Geoptimaliseerde protocollen voor

Het doel van dit werk is om aan te tonen hoe een zeer levensvatbare mycobacterium-lipidesuspensie kan worden bereid voor toediening aan naakte muizen. We zullen de basislevensvatbaarheid behouden vanuit een geïnfecteerde muis, bij voorkeur tijdens een vroeg stadium van de infectie.

Om een hoog rendement aan levensvatbare eieren te garanderen, dient het dier in de biologische veiligheidskast te worden geëuthanaseerd. Houd de achterste pols vast met hemostatische klemmen. Verwijder deze door middel van dissectie en dompel ze gedurende 20 minuten onder in 2% jodium. Houd voor de contaminatiebestrijding de positie vast met het voetkussen naar boven gericht.

Verzamel het zachte weefsel. Verwijder met een scalpellamesje de botten van de eerste en vijfde falangen om homogenisatie van het weefsel te vergemakkelijken. Plaats het weefsel in een steriele Petrischaal. Schraap de epidermis eraf.

Knip het granulomatose weefsel met een schaar in kleine stukjes en bewaar deze voor de latere berekening van het weefselrendement. Breng de kleine stukjes over naar een buisje met 1 ml Hank's balanced salt solution. Voeg nog eens 1 ml Hank's toe en homogeniseer het weefsel drie keer gedurende elk 15 seconden op snelheid vier.

Plaats een celzeef in een steriele conische buis van 50 ml. Pipetteer de suspensie op de zeef en laat de oplossing door zwaartekracht passeren. Om het debris te verwijderen, voegt u nog twee ml Hanks toe aan de suspensie en homogeniseert u deze opnieuw.

Filter de suspensie met behulp van dezelfde cyclus door deze zeef. Spoel de zeef door hanks toe te voegen. Voeg 1 ml 0,5% tripsine-oplossing toe aan de suspensie om een eindconcentratie van 0,05% te bereiken en het totale volume van de suspensie aan te vullen tot 9 ml.

Meng het geheel door de buis voorzichtig om te keren en incubeer dit 37 °C gedurende 60 minuten. Breng na incubatie het volume van de suspensie aan op 4 mL door steriele zoutoplossing toe te voegen, centrifugeer bij 1700 ×g gedurende 30 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door op de buis te tikken. Voeg 1 mL serologische zoutoplossing toe en meng dit.

Breng de suspensie over naar een nieuwe buis. Homogeniseer de vasculaire suspensie met een insulinespuit van 1 ml met een naald van 26 gauge terwijl de suspensie naar een nieuwe buis wordt overgebracht. Voer een microbiologische controle van de suspensie uit door twee druppels 18 medium en zeven H nine brain heart infusion aan te brengen.

11 Stein Genesen incuberen bij 37 °C. Volg vervolgens de routinematige microbiologische controleprocedures voor code Z-kleuring.

Maak een verdunning van 1:10 en een verdunning van 1:100 van de S-suspensie in zoutoplossing. Homogeniseer elke verdunning voordat de objectglazen voor het tellen worden klaargemaakt; bereid drie objectglazen door met een permanente marker drie cirkels met een binnendiameter van 10 millimeter op het oppervlak van elk objectglas te tekenen.

Omring de cirkels nu met de immunohistochemie-pen. Label deze glaasjes met een potlood met een hardheid van nummer twee voor de drie verschillende concentraties: onverdund, 1:10 en 1:100.

Pipetteer 5 µL van de fenolsereumsoplossing en 10 µL van de sary-suspensie in elke cirkel, homogeniseer en verspreid de suspensie gelijkmatig over het oppervlak van de cirkel. Plaats deze plaatjes met behulp van de steel van een wegwerplusset op een vlakke tafel om te drogen. Fixeer ze door deze plaatjes drie keer door de blauwe vlam te halen, met de bachelor-suspensies naar boven gericht.

Voer een code Zuni-onderhoud uit. Onderzoek deze objectglazen. De drie verdunningen.

Kies de meest geschikte verdunning voor het tellen van sary. Bereid 200 µL gedode sary-suspensie door de vasculaire suspensie 30 minuten lang te autoclaveren bij 121 °C. Gebruik de L 7 0 0 7 live dead back light bacterial viability kit voor fluorescente kleuring van microbacteriële lipiden.

Bereid een 1 op 10 verdunning van oplossing A en een 1 op 20 verdunning van oplossing B vlak voor gebruik. Voeg aan elke 200 µL onverdunde vasculaire suspensie (origineel en gedood) 3,6 µL van de verdunde oplossing A en 6 µL van de verdunde oplossing B toe. Na 15 minuten incubatie in het donker wordt de suspensie gecentrifugeerd bij 10.600 ×g gedurende vijf minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipet.

Resuspendeer het pellet in 50 µL 10% glycerol en homogeniseer dit door herhaaldelijk op te zuigen en uit te pipetteren. Breng acht µL van elke suspensie aan op een glazen objectglas en dek dit af met een klein dekglas. Bescherm het preparaat tegen licht.

Observeer de suspensies onder een fluorescentiemicroscoop. Bereid een suspensie voor met een concentratie van 10 tot zeven BA lip per ml, en voeg één ml vriesmedium toe aan elke cryovial. Voeg vervolgens 150 µL van de S-suspensie toe aan de één ml vriesmedium en homogeniseer dit door de buis om te keren.

Plaats het cryovial in de vriescontainer. Bewaar de container gedurende ten minste 24 uur bij -80 °C. Verplaats de buisjes naar een bewaardoos en bewaar deze bij -80 °C tot het ontdooien.

Ontdooi de bevroren suspensie in een waterbad ingesteld op 37 °C. Overbreng de suspensie naar een conische buis met 20 mL steriele zoutoplossing. Centrifugeer om te concentreren.

De baline volgde het Z-onderhoudsprotocol voor het tellen en het fluorescentiekleuringsprotocol voor de bepaling van de levensvatbaarheid. Bereid een suspensie voor die 10 tot 8 BA per maaltijd bevat; homogeniseer de suspensie vóór de inoculatie van elk dier. Trek 100 µL op in een insulinespuit en inoculeer 30 µL in de achtervoetzolen van elk dier in de bepaling van de levensvatbaarheid.

Groene fluorescentie wordt waargenomen in alle BAI en rode fluorescentie alleen in die bai. Wanneer die BAI dienen als negatieve controle, wordt dezelfde intensiteit van groen en rood BAI-licht waargenomen. Inoculatie van M Lepar die gedurende verschillende perioden was ingevroren, resulteerde in een 10 tot 1000 keer toename in het aantal herwonnen BAI na zeven maanden.

Als laatste opmerking willen we toevoegen dat aangezien IL leid niet in vitro groeit, dit protocol een snelle en eenvoudige manier biedt om levensvatbare yl Leid beschikbaar te houden voor verder gebruik in het laboratorium.