Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om lysaten van enkelvoudige cellen te analyseren met behulp van fluorescentie- of immunoassays. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch apparaat te maken en de binnenkamer te coaten met antilichamen. Vervolgens worden enkelvoudige cellen in de traps geïmmobiliseerd en worden ze in een tweede stap blootgesteld aan diverse reagentia om een cellulaire respons te stimuleren.

Een ringvormig klepje wordt snel gesloten en lysisbuffer wordt door het device gestuurd. Het ringvormige klepje wordt kortstondig geopend, waardoor de cellen in de microkamerlyseren en de vrijgekomen eiwitten door het kleine volume in een hoge concentratie kunnen binden aan de antilichamen. Vervolgens wordt het ringvormige klepje geopend.

De kamer wordt gewassen en detectiereagentia worden in de gesloten microkamer gebracht. De toename van de fluorescentie-intensiteit wordt in de tijd gemonitord met een fluorescentiemicroscoop; de resultaten tonen de mogelijkheid van dit systeem om een analyte van belang die door individuele cellen wordt vrijgegeven, kwantitatief en betrouwbaar te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van analyse van individuele cellen.

In het bijzonder richtte het zich op systematische onderzoeken naar de cellulaire respons op variaties in de chemische omgeving. We kunnen op- of neerreguleringen van intracellulaire moleculen waarnemen als gevolg van de chemische stimulus. Deze techniek biedt twee belangrijke voordelen.

Ten eerste kunnen we de geïmmobiliseerde cellen blootstellen aan een gedefinieerde chemische omgeving die constant is of periodiek verandert. Ten tweede kunnen we zeer gevoelige en specifieke analyses van de toestand uitvoeren zonder kruiscontaminatie of verlies van analyten door transport. Begin met het vervaardigen van de drie verschillende SU-8 masterwafers zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Eén wordt gebruikt voor het creëren van de vloeistoflaag, één voor de controllaag en een derde voor de microcontactstempel. Fabriceer vervolgens de microfluïdische chips, beginnend met de bereiding van een mengsel van PDMS en een uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1. Meng beide componenten krachtig en ontgas de oplossing gedurende 30 minuten of totdat het mengsel bubbelvrij is.

Plaats vervolgens de wafer met de controllaag laags in een Petrischaal en plak deze op de bodem. Giet ongeveer 50 gram PDMS erbovenop om een laag van vier tot vijf millimeter dik te creëren en plaats de wafer gedurende ten minste twee uur in een oven bij 80 °C om volledige uitharding van het PDMS te garanderen. Herhaal dezelfde procedure voor de wafer voor microcontactprinten, maar gebruik ongeveer 20 gram PDMS in plaats van 50, wat resulteert in een PDMS-laag van vier tot vijf millimeter dik.

Om de onderste laag voor te bereiden, wordt een 40 micron dikke PDMS-laag op de wafer met de microfluïdische laag gespint. Gebruik hiervoor een rotatiesnelheid van 2000 RPM gedurende 60 seconden. Hard het PDMS-laag uit in een oven gedurende één uur bij 80 °C wanneer alle onderdelen zijn uitgehard.

Verwijder de controllaag van de wafer en snijd deze in stukken met behulp van een scheermesje. Maak vervolgens drukverbindingsgaten met een biopsiepons van één millimeter en plak de kanalen met tape af voor opslag. Verwijder daarna de PDMS van de wafer voor microcontactprinten en bereid stempels voor die dezelfde afmetingen hebben als het kamergebied.

Bewaar ze stofvrij in een lade tot gebruik. Plaats vervolgens de spin-gecoate wafer en de vier tot vijf millimeter dikke controllaag in een plasmareiniger. Stel de stukken bloot aan zuurstofplasma bij 0,75 millibar gedurende 45 seconden bij 18 watt.

Lijn na de plasmabehandeling beide lagen snel uit onder een microscoop met een grote werkafstand. Voeg wat extra PDMS toe rondom de geplaatste bovenstukken om het verwijderen van de PDMS van de wafer te vergemakkelijken. Plaats de wafer vervolgens gedurende ten minste één uur in een oven bij 80 °C.

Zodra het is uitgehard, gebruik dan een scalpel om het PDMS voorzichtig van de wafer te verwijderen en om de microchips uit te snijden. Pons toegangsgaten voor de vloeistofverbindingen met een biopsiepons van 1,5 millimeter. Maak daarnaast een reservoir in de microchip door het bovenste gedeelte van een pipetpunt van 200 µL af te snijden en wat overgebleven half-uitgehard PDMS te gebruiken. Plak dit aan de bovenkant.

Hard vervolgens de chip uit in de oven bij 80 °C gedurende ten minste één uur. Begin met het reinigen van een glazen objectglas en de PDMS-onderdelen. Reinig een glazen objectglas met zeep.

Spoel het objectglas af met gedestilleerd water en vervolgens opnieuw met ethanol. Droog het objectglas met een stroom stikstof. Gebruik plakband om eventuele resten en stofdeeltjes van de PDMS te verwijderen.

Plaats vervolgens het PDMS-onderdeel en het gereinigde glas. Schuif deze voor 45 seconden bij 18 watt in de plasmareiniger om een stevige hechting te garanderen, en plaats de chip na de plasmabehandeling vijf minuten op een warmteplaat. Snijd na het hechten het onderste gedeelte van een paar 200 µL pipetpunten af. Vul deze met 10 tot 15 µL gefilterde PBS met 4% BSA en plaats ze in de inlaatopeningen van het apparaat.

Gebruik vervolgens afgesneden tips met 10 tot 15 µL PBS en plaats deze in de controlekanalen. Plaats de chips daarna in de centrifuge en centrifugeer ze 5 minuten bij 800 ×g om de kanalen met vloeistof te vullen. Als er lucht in een van de kanalen achterblijft, herhaal deze stap dan totdat de kanalen volledig zijn gevuld.

Incubeer de blokkeringsoplossing gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 µL per minuut. Met behulp van een spuitenpomp is het apparaat nu klaar voor cel-experimenten om de glazen objectglas voor immunoassays voor te printen; incubeer PDMS microcontactprintstempels met 0,5% gebiotineerd BSA in een schone Petrischaal.

Reinig de stempels na een half uur grondig en snel met gedestilleerd water en droog de stempel onder een stroom stikstof. Plaats de stempels, zodra ze droog zijn, snel op een gereinigde glazen objectglas om het gepatronde gebiotinyleerde BSA te deponeren. Verplaats de stempel niet na het plaatsen en controleer of de stempel in contact staat met het glazen objectglas.

Tik, indien nodig, lichtjes tegen de stempel, maar druk niet hard aan. Plaats vervolgens de stempel samen met het bovenste gedeelte van de microfluïdische chip in de plasmakamer en stel ze 45 seconden lang bloot aan zuurstofplasma bij 18 watt. Verwijder na de plasmabehandeling de stempel van het glasplaatje.

Door op het oppervlak te ademen, wordt het patroon zichtbaar. Lijn de microkamers uit bovenop het geprinte oppervlak. Zodra deze zijn uitgelijnd, plaatst u de chip gedurende 30 minuten op een warmteplaat bij 50 °C om het overige oppervlak te blokkeren, brengt u met een centrifuge een 4% steriel gefilterde BSA-oplossing in PBS in de chip aan zoals eerder beschreven, incubeert u de microchip gedurende ten minste 30 minuten en spoelt u vervolgens de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 µL per minuut.

Gebruik de chip met een spuitenpomp, direct na productie of bewaard tot twee weken bij vier graden celsius in een bevochtigde box. Creëer vervolgens een volledig functioneel bindend oppervlak door avadon in PBS in het reservoir aan te brengen. Laat de oplossing stromen om de avadon vervolgens door de vloeistofkanalen te trekken.

Spoel het reservoir grondig uit en spoel de kanalen door met PBS. Voeg vervolgens proteïne G toe aan het reservoir en trek dit door de kanalen. Was eventueel overtollige proteïne G weg door het reservoir en de chip te spoelen met PBS.

Voeg vervolgens het antilichaam van belang toe aan het reservoir en laat het door de kanalen stromen. Stop daarna de stroom om binding mogelijk te maken voordat de kanalen met PBS worden gewassen; fluorescentie-gelabelde analogen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van het printproces te controleren voordat er cellen in de kanalen worden geïntroduceerd. Oogst aanhechtende cellen, zoals de hier getoonde HE 2 9 3 cellen, met behulp van een enzymvrije dissociatiebuffer en filter deze vervolgens om het aantal celclusters te verminderen. Laad ze na het filteren in een spuit.

Laad de cellen op de chip bij een concentratie van 300 000 cellen per milliliter door de spuitpomp ongeveer drie minuten lang in voorwaartse richting te laten stromen met een snelheid van 10 tot 20 µL per minuut. Voor adhesieve cellen zoals deze is dit nodig om aspecifieke aanhechting van de cellen te voorkomen wanneer de vallen gevuld zijn. Sluit vervolgens de kamers door de bovenlaag onder een druk van drie bar te zetten. Inspecteer daarna de kamers met een microscoop. Als blijkt dat veel cellen aspecifiek aan het oppervlak binnen de kamers zijn gehecht, open deze dan snel en probeer ze weg te spoelen met een celdissociatiebuffer bij een stroomsnelheid van 10 tot 30 µL per minuut.

Voeg voor de glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH)-assay 2 mM glucose-6-fosfaat, 0,5 U/mL NADP en 0,3 mM RIN toe aan een lysisbuffer en zorg dat dit goed is gemengd. Zodra de kanalen zijn vrijgemaakt, wordt de G6PDH-lysisbuffer met een stroomsnelheid van 30 µL/min door de chip getrokken. Terwijl de lysisbuffer stroomt, worden de kamers snel geopend en gesloten, waarbij ze 500 ms open blijven zodat de lysisbuffer de kamer kan binnendringen; begin onmiddellijk na de lysis met het monitoren van de kinetische reactie.

In dit voorbeeld kan een fluorescent product in de tijd worden gemonitord. Hier wordt een reeks kamers getoond die zijn gevuld met oranje voedingskleurstof en vervolgens zijn afgesloten door de controllaag boven de microkamers onder druk te zetten. Na het sluiten van de kamers is groene voedingskleurstof door de kanalen gespoeld om de dichtheid van de kamers aan te tonen.

Elke kamer bevat een volume van slechts 625 picoliters vloeistof, waardoor de concentratie van moleculen die door de lys-cellen worden afgegeven, hoog genoeg blijft voor analyse. Bovendien kunnen de kleppen zodanig worden geopend en gesloten dat kruiscontaminatie tussen de kamers wordt voorkomen. Binnen deze kamers is het mogelijk om analyten te meten, zoals de hoeveelheid lysosoom die door een enkele PMA-geactiveerde U 9 37-cel wordt afgegeven, aangezien dit enzymatisch de productie van een fluorescent molecuul binnen de kamer katalyseert.

De groene lijnen representeren de verandering in fluorescentie-intensiteit over de tijd voor kamers die door één cel worden bezet. Ook is de fluorescentie-intensiteit voor een kamer zonder cellen weergegeven door de zwarte stippellijn. Ter vergelijking laat deze assay het effect van een toxisch molecuul op de membraanintegriteit zien door een intracellulair enzym, G6PDH, te meten.

De zwarte lijn stelt de controlemonsters zonder toxische invloed voor, terwijl de oranje lijn cellen representeert die beïnvloed zijn door het getoonde toxine. Hier is een voorbeeld van een immunoassay voor het intracellulaire eiwit. GFP anti-GFP-antilichamen werden op het oppervlak geïmmobiliseerd en zodra de cellen waren gelyseerd, werden de bindingskinetiek van de GFP-eiwitten gevisualiseerd met behulp van turf-microscopie.

Tijdstip 0,1 markeert de toevoeging van de lysisbuffer; op tijdstip 0,2 begint GFP zich op het oppervlak te ophopen, wat betekent dat cellysis heeft plaatsgevonden en GFP naar het oppervlak is gediffundeerd. De binding van GFP aan de antilichamen is voltooid op tijdstip 0,3. In dit laatste voorbeeld is vrijgekomen GA DH gebonden aan capture-antilichamen op het oppervlak, waarna HRP-gekoppelde detectie-antilichamen zijn toegevoegd.

Zodra alle niet-gebonden detectieantilichamen waren weggewassen, werd het detectiereagens toegevoegd en werd de reactie in de tijd gevolgd. Hier volgt een vergelijking van de hoeveelheid voorheen intracellulaire GA DH in dierlijke hoeveelheden tussen U 9 37 en HEC 2 93 cellen, gemeten met deze methode. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de microfluïdische chips voorbereidt, hoe u het oppervlak modificeert om immunoassays mogelijk te maken en tot slot hoe u het apparaat gebruikt voor analyse van enkele cellen.

Deze methode kan worden ingezet om te helpen bij het beantwoorden van vele prangende vragen op het gebied van de single-cell biologie.