Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

Het algemene doel van deze procedure is om het gedrag van gliale cellen na een perifere zenuwbeschadiging in levende zebravislarven via time-lapse-beeldvorming in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst gesedateerde zebravislarven in laagsmeltende agarose op glazen petrischalen te monteren en ze met een dissectienaald te positioneren. Vervolgens wordt de gemonteerde larve op de confocale microscoop geplaatst.

Er wordt een zenuw geselecteerd voor ablatie en er wordt een beeld vastgelegd van de axonen en gliacellen van de onbeschadigde zenuw. Vervolgens worden er ROI's langs de zenuw geselecteerd en wordt de laser afgevuurd om de geselecteerde gebieden ableren, waardoor een zenuwotsectie ontstaat. Ten slotte worden de axonen en gliacellen via time-lapse imaging gevolgd na de zenuwotsectie.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die het dynamische gedrag van gliale cellen tijdens zenuwdegeneratie en -regeneratie tonen via time-lapse confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van regeneratie en gliale celbiologie, zoals: hoe reageren gliale cellen op zenuwletsel? En hoe coördineren verschillende gliale subtypen hun gedrag tijdens degeneratie en regeneratie?

Nadat volwassen zebravisjes zijn gekruist die transgenen bevatten die motorneuronen en gliale celtypen van belang fluorescent labelen, en de embryo's zijn geïncubeerd tot 24 uur na bevruchting of HPF, dient het eierwater te worden verwijderd en vervangen door 1 pH tooth threa of PTU in eierwater voordat de embryo's terug in de incubator worden geplaatst. Vanaf dit tijdstip tot ongeveer 96 HPF wordt een fluorescent dissectiemicroscoop gebruikt om de embryo's te screenen op de aanwezigheid van het gewenste fluorescente gen. Overbreng de positieve embryo's naar vers PTU-eierwater en plaats ze terug in de incubator.

Wanneer de larven zes dagen na bevruchting (DPF) hebben bereikt, selecteer dan enkele embryo's voor montage en breng deze over naar een kleinere schaal. Verwijder het water uit de schaal en vervang dit onmiddellijk door 0,02% trica in PTU-eiwater; incubeer de larven ongeveer vijf minuten in het anestheticum. Plaats een hoeveelheid 0,8% low melt agarose, vooraf bereid volgens het tekstprotocol, in een bekerglas met kraanwater en zet dit in een magnetron.

Laat het bekerglas 30 seconden of tot het agros is gesmolten afkoelen, totdat de buis met agros lauwwarm aanvoelt. Plaats vervolgens een genarceerde larve in een glazen bodemschaal van 35 millimeter. Verwijder al het water uit de schaal.

Dek de larven vervolgens onmiddellijk af met voldoende warm agar om het glazen bodemgedeelte van de schaal te vullen. Terwijl de agar uithardt, gebruikt u een dissectienaald om de larven op hun zij te positioneren. Kantel deze daarna voorzichtig op hun rug, waarbij u er zeker van bent dat de gemonteerde larven de glazen bodem van de schaal raken, wat noodzakelijk is voor het toebrengen van letsel en de beeldvorming.

Gebruik de naald om de larven op hun plaats te houden totdat het agar stolt en de larve is geïmmobiliseerd. Pipetteer vervolgens langzaam voldoende trica-water in de schaal om de agars en larven volledig te bedekken. Schakel alle instrumentatie van de confocale microscoop in, inclusief de geschikte diodelasers voor het exciteren van zebrafish-transgenen en de stikstofgepompte kleurstoflaser.

Zorg ervoor dat de lege beamsplitter is geplaatst en de 435 nanometer coer en kleurstofcel zijn geplaatst. Open de laser-attenuator volledig en open vervolgens de imaging-software met de 63 x 1,2 na waterimmersielens en een glazen objectglas met één gespiegelde zijde. Gebruik helderveldverlichting om een kras of etsing in de spiegel te vinden en erop te focussen.

Gebruik de beeldsoftware om de etsingen op het computerscherm te bekijken en scherp te stellen via het venster waarin de laserkalibratie en de vermogensinstellingen worden beheerd. Stel in de hoofdwerkbalk het aantal pulsen in op één en de attenuatie op 3%transmissie. Selecteer de ellips-tool en klik op de afbeelding op het computerscherm.

Om een enkele cirkelvormige ROI te creëren, herhaalt u dit proces nog drie keer totdat er vier cirkelvormige ROI's willekeurig over het beeld zijn verdeeld. Activeer vervolgens de laser. Als de laser correct functioneert en is gekalibreerd, ontstaan er vier kleine etsplekken, één binnen elke cirkelvormige ROI. Verwijder daarna het glazen objectglas van de microscooptafel en reinig het objectief.

Vervang de lege bundelsplitser door de 100%ILL-bundelsplitser om een motorische zenuw door middel van laserablatie te doorsnijden. Breng een kleine druppel waterimmersiemedium aan op het objectief en plaats de schaal met de gemonteerde larve op de juiste tafel; gebruik klemmen om deze te stabiliseren met behulp van het oculair en de widefield-verlichting. Stel scherp op de larven en lokaliseer de motorneuronen.

Scan de zenuwen in hemisegmenten 10 tot 20 en selecteer een motorische zenuw voor transectie. Open vervolgens een live weergave van de zenuw op het computerscherm. Selecteer Z-vlakken en leg een beeld vast van de axonen en gliacellen van de onbeschadigde zenuw.

Stel vervolgens de instellingen voor time-lapse imaging in om Z-projecties van alle celtypen in intervallen van vijf tot 30 minuten vast te leggen. Afhankelijk van het experiment verwijdert u de 100%ILL-straalsplitser en vervangt u deze door de blank. Keer terug naar het live-beeld van de zenuw en gebruik het juiste fluorescentiekanaal om de axonen te bekijken die worden doorgesneden.

Maak met de ellips-tool een dunne elliptische ROI in het te ableren gebied. Maak vervolgens kleinere ROI's binnen het geselecteerde gebied in het venster waarin de laserinstellingen worden beheerd. Stel het aantal pulsen in op twee en de attenuatieplaat op 18%transmissie.

Vuur vervolgens de laser af binnen de geselecteerde ROI's. Wacht 10 seconden of langer en controleer het geablateerde gebied opnieuw op fluorescentie. Houd er rekening mee dat een ROI aanvankelijk geablateerd kan lijken terwijl er in werkelijkheid sprake is van fotobleking, en dat de ROI's tijdens het ablatieproces mogelijk licht moeten worden aangepast om een volledige doorsnijding te bereiken.

Als de fluorescentie terugkeert, verhoog dan het laservermogen en activeer de laser. Herhaal dit opnieuw totdat de fluorescentie binnen de R OIS verdwijnt en binnen 10 seconden niet meer terugkeert. Zodra de ablatie is voltooid, start de time-lapse imaging; begin wanneer de time-lapse voltooid is.

Gebruik beeldsverwerkingssoftware om de gegevens samen te stellen en kleurcomposiet Z-projecties te maken voor elk tijdstip. Maak een QuickTime-film om het gedrag van axonen en glialen gelijktijdig te analyseren. De hier beschreven assay kan worden gebruikt om de reactie van glialen en andere zenuwasociatie celpopulaties op axonale beschadiging in vivo te beoordelen.

Hier wordt een voorbeeld getoond van een zenuwletsel dat met deze methode is veroorzaakt en de reactie van de omringende gliacellen. Het experiment werd uitgevoerd bij transgene zebravissen van zes DPF die een membraangebonden EGFP tot expressie brachten in de perineurale glia en cytosolisch DS red in de motorneuronen. Het letsel werd aangebracht langs de rostrale projectie van een motorische zenuw van de romp, waarna time-lapse beelden werden gemaakt in zowel het EGFP- als het DS red-kanaal.

Dit maakte gelijktijdige visualisatie van het gedrag van axonen en gliacellen mogelijk direct na de beschadiging. Deze afbeeldingen zijn statische tijdspunten genomen uit de time-lapse movie. De gestippelde ellips toont de ROI die na één minuut met de laser is geablateerd.

Na de transsectie of MPT vertoonde het geablateerde gebied geen fluorescentie en mat de letselzone ongeveer 3,5 micrometers van de proximale naar de distale stomp. Het succes van een transsectie kan worden bevestigd door het distale zenuwstompje in beeld te brengen en te zoeken naar tekenen van walleriaanse degeneratie, waaronder fragmentatie van de distale axonen en snelle klaring. De afwezigheid van axonale fluorescentie langs de distale stomp bij 120 MPT geeft aan dat deze axonen inderdaad walleriaanse degeneratie hebben ondergaan en dat de transsectie succesvol was.

Het instellen van het laservermogen op een ideale waarde is cruciaal bij het uitvoeren van laserablatie-experimenten. Ideale instellingen voor het laservermogen zorgen voor een schone ablatie van de zenuw uitsluitend binnen de geselecteerde ROI; instellingen die te laag of te hoog zijn, leiden tot suboptimale resultaten. Hier is een voorbeeld van een letsel dat is veroorzaakt door een te laag laservermogen. Na het vuren van de laser bleef er fluorescentie aanwezig binnen de ROI, wat resulteerde in een onvolledige transectie.

Aan de andere kant, zoals in deze figuur wordt aangetoond, zorgde een te hoog laservermogen voor een extreem grote ablatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u zebravissen monteert voor laser-transectie-experimenten. Creëer een transectie met een stikstofgepompte kleurstoflaser en beoordeel de respons van de omringende cellen met time-lapse confocale beeldvorming.