Isolatie en chemische karakterisering van Lipid A van Gram-negatieve bacteriën

Het algemene doel van het volgende experiment is om lipopolysacharide te isoleren van het buitenste oppervlak van gramnegatieve bacteriën en om het lipide A-gedeelte structureel te karakteriseren met behulp van tandem MS-protocollen. Dit wordt bereikt door chemische extractie van lipopolysacharide van het bacteriële celoppervlak en daaropvolgende milde zuurhydrolyse om lipide A vrij te maken uit het polysacharidegedeelte van lipopolysacharide. Als tweede stap wordt een oplossing van lipide A geanalyseerd via electrosprayionisatie MSMS.

In onze procedure wordt lipid A geanalyseerd via MS MS op basis van ofwel botsingsgeïnduceerde dissociatie of ultraviolette fotodissociatie voor structurele karakterisering. De resultaten tonen verschillen in het fragmentatiepatroon in massaspectra die zijn gegenereerd met respectievelijk protocollen voor botsingsgeïnduceerde dissociatie of ultraviolette fotodissociatie-gebaseerde MS MS, waarbij UVPD een informatiever fragmentatiepatroon oplevert. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat tandem-massaspectrometrie de elucidatie van doelanalieten mogelijk maakt op basis van de interpretatie van diagnostische fragmentatiepatronen.

Ultraviolette fotodissociatie is in het bijzonder een MSMS-methode met hoge energie die diverse fragmentionen produceert dan bestaande technieken zoals botsingsgeïnduceerde dissociatie. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de gebruikte UVPD-massaspectrometrie-methode nog niet is gecommercialiseerd. Daarnaast maakt de methode gebruik van een laser die via een aangepaste modificatie is geïntegreerd met een massaspectrometer voorafgaand aan het starten van deze procedure.

Oogst de cellen uit een bacteriële cultuur van 250 ml en centrifugeer de cellen bij 10 000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Schenk vervolgens het supernatant van het medium af en was het celpellet met 50 ml 1X PBS. Giet na het centrifugeren om de cellen opnieuw te pelletteren het supernatant af.

Resuspendeer de cellen vervolgens in 40 ml 1x PBS en verdeel deze over twee Teflon-centrifugebuizen van 250 ml. Voeg aan elke buis 25 ml chloroform en 50 ml methanol toe voor een monofasisch mengsel. Meng door omkering en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur.

Om volledige cellysis te garanderen, wordt het mengsel 20 minuten gecentrifugeerd bij 2000 ×g bij kamertemperatuur, waarna het supernatant wordt weggegooid. Was de LPS-pellet met ongeveer 100 ml van een eenfasig Bly-dire-mengsel. Centrifugeer 20 minuten bij 2000 ×g en gooi het supernatant weg.

Voeg 27 µL milde zuurhydrolysebuffer toe aan het LPS-pellet en meng door herhaaldelijk op te zuigen en uit te stoten met de pipet totdat er slechts kleine deeltjes overblijven; soniceer met een probe-tip om de LPS-pellet homogeen in de oplossing te resuspenderen bij een constante duty cycle gedurende 20 seconden bij 50% output. Herhaal de sonicatie van het monster twee keer met bursts van 20 seconden en ongeveer vijf seconden tussen de bursts.

Kook de monsters vervolgens gedurende 30 minuten in een waterbad. Haal de buisjes uit het waterbad en laat het monster afkoelen tot kamertemperatuur. Voordat u overgaat tot het extraheren van lipide A na hydrolyse, zet u de SDS-oplossing om in een tweefasig BLY-mengsel door 30 ml chloroform en 30 ml methanol toe te voegen voor een mengsel van chloroform-methanol en milde zuurhydrolysebuffer, dat door omkeren wordt gemengd en vervolgens wordt gecentrifugeerd.

Centrifugeer het S-monster 10 minuten bij 2000 ×g. Gebruik een glazen pipette om de onderste fase over te brengen naar een schone Teflon centrifugebuis. Voer vervolgens een tweede extractie uit door 30 ml van de onderste fase van een vooraf geëquilibreerd tweefasig mengsel toe te voegen aan de bovenste fase in de monsterbuis, meng door omkering en centrifugeer 10 minuten bij 2000 ×g. Extraheer de onderste fase met een glazen pipette en voeg deze samen met de eerder geëxtraheerde onderste fase.

Was de samengevoegde onderste fasen door 114 ml vooraf geëquilibreerde bly dire bovenfase toe te voegen om een tweefasig bly dire mengsel te creëren, meng door inversie en centrifugeer. Zet dit op 2000 ×g voor 10 minuten met een glazen transferpipet. Draag de onderste fase over naar een schone glazen rotavapkolf en droog het monster via rotatieverdamping.

Voeg vervolgens 5 mL van een chloroform-methanolmengsel toe aan de rotatiekolf en soniceren in een bad gedurende ten minste 30 seconden om de suspensie van lipide A van de wanden van de kolf te bevorderen. Gebruik een glazen transferpipet om het lipide over te brengen naar een schone glazen buis, afgesloten met een fenolische schroefdop met PTFE-voering.

Droog het monster onder een stroom stikstof met behulp van een stikstofdroger. Resuspendeer het gedroogde lipide in 1 mL van een mengsel van chloroform en methanol. Vortex na toevoeging van het oplosmiddel het mengsel om volledige resuspensie te garanderen.

Overbreng naar een klein glazen monsterbuisje en droog met een stikstofdroger. Bewaar het gedroogde monster bij -20 °C tot de daaropvolgende TLC- of MS-analyse. Het monster kan bij -20 °C worden bewaard tot de verdere analyse.

Zodra het monster is voorbereid, mengt u 200 µL HPLC-grade methanol met 200 µL HPLC-grade chloroform in een leeg klein glazen monsterbuisje. Breng 200 µL van het chloroform-methanol-oplosmiddelmengsel over naar het buisje met lipid A en sonicate de inhoud van het buisje gedurende vijf minuten of totdat al het materiaal is opgelost. Stel vervolgens de massaspectrometer in op negatieve modus elektrospray-ionisatie en vul een spuit van 250 µL met de lipid A-oplossing.

Plaats de spuit in een spuitenpomp en infuseer de verdunde lipide rechtstreeks. Neem een monster bij een stroomsnelheid van 2,0 tot 3,5 µL per minuut. Optimaliseer en verbeter het lipide-ionsignaal door de ionoptiek af te stellen.

Neem het massespectrum van het lipide op. Isoleer een species en activeer het doellipide A door CID als MSM-methode te selecteren. Verhoog vervolgens de CID-spanning of de genormaliseerde botsingsenergie totdat het precursorlipide.

Een soort heeft een relatieve abundantie van ongeveer 10% vergeleken met het hoogste product-ion; verzamel en middel de spectra totdat een voldoende signaal-ruisverhouding is bereikt. Bereid voor de product-ionen de monster en de massaspectrometer voor zoals beschreven in de vorige sectie. Zet de laser die is gekoppeld aan de massaspectrometer aan.

Raadpleeg het tekstprotocol voor de details van de MS; configureer de software van het instrument zodanig dat de laser de excimerlaser activeert wanneer de ionen de HCD-cel binnengaan. Zet vervolgens de pulsgenerator in zodanig dat de laser elke twee milliseconden pulseert. Isoleer het lipide precursor-ion door HCD te selecteren als de MS MS-methode en stel de botsingsenergie in op 1% genormaliseerde botsingsenergie. Activeer het geïsoleerde lipide-ion door de laserenergie te verhogen en het aantal laserpulsen aan te passen, wat doorgaans tien pulsen van zes milli joule is. Verzamel en middelen tot slot de spectra totdat een voldoende signaal-ruisverhouding is bereikt.

Voor de UVPD-productionen. Het negatieve ion MALDI-TOF-massaspectrum van lipide A van de E. coli K 12-stam W 3 110 levert de enkele gedeprotoneerde soort bij een massa-ladingsverhouding van 1796.2 als de belangrijkste waargenomen soort. Details van de MALDI-analyse worden besproken in het tekstprotocol.

Alternatief levert hetzelfde lipidemonster dat is onderworpen aan ESI in negatieve modus voornamelijk dubbel gedeprotoneerde lipidionen op bij een master charge ratio van 898.1. Enkelvoudig gedeprotoneerde lipidionen bij een master charge ratio van 1796.20 zijn waarneembaar, maar hebben een lagere relatieve abundantie dan de dubbel gedeprotoneerde species. Fragmentatie door CID of 193 nanometer UVPD werd uitgevoerd op het enkelvoudig gedeprotoneerde lipidion. Deze technieken kunnen worden gebruikt om chemische structuren, in het bijzonder van lipiden, beter toe te wijzen.

Een soort die complexe combinaties van modificaties of voorheen ongekarakteriseerde chemische modificaties bevat. Fragmentatieprofielen worden weergegeven met gestreepte lijnen die de splitsingsplaatsen aangeven en komen overeen met de master-ladingverhoudingswaarden onder elke verstrekte structuur. De master-ladingverhoudingswaarden en splitsingsplaatsen die in een rood lettertype zijn gemarkeerd, vertegenwoordigen unieke productionen die geassocieerd zijn met UVPD 32 P-gelabelde lipiden.

Lipide A geïsoleerd uit twee verschillende E. coli K 12-stammen werd geanalyseerd via TLC. Het protocol voor deze procedure staat beschreven in het tekstprotocol. De K 12-stam W 3 110 bevat voornamelijk bis- en trisgefosforyleerd lipide A, of er is een complexer TLC-patroon waarneembaar met 32P-lipide.

A geïsoleerd uit e coli stam WD 1 0 1. WD 1 0 1 produceert lipiden. A is sterk gemodificeerd met rabino en fosfoethanolamine.

Aangezien zowel het één- als het vier-primefosfaat beschikbaar zijn voor modificatie, kan lipide A van WD 1 0 1 worden beschreven als enkelvoudig gemodificeerd, waarbij slechts één el-amino-arabinose of fosfoethanolamine aan een van de fosfaten is gebonden, of dubbel gemodificeerd, waarbij beide fosfaten op combinatorische wijze zijn gemodificeerd. Naast modificatie aan de één- en vier-primefosfaten wordt ook palmitaat-additie waargenomen, wat de RF-waarde van lipide A-soorten in dit oplosmiddelsysteem verhoogt. Dit protocol heeft een unieke weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de microbiologie om de structuur-functierelaties verder te onderzoeken met betrekking tot de manier waarop lipide A-modificaties de biologie van gramnegatieve bacteriën beïnvloeden.

We zijn tevens zeer geïnteresseerd in en hebben de kracht van UVPD-gebaseerde MS aangetoond voor het karakteriseren van de structuren van biologisch belangrijke moleculen, zoals glycanen, eiwitten, nucleïnezuren en andere complexe lipiden. Vergeet niet dat het werken met organische oplosmiddelen, biologisch gevaarlijk materiaal en lasers extreem risicovol kan zijn. Het is belangrijk om te benadrukken dat oplosmiddelen in geventileerde chemische zuigkasten gehanteerd moeten worden.

Draag altijd geschikte beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een veiligheidsbril, en zorg dat de laser die voor UVPD wordt gebruikt, correct is afgeschermd.