Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om single cel lysaten te analyseren met behulp van fluorescentie- of immunoassays. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch apparaat te maken en de binnenkamer te coaten met antilichamen. Vervolgens worden enkele cellen geïmmobiliseerd in de vallen en worden ze in een tweede stap blootgesteld aan verschillende reagentia om een cellulaire respons te stimuleren.

Een ringvormige klep wordt snel gesloten en lysisbuffer wordt door het apparaat geleid. De ringvormige klep wordt geopend voor een korte tijd en de cellen worden gelyseerd in de microkamer, waardoor vrijgekomen eiwitten kunnen binden aan de antilichamen in een hoge concentratie vanwege het kleine volume. Vervolgens wordt de ringvormige klep geopend.

De kamer wordt gewassen en detectie reagentia worden geïntroduceerd in de gesloten microkamer. De toename van fluorescentie-intensiteit wordt in de loop van de tijd gemonitord met behulp van een fluorescentiemicroscoop, de resultaten demonstreren de mogelijkheid van dit systeem om op een kwantitatieve en betrouwbare manier een analyt van belang te detecteren dat vrijkomt uit individuele cellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van single A-cel analyse.

In het bijzonder zijn er systematische onderzoeken naar de cellulaire respons op variaties in de chemische omgeving. We kunnen up- of downregulatie van intracellulaire moleculen zien als resultaat van de chemische stimulus. Er zijn twee belangrijke voordelen van deze techniek.

De eerste is dat we de geïmmobiliseerde cellen kunnen blootstellen aan een gedefinieerde chemische omgeving die constant of periodiek veranderend is. Ten tweede kunnen we een zeer gevoelige en specifieke analyse van de toestand herstellen zonder enige kruisbesmetting of verlies van analyten als gevolg van transport. Om te beginnen, fabriceer de drie verschillende SU acht masterwafers zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Een zal worden gebruikt om de vloeistoflaag te creëren, een voor de controlelaag en een derde voor de micro contact stempel. Vervolgens fabriceert u de microfluïdische chips, beginnend met de bereiding van een 10 tot 1 mengsel van PDMS en een verhardingsmiddel. Meng beide delen krachtig en ontgast de oplossing gedurende 30 minuten of totdat het mengsel bellen vrij is.

Plaats vervolgens de wafer binnen de controlelaag in een petrischaal en plak hem op de bodem. Giet ongeveer 50 gram PDMS erop om een vier tot vijf millimeter dikke laag te creëren en plaats de wafer gedurende ten minste twee uur in een oven op 80 graden Celsius om een volledige uitharding van de PDMS te garanderen. Herhaal dezelfde procedure voor de micro contact printen wafer, maar gebruik ongeveer 20 gram PDMS in plaats van 50, wat resulteert in een vier tot vijf millimeter dikke laag PDMS.

Om de onderlaag voor te bereiden, draai een 40 micron hoge PDMS-laag op de wafer met de microfluïdische laag. Gebruik een rotatiesnelheid van 2000 RPM gedurende 60 seconden. Verhard de PDMS-laag in een oven gedurende een uur bij 80 graden Celsius wanneer alle delen zijn uitgehard.

Verwijder de controlelaag van de wafer en snijd deze in stukken met behulp van een scheermes. Boor vervolgens drukverbindingsgaten met een biopsieprik van een millimeter en dek de kanalen af met tape voor opslag. Verwijder vervolgens het PDMS van de micro contact printen wafer en bereid stempels voor die de grootte van de kamer hebben.

Bewaar ze stofvrij in een lade tot gebruik. Plaats vervolgens de spin-gecoate wafer en de vier tot vijf millimeter dikke controlelaag in een plasmareiniger. Stel de stukken bloot aan 18 watt gedurende 45 seconden met behulp van zuurstofplasma bij 0,75 millibar.

Na plasmabehandeling, lijn beide lagen snel onder een microscoop met een grote werkafstand uit. Voeg wat extra PDMS toe rond de geplaatste bovenste delen om het verwijderen van het PDMS van de wafer te vergemakkelijken. Plaats vervolgens de wafer in een oven gedurende ten minste een uur bij 80 graden Celsius.

Eenmaal uitgehard, gebruik een scalpel om voorzichtig het PDMS van de wafer te verwijderen en om de microchips punch-toegangsgaten voor de vloeistofverbindingen uit te snijden met een biopsieprik van 1,5 millimeter. Maak bovendien een reservoir in de microchip door het bovenste deel van een 200 microliter pipettentip te snijden en wat extra half uitgehard PDMS te gebruiken. Lijm het op de bovenkant.

Verhard vervolgens de chip in de oven gedurende ten minste een uur bij 80 graden Celsius. Begin met het schoonmaken van een glasplaat en PDMS-onderdelen. Reinig een glasplaat met zeep.

Spoel het af met gedistilleerd water en vervolgens met ethanol. Droog de plaat met een stikstofstroom. Gebruik tape om eventuele puinhopen en stofdeeltjes van de PDMS te verwijderen.

Plaats vervolgens het PDMS-onderdeel en de gereinigde glas. Plaats de plaat in de plasmareiniger gedurende 45 seconden bij 18 watt om een strakke binding te garanderen, plaats de chip gedurende vijf minuten op een hotplate na de plasmabehandeling. Na binding snijdt u het onderste deel van een paar 200 microliter pipettentips af. Vul ze met 10 tot 15 microliter gefilterd PBS met 4%BSA en plaats ze in de inlaten van het apparaat.

Gebruik vervolgens gesneden punten met toegevoegde 10 tot 15 microliter PBS en plaats ze in de controlekanalen. Plaats vervolgens de chips in de centrifuge en draai ze gedurende vijf minuten met 800 keer de zwaartekracht om de kanalen met vloeistof te vullen. Als er lucht in een van de kanalen achterblijft, herhaalt u deze stap totdat de kanalen volledig zijn gevuld.

Incubeer de blokkeringsoplossing gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS met een stroomsnelheid van 10 microliter per minuut. Met behulp van een spuitpomp is het apparaat nu klaar voor celasexperimenten om de glasplaat voor immunoassays te voorbereiden. Incubeer PDMS micro contact printen stempels met 0,5% biotinyleerd BSA in een schone petrischaal.

Na een half uur, reinig de stempels grondig en snel met