Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven
4 juli 2013
Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.
Het algemene doel van deze procedure is om gedragsdefecten in zebravislarven te identificeren na behandeling met toxicanten of geneesmiddelen. Dit wordt bereikt door eerst de embryo's of larven te verzamelen en te behandelen met chemicaliën tot de eerste zeven dagen van ontwikkeling. De tweede stap is het maken van agro zwemlaantje met speciaal ontworpen mallen.
Vervolgens worden de behandelde larven in de agro laantjes geplaatst voor gedragsanalyse met behulp van time-lapse fotografie. De laatste stap is het importeren van de beelden in image J en het gebruik van een specifiek macro dat in-house is geschreven om XY-coördinaatgegevens van de larven in de laantjes te verzamelen. Uiteindelijk wordt de hoge doorvoer gedragstest gebruikt om verschillen in vermijding en figma-asgedrag te vinden, evenals in zwemsnelheid en rust tussen de behandelingsgroepen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals die commercieel beschikbaar zijn, is dat we onze methode kunnen gebruiken om complexere gedragingen te observeren. Het is ook goedkoop om te bouwen en gemakkelijk op te zetten. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van gedragsneurowetenschap te beantwoorden, zoals hoe toxicanten de hersenontwikkeling en het gedrag tijdens vroege embryonale blootstelling beïnvloeden.
Het kan ook inzicht geven in subtiele hersendefecten bij mensen, die niet kunnen worden gevonden door andere huidige toxiciteitsscreens. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het vangen van de larven moeilijk kan zijn. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de stappen een leercurve hebben, aangezien het protocol op maat gemaakte systemen omvat.
Om deze procedure te starten, plaats glazen Pyrex schalen met nepgras gemaakt van groen garen in de tanks. Laat de schalen bij dageraad twee uur in de tanks staan om zebravisembryo's te verzamelen. Giet de glazen schalen met de embryo's over een handige zeef met gedeïoniseerd water.
Vervolgens worden de embryo's gekweekt in eiwater dat 60 milligram per liter instant ocean bevat in gedeïoniseerd water en 0,25 milligram per liter methyleenblauw, dat wordt gebruikt als schimmelremmer. Embryo's kunnen worden gehuisvest in groepen van 50 tot 60 larven per 50 milliliter of in grotere kweektanks totdat embryo's klaar zijn om te worden behandeld met toxicanten. Afhankelijk van de hypothese van het individuele experiment, kunnen embryo's onmiddellijk worden behandeld of tijdens specifieke ontwikkelingsstadia worden behandeld met toxicanten of geneesmiddelen, die meestal worden opgelost in DMSO en vervolgens verder worden verdund in het eiwatermedium.
De blauwe kleur wordt gebruikt voor videodemonstratiedoeleinden tijdens embryonale en laarvenbehandeling. De larven en embryo's kunnen worden gehuisvest in diepe petrischalen met een dichtheid van ongeveer 50 tot 60 larven per 50 milliliter tot de gedragsanalyse bij zeven dagen na bevruchting. Verander de eiwateroplossing minstens om de dag om schimmel- of bacteriegroei door de dode embryo's te voorkomen. Plastic mallen werden gemaakt om laantjes te creëren met behulp van aros, dat wordt gegoten in enkele wel plastic platen van Thermos Scientific.
De mallen bevatten vijf laantjes waarbij de zijden onder een hoek van 60 graden staan. Zie de tekstprotocol die bij deze video hoort voor de afmetingen van de mallen en de platen? Bereid eerst de aros voor door 0,8% aros te smelten in gedeïoniseerd water met 60 milligram per liter instant ocean.
Genereer vervolgens de laantjes door 50 milliliter van de gesmolten aros in een enkele wel plaat te gieten. Plaats vervolgens heel langzaam de mal bovenop de vloeibare aros die eventuele bubbelvorming elimineert. Verwijder de mal wanneer de aros is afgekoeld.
De aros laantjes kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard met de deksels op de schalen gedurende maximaal 36 uur. Voor hoog doorvoer gedragsanalyse worden beeldcabinetjes voorbereid met een 15 megapixel digitale camera die aan de bovenkant van het kabinet is bevestigd en naar beneden kijkt op de bodem van het kabinet. Een 15,6 inch scherm laptop wordt geplaatst met het scherm omhoog.
Om oververhitting van de larven te voorkomen, is het het beste om een laptop te gebruiken met een schermtemperatuur die niet boven de 28 graden Celsius uitkomt. Plaats een plastic diffuser bovenop het laptopscherm waarop de agros platen zullen worden geplaatst. De diffuser voorkomt meer patronen in de verzamelde beelden.
Om het beeldvastleggen te beginnen, verplaats de larven voorzichtig van de petrischaal naar het agro laantje om stress bij de larven te verminderen. Tot 20 larven kunnen in elk laantje worden geplaatst, maar meestal worden vijf larven per laantje gebruikt om de meest nauwkeurige tracking van zwemsnelheid te faciliteren en om het aantal larven dat per experiment nodig is te verminderen. Vul de laantjes met eiwater, met of zonder geneesmiddelen of toxicanten, afhankelijk van het experiment. Vul de laantjes niet helemaal vol totdat ze in de beeldcabinetjes worden geplaatst om overstroming te voorkomen.
Geef de larven 10 minuten om zich aan te passen na de acclimatisatieperiode. Plaats vier platen met de hand direct bovenop het laptopscherm. Op dit moment kunnen de laantjes worden aangevuld met ei, water of chemische behandeling zodat het vlak is met de bovenkant van het laantje om schaduwen aan de randen van de laantjes te elimineren.
In de beeldprogramma stelt de computer de tijd voor time-lapse fotografie in, waarbij elke zes seconden foto's worden genomen voor een totaal van 300 beelden per experiment. Stel de camera in op een lagere resolutie voor beeldvorming bij videosnelheid. Terwijl de lagere resolutie de opnames beperkt tot een enkele multi-well plaat.
De video-opnamen zijn geschikt voor het afbeelden van snelle zwemgebeurtenissen. Gebruik een PowerPoint-presentatie als een aversieve stimulus voor de larven in deze demonstratie. De PowerPoint begint met een lege witte achtergrond gedurende 15 minuten, gevolgd door 15 van een bewegende rode balk op de bovenste helft van de plaat.
Om verdamping van de vloeistof binnen de aros laantjes te voorkom
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw geautomatiseerd high-throughput imaging-systeem voor het analyseren van het gedrag van 7 dagen oude zebravislarven. Het systeem is ontworpen om gedragsveranderingen te detecteren na blootstelling aan milieugifstoffen of farmaceutica.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Gedragsneurowetenschap
- Toxicologie
- Beeldvormingstechnologie
Achtergrond
- Zebravislarven worden veelvuldig gebruikt in gedragsstudies vanwege hun transparante lichamen en snelle ontwikkeling.
- Bestaande methoden voor gedragsanalyse leggen complexe gedragingen mogelijk niet effectief vast.
- High-throughput technieken kunnen het inzicht in hoe toxicanten de ontwikkeling beïnvloeden, verbeteren.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor het trainen van nieuwe gebruikers in deze methode.
Doel van de studie
- Om gedragsdefecten in zebravislarven te identificeren na behandeling met toxicanten of farmaceutica.
- Om een kosteneffectieve en efficiënte methode te ontwikkelen voor het observeren van complex gedrag.
- Om inzicht te bieden in de effecten van omgevingsfactoren op de hersenontwikkeling en het gedrag.
Gebruikte methoden
- Verzameling en behandeling van zebravissenembryo's of -larven met toxicanten.
- Aanleg van zwembanen met behulp van speciaal ontworpen mallen voor gedragsanalyse.
- Time-lapsefotografie om het gedrag van de larven vast te leggen.
- Beeldanalyse met ImageJ-software met een aangepaste macro voor data-extractie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van verschillen in vermijdingsgedrag, zwemsnelheid en rustperiodes tussen de behandelingsgroepen.
- De methode maakt de observatie van complexere gedragingen mogelijk in vergelijking met bestaande technieken.
- Aantoonde dat het mogelijk is om subtiele hersendefecten te identificeren die huidige toxiciteitsscreenings mogelijk over het hoofd zien.
Conclusies
- Het high-throughput imagingsysteem is een waardevol instrument voor gedragsneurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode kan het inzicht in de impact van toxische stoffen op de vroege hersenontwikkeling vergroten.
- Visuele training is essentieel voor een effectieve implementatie van de techniek.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze high-throughput gedragstest maakt vroege detectie van neurotoxische effecten bij zebravislarven mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij het screenen van farmaceutische stoffen en milieutoxicanten. Door het kwantificeren van complexe gedragingen zoals vermijdingsgedrag, zwemsnelheid en thigmotaxis, biedt het systeem voorspellende zekerheid voor pijplijnen voor target-validatie en lead-identificatie. Het kosteneffectieve, schaalbare ontwerp faciliteert hergebruik op organisatieniveau binnen workflows voor discovery biology en translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door blootstelling aan toxicanten te koppelen aan kwantificeerbare gedragstypen in een ziekterelevant systeem.
- Operationele waarde: Maakt high-throughput screening van verbindingenbibliotheken mogelijk om neuroactieve stoffen met mechanistische precisie te identificeren.
- Strategische waarde: Ondersteunt voorspellende risicovermindering door subtiele hersendefecten te detecteren die door conventionele toxiciteitstests worden gemist.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten, waaronder zwemsnelheid, baanvoorkeur en rustgedrag, voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een geautomatiseerde ImageJ-macro en een Excel-sjabloon om reproduceerbaarheid te waarborgen en handmatige variabiliteit bij de gedragsscore te verminderen.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare inzet van assays in platen met meerdere banen mogelijk, wat bijdraagt aan assay-standaardisatie en cross-functionele consistentie van gegevens.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt translationele continuïteit door het modelleren van menselijk relevante neurobehaviorale reacties op omgevingsgifstoffen en farmaceutica.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling via dosis-responsanalyse van organofosfaatpesticiden en DMSO-controles.
- Strategische waarde: Verbindt bevindingen uit vroege ontdekkingsfasen met preklinische validatie via meetbare eindpunten voor vermijding en thigmotaxis.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege target-validatie via lead-identificatie tot preklinische beoordeling, door kwantificeerbare gedragsmatige read-outs te leveren die go/no-go-beslissingen onderbouwen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door larvale responsen op aversieve stimuli en chemische behandelingen te meten.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via geautomatiseerde coördinaatextractie en Excel-gebaseerde kwantificering van zwemsnelheid, randvoorkeur en rustgedrag.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen mogelijk met ingebouwde Excel-vergelijkingen en SPSS-compatibele output voor het delen van gegevens tussen teams.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij inspanningen voor biomarker-afstemming door dosisafhankelijke veranderingen in vermijding en thigmotaxis vast te leggen die relevant zijn voor het menselijke neurobehaviorale risico.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar platform dankzij goedkope, op mallen gebaseerde baanconstructie en minimale eisen aan de instrumentatie.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door subtiele gedragsveranderingen te detecteren die duiden op neurotoxiciteit.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde fabricage van banen, time-lapse imaging en geautomatiseerde beeldanalyse.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de afhankelijkheid van gedragstests met een lage doorvoer te verminderen en risicobeperking in een vroeg stadium mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Informeert de risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen te identificeren die de vermijdingsdrang of zwemsnelheid van larven bij lage concentraties beïnvloeden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het houden van zebravis, gedragsneurowetenschappen en basisbeeldanalyse.
- Afhankelijk van op maat gemaakte agarose-baanmallen, imaging-systemen met time-lapse functionaliteit en ImageJ met een door de gebruiker verstrekte macro.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van acclimatisatie, kleuring en imaging-protocollen van larven om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar verschillende larvale leeftijden, stamachtergronden of chemische oplosbaarheden.
- Beperkt door de noodzaak van handmatige plaatsing van larven en potentiële variabiliteit in het vullen van de banen, wat de nauwkeurigheid van de randdetectie kan beïnvloeden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
Collection of Zebrafish Embryos and Raising Larvae
3:08
Preparing Molds for Behavioral Analyses
4:02
Preparation of Imaging Cabinet
4:39
Image Capture
6:08
Image Analysis
7:31
Results: Example of Behaviors that Can Be Quantified in the High-throughput Assay
8:57
Conclusion
