van de waterige en gasvormige fase in dezelfde microfluïdische kamer te moduleren met transiënten op minuut-schaal. Figuur 1 toont een representatief resultaat van de a) dubbele stimulaties en b) snelle modulaties gemeten binnen de islet-kamer. De waterige modulatie, aangetoond door de introductie van fluoresceïne in de kamer, bereikt een evenwicht na drie tot vier minuten mengen. Bovendien kan zuurstof met snelle transiënten word...

Microfluïdische zuurstofcontrole biedt meer dan alleen gemak en snelheid ten opzichte van hypoxische kamers voor biologische experimenten. Vooral wanneer geïmplementeerd via diffusie door een membraan, kan microfluïdische zuurstof gelijktijdige vloeistof- en gasfase-modulaties op microschaalniveau bieden. Deze techniek maakt dynamische multi-parametrische experimenten mogelijk, die cruciaal zijn voor het bestuderen van eilandjespathofysiologie.

Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

Simultaneous oxygenation and monitoring of glucose stimulus-secretion coupling factors in a single technique is critical for modeling pathophysiological ...

Het algemene doel van deze procedure is om intermitterende hypoxie op minuten-schaal toe te passen op pancreas-eilandjes op microschaal om preconditioneringseffecten te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een multimodaal microfluïdisch apparaat te vervaardigen met een dun, gasdoorlaatbaar membraan. De tweede stap is het creëren van een gecomputeriseerd systeem voor zuurstofmodulatie.Vervolgens worden de oogstaven voorzichtig in het apparaat geladen, waarna de microfluidica voor vloeistof en zuurstof worden aangesloten. De laatste stap is het coördineren van de microscopie met de multimodale microfluidica om de parameters van de oogstaven te visualiseren die tijdens de zuurstofmodulatie veranderen. Uiteindelijk wordt de techniek van intermitterende hypoxie bij de oogstaven gebruikt om aan te tonen dat de glucoserespons bij hypoxie duidelijk is verslechterd.Hoewel temporele modulaties van hypoxie oogleden kunnen trainen om met minder beperkingen te reageren, is het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals opgeloste zuurstof of het gebruik van een hypoxische kamer, dat een nauwkeurige zuurstofconcentratie aan de oogleden kan worden toegediend in snelle, minuscule tijdsintervallen zonder schuifspanning door complexe stromingen.Het maakt daarnaast realtime monitoring mogelijk met behulp van vloer- en microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van allotransplantatie, zoals het definiëren van hypoxische beperkingen op transplantatieplaatsen of preconditioneringsregimes om de resultaten van transplantaties te verbeteren. Deze methode kan dus inzicht bieden in allogene hypoxie.Het kan ook worden toegepast op andere weefsels en systemen, zoals het centrale zenuwstelsel, hartweefsels, de nier en andere transplantatieorganen. Een videodemonstratie van deze methode is essentieel, aangezien veel aspecten van de fabricage van het apparaat en het hanteren van de oogjes complex zijn. De stappen zijn moeilijk te leren vanwege het innovatieve interdisciplinaire karakter van de techniek, maar worden beheersbaar zodra men ermee vertrouwd is. Begin met het fabriceren van de deklaag van het microfluïdische apparaat.Om dit te bereiken, giet u vooraf gemengde PDMS in een lege petrischaal tot een hoogte van 1,5 millimeter en laat u dit twee uur uitharden bij 80 °C. Fabricage vervolgens de glucose-microfluïdische laag met de master voor de perfusiekamer door twee lagen SU 8 21 50 van 350 micron dik via spin-coating aan te brengen, om zo een enkele laag van 700 micron op een vier inch siliciumwafer te vormen. Stel deze vervolgens bloot aan UV-licht met behulp van het fotomasker voor de glucose-microfluïdische laag om het microkanaalpatroon over te dragen op de SU 8-laag.Spoel het niet-belichte gebied af met SU-8 ontwikkelaar. Giet vervolgens de vooraf gemengde PDMS van DGA op de MA tot een hoogte van 3 mm en hard uit bij 80 °C gedurende twee uur. Snijd na uitharding de glucose-microfluïdische laag op maat en gebruik een pons van 2 mm voor het maken van de in- en uitlaatpoorten, en een pons met een diameter van 8 mm voor de hoofdkamer.Fabriceer vervolgens de microwell-master voor immobilisatie van het ooglid door een laag SU 8 2100 van 100 micron dik op een schone siliconen wafer van vier inch aan te brengen via spincoating, en gebruik vervolgens UV-lithografie om het microwell-patroon op deze laag over te brengen. Spoel de niet-belichte gebieden weg met ontwikkelaar zodra de microwell-master voltooid is. Voeg twee lagen PDMS van 100 micron toe door spincoating op 900 RPM gedurende 30 seconden, gevolgd door uitharding gedurende 10 minuten bij 80 °C om elke laag te produceren.Zodra dit voltooid is, pons je de in- en uitlaatpoorten met een diameter van twee millimeter. Fabriceren vervolgens de gasmicrofluïdische master door SU 8 2100 tot een dikte van 100 microns te spinnen, zoals bij de vorige laag, en breng de gasmicrofluïdische patronen opnieuw over met behulp van UV-lithografie. Spoel het niet-belichte gebied weg met developer.Giet vervolgens een PDMS-laag van 1,5 millimeter dik op de gas-microfluidische master en harden deze uit bij 80 °C gedurende twee uur. Snijd daarna het PDMS met het scheermes in de juiste vorm. Pons vervolgens inlaat- en uitlaatpoorten van twee millimeter diameter in de deklaag, zodat deze uitlijnen met de posities op de andere lagen om de meerdere lagen met elkaar te verbinden.Bereid ze eerst voor door de oppervlakken te reinigen met plakband, ze bloot te stellen aan een corona-ontlading en vervolgens de lagen handmatig in de volgende volgorde uit te lijnen. Bond eerst het membraan aan de onderste gaslaag met de microwells naar boven gericht. Bond vervolgens de glucose-microfluïdische laag bovenop het microwell-membraan.Hecht tenslotte de inlaat- en uitlaatlaag aan de bovenkant, zodat de gehele assemblage wordt ingekapseld. Zorg voor een stevige verbinding door een gewicht van één kilogram bovenop de assemblage te plaatsen en deze drie uur lang te bakken bij 100 °C. Controleer vervolgens op lekken.Test het apparaat door water in de waterige laag te laden, het apparaat onder te dompelen en met de spuit lucht door de gaslaag te laten stromen terwijl u controleert op lekken. Steriliseer vervolgens de lekvrije apparaten door gedurende één tot twee minuten 70% ethanol door de waterige laag te laten stromen. Stel de microdispensers in door eerst de aansturingskabels van de microdispensers aan te sluiten op de meegeleverde driver-eenheden.Sluit vervolgens de drivers aan op de digitale IO-kaart via de poorten die overeenkomen met hun LabVIEW-besturingselementen. Sluit daarna DC-voedingsbronnen van 5 volt en 20 volt aan op de overeenkomstige contactpunten van de aansturingseenheden en verbind de digitale IO met een laptop om de LabVIEW-codes voor gasregeling uit te voeren, zoals beschreven in de bijlage van het bijbehorende tekstprotocol. Sluit vervolgens één microdispenser aan op stikstof en de andere op perslucht, beide met een concentratie van 5% koolstofdioxide, en stel beide gassen in op 2 PSI. Verbind de uitgangen van de dispensers in een T-stuk voordat ze het microfluïdische apparaat binnengaan.Monteer vervolgens het apparaat op de verwarmde tafel van een omgekeerde microscoop, waarbij 0% en 21% zuurstof aan het apparaat zijn gekoppeld. Plaats daarna een glasvezelzuurstofsensor bij de vloeistofuitlaat van het apparaat om de opgeloste zuurstof in de uitlaat in realtime te meten. Sluit het apparaat vervolgens aan op een peristaltische pomp en laat water met een snelheid van 250 microliters per minuut door het apparaat stromen.Karakteriseer de transiënte respons van zuurstofmodulatie door de microdispensers te laten cyclen tussen 5% en 21% zuurstof. Sluit een peristaltische pomp aan op het microfluïdische apparaat en plaats de slang op een warmteplaat van 37 °C om de vloeistof op te warmen voordat deze het microfluïdische apparaat binnengaat. Verbind daarnaast de uitlaatpoort van de glucose-microfluïdica met een fractiecollector om te beginnen. Dissecteer C 57 black six muizen en isoleer pancreaseilandjes via collagenase-digestie en Fccal-dichtheidsgradiëntseparatie, zoals beschreven in de volgende video's die beschikbaar zijn bij JoVE, zodra deze geïsoleerd zijn.Incubeer de oogjes in RPMI 1640-medium met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 20 millimol HEPES in petrischalen gedurende 24 tot 48 uur. Gebruik de oogjes binnen twee dagen om consistente resultaten te garanderen. Bereid vervolgens verse Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, met één oplossing die 2 millimol glucose bevat en een andere die 14 millimol glucose bevat.Warm de oplossingen in conische buizen van 50 milliliter op door deze in een waterbad van 37 °C te plaatsen. Bereid vervolgens de kleurstof voor de geïsoleerde oogbollen door vijf micromolar 4:02 AM en DMSO en 2,5 micromolar RH 1 23 en 100% ethanol toe te voegen aan twee milliliters Krebs-buffer met twee millimolar glucose. Neem vervolgens de oogbollen op met een pipet van 10 µL en incubeer deze gedurende 30 minuten in de kleurstof bij 37 °C.Laad na het kleuren ongeveer 20 oogjes in het apparaat via de inlaat van het glucose-microkanaal. Leid de oogjes naar de kamer door buffer van de uitlaat terug naar de inlaat te pompen. Perfuseer vervolgens de oogjes en de buffer gedurende 10 minuten om overtollige kleurstoffen weg te wassen.Laat eerst gedurende vijf minuten een twee millimolaire Krebs-Ringer-bicarbonaatbuffer door het systeem stromen om een normale baseline-puls vast te stellen. Stimuleer vervolgens de kamer gedurende 15 minuten met de 14 millimolaire glucosebuffer, gevolgd door een wasbeurt van 15 minuten met de twee millimolaire glucosebuffer. Registreer tijdens dit proces de emissie bij 510 nanometer door excitatie bij 340 nanometer en 380 nanometer.Registreer daarnaast de 530-emissie van RH 1 23 door de kleurstof te exciteren bij 480 nanometers. Om convectieve verstoringen tijdens de zuurstofmodulatie te minimaliseren, dient er tijdens de stimulatie- en wasstappen een bufferstroom te worden toegepast; zorg ervoor dat de stroom tijdens de overige teststappen wordt gestopt. Verzamel het effluïum uit de glucose-uitlaat met intervallen van één minuut voor gebruik in aanvullende analyses met de in deze video getoonde microfluïdische benadering; het is mogelijk om het percentage zuurstof dat langs het dunne PDMS-membraan stroomt, snel te reguleren met behulp van de computergestuurde micro-injectoren.Hier is een voorbeeld van deze modulatie variërend van één tot zes minuten. Het is ook mogelijk om kwantitatieve modulaties van zuurstof van minder dan een minuut te leveren, tussen 2 en 8,5 parts per million, door zuurstof tussen 5% en 21% toe te dienen. De blauwe lijn toont het percentage toegediend zuurstof en groen is de resulterende opgeloste zuurstof in parts per million. Wanneer deze cycli worden toegepast om intermitterende hypoxie bij de eyelets te creëren, kunnen de voordelen van preconditioning van eyelets tegen hypoxie worden waargenomen in vergelijking met een onregelmatige normoxische puls door te kijken naar de verbeterde for ratio na de behandeling. De effecten van hypoxie en intermitterende hypoxie kunnen worden waargenomen in de overshoot en demping van de oscillatie van calciumtransiënten, zoals hier getoond; in blauw is de normoxische respons weergegeven.In het rood is de hypoxische respons te zien, en de groene lijn is de geconditioneerde hypoxische respons. De metingen van calcium, mitochondriaal potentiaal en insuline worden hier getoond. Dit zijn de resultaten van real-time fluorescentiemicroscopie en een off-chip ELISA-assay gebruikmakend van de microfluïdische effluent van het systeem; samen beginnen deze een multimodale weergave te vormen van de glucose-insulinerespons tijdens een hypoxische transient.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd: één dag voor de fabricage van het apparaat en het isoleren van de ooglidcellen, en één dag voor de ooglidexperimenten zelf. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de geleverde zuurstofconcentratie te verifiëren door de gasator van het apparaat te koppelen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de foetale uitgang en andere weefselmicrofysiologie om te onderzoeken hoe hypoxie en tijdelijke zuurstofpatronen ziekten zoals diabetes, cardiovasculaire en neurologische aandoeningen kunnen beïnvloeden.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de zuurstofmodulatie kunt beheersen, micro-weefsels kunt manipuleren en reproduceerbare, betekenisvolle metingen van weefselhypoxie kunt genereren met behulp van multimodale microfluïdische apparaten.

quantitative-temporal-control-oxygen-microenvironment-at-single-islet

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen.

Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van hoogwaardige, grootschalige transcriptome gegevens van afzonderlijke cellen van geïsoleerde menselijke alvleesklier eilandjes met behulp van een druppel-gebaseerde microfluïdische single-cell RNA sequencing technologie.

Eencellige RNA-sequencing en analyse van menselijke pancreatic eilandjes

Dit protocol demonstreert de nauwkeurige en reproduceerbare meting van het zuurstofverbruik in niet-humane primaat alvleesklier eilandjes. De laad technieken van het eilandje en de coating van de microplaat bieden een kader voor een efficiënte meting van de ademhaling in andere soorten gekweekte spheroids.

Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Hier geven we details over het uitvoeren van glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) via perfusie door het vaatstelsel van de muizen met een intacte alvleesklier als een aanvullende techniek om de endocriene pancreasfunctie te beoordelen met vermindering van mogelijke confounders.

Glucose-gestimuleerde insulinesecretie via perfusie door het vaatstelsel van muizen met een intacte alvleesklier

Dit protocol presenteert een methode voor het vervaardigen van een dubbellaagse microfluïdische chip en het analyseren van microbiële groei onder snelle zuurstofoscillaties. De prestaties van het apparaat werden gevalideerd door middel van zuurstofdetectie in vloeistofkanalen en microbiële teelt.

Het creëren van snelle zuurstofoscillaties in microbiële eencellige groeianalyse met behulp van een microfluïdisch dubbellaags apparaat

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer hoe je microfluidische zuurstofmodulatie toepast op pancreas-eilandjes om preconditioneringseffecten te onderzoeken. Deze methode maakt real-time monitoring en nauwkeurige zuurstoflevering mogelijk.

Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

Meer video's verkennen