Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau

Het algemene doel van deze procedure is om intermitterende hypoxie op minuten-schaal toe te passen op pancreas-eilandjes op microschaal om preconditioneringseffecten te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst een multimodaal microfluïdisch apparaat te vervaardigen met een dun, gasdoorlaatbaar membraan. De tweede stap is het creëren van een gecomputeriseerd systeem voor zuurstofmodulatie.

Vervolgens worden de oogstaven voorzichtig in het apparaat geladen, waarna de microfluidica voor vloeistof en zuurstof worden aangesloten. De laatste stap is het coördineren van de microscopie met de multimodale microfluidica om de parameters van de oogstaven te visualiseren die tijdens de zuurstofmodulatie veranderen. Uiteindelijk wordt de techniek van intermitterende hypoxie bij de oogstaven gebruikt om aan te tonen dat de glucoserespons bij hypoxie duidelijk is verslechterd.

Hoewel temporele modulaties van hypoxie oogleden kunnen trainen om met minder beperkingen te reageren, is het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals opgeloste zuurstof of het gebruik van een hypoxische kamer, dat een nauwkeurige zuurstofconcentratie aan de oogleden kan worden toegediend in snelle, minuscule tijdsintervallen zonder schuifspanning door complexe stromingen.

Het maakt daarnaast realtime monitoring mogelijk met behulp van vloer- en microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van allotransplantatie, zoals het definiëren van hypoxische beperkingen op transplantatieplaatsen of preconditioneringsregimes om de resultaten van transplantaties te verbeteren. Deze methode kan dus inzicht bieden in allogene hypoxie.

Het kan ook worden toegepast op andere weefsels en systemen, zoals het centrale zenuwstelsel, hartweefsels, de nier en andere transplantatieorganen. Een videodemonstratie van deze methode is essentieel, aangezien veel aspecten van de fabricage van het apparaat en het hanteren van de oogjes complex zijn. De stappen zijn moeilijk te leren vanwege het innovatieve interdisciplinaire karakter van de techniek, maar worden beheersbaar zodra men ermee vertrouwd is. Begin met het fabriceren van de deklaag van het microfluïdische apparaat.

Om dit te bereiken, giet u vooraf gemengde PDMS in een lege petrischaal tot een hoogte van 1,5 millimeter en laat u dit twee uur uitharden bij 80 °C. Fabricage vervolgens de glucose-microfluïdische laag met de master voor de perfusiekamer door twee lagen SU 8 21 50 van 350 micron dik via spin-coating aan te brengen, om zo een enkele laag van 700 micron op een vier inch siliciumwafer te vormen. Stel deze vervolgens bloot aan UV-licht met behulp van het fotomasker voor de glucose-microfluïdische laag om het microkanaalpatroon over te dragen op de SU 8-laag.

Spoel het niet-belichte gebied af met SU-8 ontwikkelaar. Giet vervolgens de vooraf gemengde PDMS van DGA op de MA tot een hoogte van 3 mm en hard uit bij 80 °C gedurende twee uur. Snijd na uitharding de glucose-microfluïdische laag op maat en gebruik een pons van 2 mm voor het maken van de in- en uitlaatpoorten, en een pons met een diameter van 8 mm voor de hoofdkamer.

Fabriceer vervolgens de microwell-master voor immobilisatie van het ooglid door een laag SU 8 2100 van 100 micron dik op een schone siliconen wafer van vier inch aan te brengen via spincoating, en gebruik vervolgens UV-lithografie om het microwell-patroon op deze laag over te brengen. Spoel de niet-belichte gebieden weg met ontwikkelaar zodra de microwell-master voltooid is. Voeg twee lagen PDMS van 100 micron toe door spincoating op 900 RPM gedurende 30 seconden, gevolgd door uitharding gedurende 10 minuten bij 80 °C om elke laag te produceren.

Zodra dit voltooid is, pons je de in- en uitlaatpoorten met een diameter van twee millimeter. Fabriceren vervolgens de gasmicrofluïdische master door SU 8 2100 tot een dikte van 100 microns te spinnen, zoals bij de vorige laag, en breng de gasmicrofluïdische patronen opnieuw over met behulp van UV-lithografie. Spoel het niet-belichte gebied weg met developer.

Giet vervolgens een PDMS-laag van 1,5 millimeter dik op de gas-microfluidische master en harden deze uit bij 80 °C gedurende twee uur. Snijd daarna het PDMS met het scheermes in de juiste vorm. Pons vervolgens inlaat- en uitlaatpoorten van twee millimeter diameter in de deklaag, zodat deze uitlijnen met de posities op de andere lagen om de meerdere lagen met elkaar te verbinden.

Bereid ze eerst voor door de oppervlakken te reinigen met plakband, ze bloot te stellen aan een corona-ontlading en vervolgens de lagen handmatig in de volgende volgorde uit te lijnen. Bond eerst het membraan aan de onderste gaslaag met de microwells naar boven gericht. Bond vervolgens de glucose-microfluïdische laag bovenop het microwell-membraan.

Hecht tenslotte de inlaat- en uitlaatlaag aan de bovenkant, zodat de gehele assemblage wordt ingekapseld. Zorg voor een stevige verbinding door een gewicht van één kilogram bovenop de assemblage te plaatsen en deze drie uur lang te bakken bij 100 °C. Controleer vervolgens op lekken.

Test het apparaat door water in de waterige laag te laden, het apparaat onder te dompelen en met de spuit lucht door de gaslaag te laten stromen terwijl u controleert op lekken. Steriliseer vervolgens de lekvrije apparaten door gedurende één tot twee minuten 70% ethanol door de waterige laag te laten stromen. Stel de microdispensers in door eerst de aansturingskabels van de microdispensers aan te sluiten op de meegeleverde driver-eenheden.

Sluit vervolgens de drivers aan op de digitale IO-kaart via de poorten die overeenkomen met hun LabVIEW-besturingselementen. Sluit daarna DC-voedingsbronnen van 5 volt en 20 volt aan op de overeenkomstige contactpunten van de aansturingseenheden en verbind de digitale IO met een laptop om de LabVIEW-codes voor gasregeling uit te voeren, zoals beschreven in de bijlage van het bijbehorende tekstprotocol. Sluit vervolgens één microdispenser aan op stikstof en de andere op perslucht, beide met een concentratie van 5% koolstofdioxide, en stel beide gassen in op 2 PSI. Verbind de uitgangen van de dispensers in een T-stuk voordat ze het microfluïdische apparaat binnengaan.

Monteer vervolgens het apparaat op de verwarmde tafel van een omgekeerde microscoop, waarbij 0% en 21% zuurstof aan het apparaat zijn gekoppeld. Plaats daarna een glasvezelzuurstofsensor bij de vloeistofuitlaat van het apparaat om de opgeloste zuurstof in de uitlaat in realtime te meten. Sluit het apparaat vervolgens aan op een peristaltische pomp en laat water met een snelheid van 250 microliters per minuut door het apparaat stromen.

Karakteriseer de transiënte respons van zuurstofmodulatie door de microdispensers te laten cyclen tussen 5% en 21% zuurstof. Sluit een peristaltische pomp aan op het microfluïdische apparaat en plaats de slang op een warmteplaat van 37 °C om de vloeistof op te warmen voordat deze het microfluïdische apparaat binnengaat. Verbind daarnaast de uitlaatpoort van de glucose-microfluïdica met een fractiecollector om te beginnen. Dissecteer C 57 black six muizen en isoleer pancreaseilandjes via collagenase-digestie en Fccal-dichtheidsgradiëntseparatie, zoals beschreven in de volgende video's die beschikbaar zijn bij JoVE, zodra deze geïsoleerd zijn.

Incubeer de oogjes in RPMI 1640-medium met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 20 millimol HEPES in petrischalen gedurende 24 tot 48 uur. Gebruik de oogjes binnen twee dagen om consistente resultaten te garanderen. Bereid vervolgens verse Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, met één oplossing die 2 millimol glucose bevat en een andere die 14 millimol glucose bevat.

Warm de oplossingen in conische buizen van 50 milliliter op door deze in een waterbad van 37 °C te plaatsen. Bereid vervolgens de kleurstof voor de geïsoleerde oogbollen door vijf micromolar 4:02 AM en DMSO en 2,5 micromolar RH 1 23 en 100% ethanol toe te voegen aan twee milliliters Krebs-buffer met twee millimolar glucose. Neem vervolgens de oogbollen op met een pipet van 10 µL en incubeer deze gedurende 30 minuten in de kleurstof bij 37 °C.

Laad na het kleuren ongeveer 20 oogjes in het apparaat via de inlaat van het glucose-microkanaal. Leid de oogjes naar de kamer door buffer van de uitlaat terug naar de inlaat te pompen. Perfuseer vervolgens de oogjes en de buffer gedurende 10 minuten om overtollige kleurstoffen weg te wassen.

Laat eerst gedurende vijf minuten een twee millimolaire Krebs-Ringer-bicarbonaatbuffer door het systeem stromen om een normale baseline-puls vast te stellen. Stimuleer vervolgens de kamer gedurende 15 minuten met de 14 millimolaire glucosebuffer, gevolgd door een wasbeurt van 15 minuten met de twee millimolaire glucosebuffer. Registreer tijdens dit proces de emissie bij 510 nanometer door excitatie bij 340 nanometer en 380 nanometer.

Registreer daarnaast de 530-emissie van RH 1 23 door de kleurstof te exciteren bij 480 nanometers. Om convectieve verstoringen tijdens de zuurstofmodulatie te minimaliseren, dient er tijdens de stimulatie- en wasstappen een bufferstroom te worden toegepast; zorg ervoor dat de stroom tijdens de overige teststappen wordt gestopt. Verzamel het effluïum uit de glucose-uitlaat met intervallen van één minuut voor gebruik in aanvullende analyses met de in deze video getoonde microfluïdische benadering; het is mogelijk om het percentage zuurstof dat langs het dunne PDMS-membraan stroomt, snel te reguleren met behulp van de computergestuurde micro-injectoren.

Hier is een voorbeeld van deze modulatie variërend van één tot zes minuten. Het is ook mogelijk om kwantitatieve modulaties van zuurstof van minder dan een minuut te leveren, tussen 2 en 8,5 parts per million, door zuurstof tussen 5% en 21% toe te dienen. De blauwe lijn toont het percentage toegediend zuurstof en groen is de resulterende opgeloste zuurstof in parts per million. Wanneer deze cycli worden toegepast om intermitterende hypoxie bij de eyelets te creëren, kunnen de voordelen van preconditioning van eyelets tegen hypoxie worden waargenomen in vergelijking met een onregelmatige normoxische puls door te kijken naar de verbeterde for ratio na de behandeling. De effecten van hypoxie en intermitterende hypoxie kunnen worden waargenomen in de overshoot en demping van de oscillatie van calciumtransiënten, zoals hier getoond; in blauw is de normoxische respons weergegeven.

In het rood is de hypoxische respons te zien, en de groene lijn is de geconditioneerde hypoxische respons. De metingen van calcium, mitochondriaal potentiaal en insuline worden hier getoond. Dit zijn de resultaten van real-time fluorescentiemicroscopie en een off-chip ELISA-assay gebruikmakend van de microfluïdische effluent van het systeem; samen beginnen deze een multimodale weergave te vormen van de glucose-insulinerespons tijdens een hypoxische transient.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd: één dag voor de fabricage van het apparaat en het isoleren van de ooglidcellen, en één dag voor de ooglidexperimenten zelf. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de geleverde zuurstofconcentratie te verifiëren door de gasator van het apparaat te koppelen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in de foetale uitgang en andere weefselmicrofysiologie om te onderzoeken hoe hypoxie en tijdelijke zuurstofpatronen ziekten zoals diabetes, cardiovasculaire en neurologische aandoeningen kunnen beïnvloeden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de zuurstofmodulatie kunt beheersen, micro-weefsels kunt manipuleren en reproduceerbare, betekenisvolle metingen van weefselhypoxie kunt genereren met behulp van multimodale microfluïdische apparaten.