Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van Drosophila melanogaster
11 september 2013
Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.
Het algemene doel van deze procedure is om benigne en invasieve tumoren in drosophila te induceren en vervolgens ze te visualiseren door het dissecteren van het larvale cephalische complex. Dit begint met het opzetten van kruisingen tussen de gewenste stammen en het isoleren van de larvale nakomelingen, die ofwel de invasieve ofwel de benigne tumoren dragen. De volgende stap is het dissecteren van de geselecteerde larven.
Om het cephalische complex bloot te leggen, snijdt u ze eerst twee derde van de weg door, bevestigt u ze en draait u ze vervolgens binnenstebuiten. Vervolgens worden het vette lichaam en de darmweefsels schoongemaakt, en worden alle zenuwen die nog steeds aan het ventrale zenuwkoord en de larvale opperhuid zijn bevestigd, verbroken. De laatste stap is het afbeelden van het cephalische complex of het fixeren voor downstream-toepassingen.
Uiteindelijk kunnen de resultaten GFP-gelabelde invasieve of benigne tumoren laten zien door het gebruik van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele van de belangrijkste vragen in de kankerbiologie. Bijvoorbeeld, u wilt misschien begrijpen welke genen de progressie van tumoren in een intact organisme kunnen remmen.
Zodra de vereiste genetische voorraden zijn verkregen, bereidt u een startercultuur van de tester-stam voor. Bereid ook een startercultuur voor voor de geteste voorraad. Kruis 10 vrouwelijke maagden uit de tester-stam met 10 mannetjes van de geteste voorraad.
Laat de vliegen 24 tot 48 uur bij 25 graden Celsius paren en eieren leggen, en breng ze vervolgens over naar een nieuw flacon om meer nakomelingen te produceren. Controleer de kruisflessingen op eieren en eerste instar-larven. Zet een nieuwe kruising op.
Als de verzamelde flessingen een slechte eiafzetting vertonen. Als de verzamelde flessingen beginnen uit te drogen, voeg dan slechts drie tot vier druppels autoclaaf gedistilleerd water toe om de cultuur vochtig te houden. Blijf de flessingen controleren tot ze rondzwerven.
Derde instar-larven zijn aanwezig. Ga vervolgens verder met het controleren ervan onder een fluorescentie-stereomicroscoop. Gebruik dezelfde procedure om vliegen met invasieve tumoren te verzamelen met behulp van de vermelde voorraden, dwaal-derde instar-larven zijn beschikbaar vanaf de vijfde of zesde cultuurdag, dwaal-derde instar-larven zullen beschikbaar zijn van de benigne tumorculturen.
Ze zullen echter pas beschikbaar zijn vanaf dag 10 van de invasieve tumorculturen. Om de derde instar-larven te verzamelen, maakt u een fijn penseel nat met gedistilleerd water en schraap ze van de wand van de fles. Plaats de larven in een depressieschuifje met koud een XPBS, en gebruik vervolgens een nat penseel.
Schraap eventueel voedselmateriaal van hun opperhuid. Plaats de larve gedurende enkele minuten van immobilisatie op de plaat bij min 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voor een langere immobilisatietijd, plaats de larven in een cultuurflesje met alleen vliegenslaap op een toverstok.
Versluit de cultuurfles en laat deze 40 minuten staan. Breng vervolgens de geïmmobiliseerde larven over naar een glasplaatje. Voeg een druppel lichte halo-carb olie toe en bedek de larven met een dekglas.
Bekijk nu de larven onder een fluorescentie-stereomicroscoop. Selecteer voor GFP-expressie de groen fluorescerende larven en ga verder met de dissectie. Larven met benigne tumoren zullen groen fluoresceren in het voorste gebied waar het cephalische complex aanwezig is.
Invasieve tumoren zullen ook groen fluoresceren in het voorste gebied van de larven bij het cephalische complex. Zorg er indien mogelijk voor dat u de fluorescerende tumoren fotografeert. De doorschijnende opperhuid van de larve maakt het moeilijk om de mate van migratie van de tumoren te observeren, en daarom moeten we de tumoren dissecteren.
Begin met het gebruik van pincetten om een verse larve met een van beide tumoren over te brengen naar een put van een dissectieplaatje met één milliliter koud een XPBS. Houd de larven met een paar pincetten op ongeveer tweederde van de afstand vanaf het voorste uiteinde vast.
Gebruik een ander paar pincetten om het achterste derde deel van de larven slim te scheiden en weg te gooien. Laat vervolgens het voorste tweederde los. Terwijl de druk in de larve wordt vrijgegeven, zullen de inhoud uit de lichaamsholte stromen.
Verwijder met behulp van pincetten de weefsels die uit de lichaamsholte zijn gevloeid. Houd vervolgens de mondhaak van de larve vast en duw deze in de larve-epidermis. Gebruik het andere paar pincetten om de larve volledig om te draaien.
Verwijder nu met de pincetten voorzichtig en voorzichtig de vetlichaam-speekselklieren, darm, de vleugelschijfcomplex en eventuele tracheale buizen. Het cephalische complex kan nu zichtbaar zijn bevestigd aan de mondhaak. De hersenhelften en het VNC zijn nog steeds verbonden met de larvale opperhuid via zenuwen die uit het VNC komen.
Breek deze verbindingen voorzichtig met behulp van pincetten. Verwijder vervolgens eventueel overtollig vetlichaam of ander weefsel zodat het cephalische complex duidelijk zichtbaar wordt. Bevestigd aan de larvale opperhuid bij de mondhaken.
Laat het cephalische complex zoals het is voor verdere verwerking vóór visualisatie. Anders, om het cephalische complex direct te visualiseren, koppelt u het los van de opperhuid en plaatst u het in een druppel glycerol-gebaseerde montage media zoals vector schild. Met behulp van het beschreven protocol werden tumoren in het oog geïnduceerd.
Een anin-schijf, benigne tumoren bleven gelokaliseerd op de anin-schijf van het oog waar ze werden geïnduceerd. Merk op dat het GFP-gelabelde weefsel niet is gemigreerd naar aangrenzende organen zoals het ventrale zenuwkoord in het cephalische complex dat invasieve tumoren draagt. Een overgroeiing van tumorweefsel werd opgemerkt bij een larve van dag 10. Ook, zoals aangegeven door de rode pijl, hebben de tumoren aangrenzende organen zoals het VNC en de mondhaken geïnfil
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het induceren en observeren van goedaardige en invasieve tumoren in Drosophila, met de nadruk op de samenwerking tussen geactiveerde oncogenen en mutaties in genen voor celpolariteit. De procedure omvat dissectie van het cefale complex van de larve om tumorcharacteristics te visualiseren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Oncologie
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Geactiveerde oncogenen zoals RAS V12 dragen bij aan tumorgroei.
- Mutaties in genen voor celpolariteit, zoals scribbled, spelen een rol bij het tumorgedrag.
- Drosophila dient als modelorganisme voor het bestuderen van tumordynamiek.
- Inzicht in de invasiviteit van tumoren is cruciaal voor kankeronderzoek.
Doel van de studie
- Om goedaardige en invasieve tumoren in Drosophila te induceren.
- Om tumorcaracteristieken te visualiseren via dissectie van larven.
- Om de interacties tussen oncogenen en celpolariteitsmutaties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Kruisen van gewenste Drosophila-stammen om larvale nakomelingen te isoleren.
- Dissecteren van larven om het cefale complex bloot te leggen.
- Verwijderen van vetlichaam- en darmweefsel uit de gedissecteerde larven.
- Beelden vastleggen van het cefale complex voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van benigne en invasieve tumoren in Drosophila.
- Visualisatie van tumorstroomkenmerken via dissectie van larven.
- Inzichten in de rol van oncogenen en celpolariteitsmutaties bij tumorgedrag.
- Potentiële implicaties voor het begrip van de kankerbiologie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van tumordynamiek in Drosophila.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de invasiviteit van tumoren.
- Verder onderzoek kan therapeutische doelwitten verkennen op basis van deze interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Dit protocol maakt mechanistische risicoreductie van tumorinvasiepaden mogelijk door benigne-naar-maligne progressie te modelleren in een genetisch hanteerbaar systeem. Het ondersteunt targetvalidatie via functionele analyse van interacties tussen oncogenen en polariteitsgenen. De aanpak biedt voorspellende zekerheid voor het prioriteren van genetische modulatoren van tumorgedrag in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de samenwerking te testen tussen geactiveerd RasV12 en het verlies van scribble-, discs large- of lethal giant larvae-genen.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van invasiepaden mogelijk via kwantificeerbare tumorprogressie van gelokaliseerd naar aaneengesloten weefselovergroei.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde tumorhoudende cefale complexen voor voor daaropvolgende fenotypische screening van genetische suppressors of enhancers.
- Operationele waarde: Standardiseert dissectie- en visualisatieworkflows om reproduceerbare kwantitatieve resultaten van tumoralokalisatie en invasie te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door geconserveerde genetische interacties in tumorinvasiviteit te modelleren die toepasbaar zijn op menselijke kankerroutes.
- Operationele waarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door analyse van GFP-gelabelde tumeweefseldissociatie en migratiepatronen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het discovery-continuüm, van het testen van doelwitspecifieke hypothesen tot lead-identificatie, door een schaalbaar platform te bieden voor functionele genomica in de tumorbiologie.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door tumoruitbreiding in intacte cephalische complexen te visualiseren om genetische modulatoren van invasie te beoordelen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde isolatie van GFP-gelabeld tumorweefsel voor de evaluatie van verbindingen of genetische suppressoren.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van tumorovergroei en orgaaninvasie om condities over verschillende genetische achtergronden te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door geconserveerde stappen in tumorprogressie te modelleren die relevant zijn voor zoogdiersystemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor cross-project targetvalidatie in oncology-discovery-pipelines.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in tumorinvasiemodellen door gedefinieerde genetische perturbaties te koppelen aan waarneembare fenotypische resultaten.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde dissectie van larven en preparatie van het cephalische complex voor beeldvorming.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege fenotypische zekerheid te bieden bij kandidaten voor tumorsuppressors of oncogenen.
- Impact op portfolio: Informeert risicogecorrigeerde prioritering door onderscheid te maken tussen benigne en invasieve tumorfenotypen in functionele screens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, fluorescentiemicroscopie en microsurgische dissectietechnieken.
- Afhankelijk van fluorescentie-stereomicroscopie en koude anesthesiesystemen voor de immobilisatie van larven en weefselverwerking.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van stamonderhoud, kruisingstijden en protocollen voor de stadia van larven.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het model op andere tumortypen of genetische achtergronden buiten de oorsprong van de oog-antenne-schijf.
- Beperkt door de noodzaak van nauwkeurige stadia-bepaling (dag 5–6 voor benigne, dag 10 voor invasieve tumoren) om vergelijkbare vensters voor tumorprogressie te garanderen.
