Name: Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T15:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer hoe je goedaardige en invasieve tumoren induceert in Drosophila melanogaster en deze visualiseert door dissectie van het larvencephalisch complex. Dit protocol combineert geactiveerde oncogenen met mutaties in celpolariteitsgenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in mijn laboratorium wordt ondersteund door de WKU departement Biologie opstarten fondsen, WKU Research Foundation RCAP-Ik geven # 11-8032 en door een KBRIN-AREA subsidie ​​gefinancierd door een ouder subsidie ​​van het Nationaal Instituut van Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes van Volksgezondheid onder nummer award 5P20GM103436-13. Ik zou ook graag Dr Tian Xu in wiens laboratorium ik werd voorgesteld aan deze techniek en dr. Raymond Pagliarini die als eerste deze techniek in de Xu laboratorium erkennen.

1. Inductie van goedaardige niet-invasieve tumoren <ol><li> Gebruik in tabel 2 vermelde voorraden voor de inductie van goedaardige tumoren. </li><li> Bereid een starter cultuur voor de &quot;tester&quot; voorraad van de volgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP </li><li> Bereid een starter cultuur voor de &quot;getest&quot; voorraad van de volgende genotype: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo </li><li> Verzamel tien vrouwelijke maagden uit de &quot;tester&quot; voorraad en tien mannen uit de &quot;getest&quot; voorraad. </li><li> Steek de mannetjes en vrouwtjes uit de &quot;tester&quot; en &quot;getest&quot; voorraad door ze beide in een flacon met vlieg voedsel. </li><li> Plaats het kruis in een 25 ° C incubator en laat de mannetjes en vrouwtjes te paren en eieren leggen voor 24-48 uur. </li><li> Controleer de flesjes voor voldoende ei afzetting en op de aanwezigheid van larven eerste instar ervoor te zorgen dat de cultuur niet uitdroogt. <ol><li> Voeg een paar druppels van een autoclaafgedestilleerd water aan de cultuur om het vochtig te houden (als de cultuur wordt uitdroging). </li><li> Blijven toezien op de cultuur en stap 1.7.1 herhalen als nodig is. </li></ol></li><li> Observeer zwervende derde instar larven onder een fluorescentie stereomicroscoop als beschreven in punt 3. </li></ol> 2. Inductie van invasieve tumoren <ol><li> Gebruik in tabel 2 vermelde voorraden voor de inductie van invasieve tumoren. </li><li> Gebruik de starter cultuur uit stap 1.2 van de volgende genotype: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C&gt; y +&gt; Gal4, UAS-GFP </li><li> Bereid een starter cultuur voor de &quot;getest&quot; voorraad van de volgende genotype: w; LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo </li><li> Verzamel tien vrouwelijke maagden uit de &quot;tester&quot; voorraad en tien mannen uit de &quot;getest&quot; voorraad. </li><li> Steek de mannetjes en vrouwtjes uit de &quot;tester&quot; en &quot;getest&quot; voorraad door ze beide in een flacon met vlieg food. </li><li> Plaats het kruis in een 25 ° C incubator en laat de mannetjes en vrouwtjes te paren en eieren leggen voor 24-48 uur. </li><li> Controleer de flesjes voor voldoende ei afzetting en op de aanwezigheid van larven eerste instar ervoor te zorgen dat de cultuur niet uitdroogt. <ol><li> Voeg een paar druppels geautoclaveerd gedestilleerd water aan de kweek om het vochtig te houden (wanneer de kweek uitdroging). </li><li> Blijf de cultuur monitor voor droogte en herhaal stap 2.7.1 als dat nodig is. </li></ol></li><li> Observeer derde instar larven onder een fluorescentie stereomicroscoop als beschreven in punt 3. </li></ol> 3. Observatie van goedaardige en invasieve tumoren <ol><li> Gebruik derde instar larven voor goedaardige tumor isolatie en visualisatie. <ol><li> Bevochtig een verfborstel in gedestilleerd water en met behulp van deze kwast schrapen een paar larven derde instar van de wand van de cultuur flacon. </li><li> Plaats larven in een depressie glijbaan met 1X PBS en vervolgens met behulp van een natte kwast schroote eventuele voedsel materiaal uit de larvale opperhuid. </li><li> Plaats de larven in een Petri schaal en laat bij -20 ° C vriezer gedurende 30 minuten om de larve immobiliseren. <ol><li> Alternatieve methode om de larven te immobiliseren met behulp FLYNAP. </li><li> Plaats een FLYNAP toverstok gedoopt in FLYNAP aan het flesje uit 3.1.3.2 en na het inpluggen van de flacon te laten aangesloten flacon met larven gedurende 30 tot 40 minuten. </li></ol></li><li> Plaats de geïmmobiliseerde larve op een glasplaatje, voeg een druppel licht halogene olie, dek af met een deksel glas en observeren onder een fluorescentie stereomicroscoop met de mogelijkheid om Green Fluorescent Protein (GFP) te visualiseren. </li><li> De goedaardige tumor lager larven groen fluoresceren in de anterieure regio waar de cefalische complex aanwezig is. </li></ol></li><li> Selecteer dag 10 larven (na inductie) van de in stap 2 hierboven voor observatie van invasieve tumoren cultuur. Dag 10 larven worden geselecteerd omdat invasieve tumor dragende larven hebben een uitgebreide lArval podium en in het algemeen niet aan pupariate. </li><li> Volg de stappen 3.1.1 tot en met 3.1.4, behalve in plaats van derde instar larven gebruik dag 10 larven. <ol><li> De dag 10 invasieve tumor dragende larven groen fluoresceren in de anterieure regio waar de cefalische complex aanwezig is. </li></ol></li><li> Als de fluorescentie microscoop is uitgerust met een digitale camera dan foto&#39;s maken van de fluorescerende goedaardige en invasieve tumor lager larven. </li></ol> 4. Dissectie van de Cephalic Complex en verdere observatie van goedaardige en invasieve tumoren De doorschijnende epidermis van de larve maakt het moeilijker waarneembaar mate van invasie van tumoren. Dus de mate van invasie is beter gevisualiseerd door het ontleden van de cefalische complex uit de larve. De volgende stappen moeten worden gebruikt om de cefale complex ontleden. <ol><li> Met een natte kwast selecteren derde instar larven (voor goedaardige tumoren) en dag 10 larven (voor invasieve tumoren) from de betreffende cultuur flesjes. </li><li> Plaats larven in een putje van een dissectie schotel met koud 1X PBS. Gebruik kwast af te schrapen geen voedsel deeltjes uit het larvale opperhuid. <ol><li> Transfer schoon larven om een ​​nieuwe put van de dissectie schaaltje met koud 1X PBS. </li><li> Controle van de aanwezigheid van GFP-fluorescentie met behulp van een stereomicroscoop opsporen van fluorescentie. Gooi niet-GFP dragende larven. </li></ol></li><li> 1,0 ml koud 1X PBS toe te voegen aan een frisse goed op de dissectie schotel en met behulp van een pincet de overdracht van een larve dragen ofwel de goedaardige of invasieve tumoren (de dissectie protocol blijft hetzelfde voor deze twee soorten van tumoren). </li><li> Houd de larve naar beneden met behulp van een pincet ongeveer 2/3e van het voorste einde. <ol><li> Gebruik de andere pincet en slim scheiden het achterste 1/3e van de larve en gooi deze weg. </li><li> Laat de voorste 2/3e van de larve. Aangezien de druk in de larve vrijkomt de inhoud van hetlarve zal sijpelen uit de lichaamsholte. </li><li> Gebruik een tang om de darm, vet lichaam en andere inwendige inhoud van de larve die vloeide uit de lichaamsholte te verwijderen. </li><li> Gebruik een pincet om de mond haak van de larve te houden en duw het in het larvale opperhuid en het gebruik van het andere paar tang volledig keren de larve. </li><li> Gebruik de tang om voorzichtig en verwijder voorzichtig de dikke lichaam, speekselklieren, gut, de vleugel schijf complex en eventuele tracheale buizen. De Cephalic complex moet nu zichtbaar bevestigd aan de monding haak van de omgekeerde larve. De hemisferen en buikzenuwkoord (VNC) nog steeds worden aangesloten op de larvale epidermis door de zenuwen die uit de VNC. </li><li> Gebruik een pincet om voorzichtig breken de verbindingen tussen de cefalische zenuwen en het larvale opperhuid. </li><li> Als de zenuw verbindingen tussen de VNC en de larvale epidermis zijn gebroken en overtollig vet lichaam en ander weefsel verwijderd, de cefalische complex zou duidelijk zichtbaar en wordt bevestigd aan het larvale epidermis alleen de mond haken. </li><li> De Cephalic complex kan worden overgelaten bevestigd aan het larvale epidermis als de complexe behoeften voor downstream toepassingen zoals antilichaamkleuring of voor latere visualisatie worden vastgesteld. </li><li> Indien geen toepassingen later dan zou worden uitgevoerd de cefale complex kan worden losgemaakt van het larvale epidermis en in een druppel van een glycerol gebaseerde fixeermiddelen voor verdere observatie en analyse. Gebruik Vectashield als de montage media. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bale, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling and human disease.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).</li>
<li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+an+emerging+model+for+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li>
<li>Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+development%2C+disease+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in development, disease and translational medicine.</a> Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).</li>
<li>Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+tauopathies%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of tauopathies: what have we learned.</a> Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980(2012).</li>
<li>Marsh, J. L., Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+the+study+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila in the study of neurodegenerative disease.</a> Neuron. 52, 169-178 (2006).</li>
<li>Reiter, L. T., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+melanogaster+to+uncover+human+disease+gene+function+and+potential+drug+target+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins.</a> Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).</li>
<li>Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+and+functions+of+beta-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The many faces and functions of beta-catenin.</a> EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302, 1227-1231 (2003).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila.</a> Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).</li>
<li>Boccaccio, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+growth%3A+a+MET-driven+genetic+programme+for+cancer+and+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells.</a> Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).</li>
<li>Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+remodeling+is+essential+for+Drosophila+disc+eversion+and+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).</li>
<li>Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cofilin+pathway+in+breast+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).</li>
<li>Brand, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+as+a+cell+and+developmental+marker+in+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system.</a> Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).</li>
<li>Brand, A. H., Dormand, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GAL4+system+as+a+tool+for+unravelling+the+mysteries+of+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).</li>
<li>Vidal, M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila models for cancer research.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).</li>
<li>Parks, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nat Genet. 36, 288-292 (2004).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+techniques+for+studying+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development.</a> Development. 130, 5065-5072 (2003).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1237 (1993).</li>
<li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics%3A+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121, 1053-1063 (1995).</li>
<li>Rebay, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+novel+components+of+the+Ras%2FMitogen-activated+protein+kinase+signaling+pathway+that+interact+with+the+yan+gene+of+Drosophila+identifies+split+ends%2C+a+new+RNA+recognition+motif-containing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein.</a> Genetics. 154, 695-712 (2000).</li>
<li>Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+modifiers+of+a+kinase+suppressor+of+Ras-dependent+rough+eye+phenotype+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila.</a> Genetics. 156, 1231-1242 (2000).</li>
<li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+quantitating+the+invasive+potential+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.</a> Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).</li>
<li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+in+vivo+models+of+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">New developments in in vivo models of neoplasia.</a> Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).</li>
<li>Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+spontaneous+melanoma+metastasis+in+scid+mice+with+an+antibody+to+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor.</a> Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).</li>
<li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li>
<li>McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in the mouse.</a> Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).</li>
<li>Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+gene+discovery+in+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cancer gene discovery in mouse and man.</a> Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).</li>
<li>Stefanatos, R. K., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%3A+a+bold+past%2C+a+bright+future%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future.</a> J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).</li>
<li>Beaucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+brain+tumor+metastases+express+both+neuronal+and+glial+cell+type+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers.</a> Dev Biol. 301, 287-297 (2007).</li>
<li>Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+ability+of+Drosophila+tumors+depends+on+MMP+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity.</a> Dev Biol. 303, 625-634 (2007).</li>
<li>Joyce, J. A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).</li>
<li>Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+cell+polarity+drives+tumor+growth+and+invasion+through+JNK+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila.</a> Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).</li>
<li>Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell-autonomous+induction+of+tissue+overgrowth+by+JNK%2FRas+cooperation+in+a+Drosophila+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-+and+Fos-regulated+Mmp1+expression+cooperates+with+Ras+to+induce+invasive+tumors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila.</a> EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).</li>
<li>Menut, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosaic+genetic+screen+for+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressor+genes+based+on+defective+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation.</a> Genetics. 177, 1667-1677 (2007).</li>
<li>Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Ras%28V12%29+and+scribbled+clones+induces+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion.</a> Nature. 463, 545-548 (2010).</li>
</ol>

Ik heb niets te onthullen.

Kanker is een complexe ziekte met een veel beter inzicht om dan in het verleden. Er moet echter nog veel worden geleerd en uitgelegd voordat we een volledig beeld van de onderliggende mechanismen. De eenvoudig protocol hier gepresenteerde maakt het mogelijk om genetisch induceren goedaardige en invasieve tumoren in een geheel organisme en bestuderen biologie geassocieerd met de progressie van tumoren in dit model. De meeste bestaande technieken Drosophila en andere organismen of gebruiken een celcultuur gebasee...

Progressie van tumoren van een goedaardige naar een metastatische toestand is een stapsgewijze proces dat gekenmerkt wordt door ontwijking van beschermende mechanismen in het lichaam 8. Bijvoorbeeld tumorcellen in het lichaam moet kunnen apoptose en het immuunsysteem te omzeilen, doorbraak gespecialiseerde extracellulaire matrix (ECM) genoemd basaalmembraanziekte en overwinnen eventuele sociale controle die door de omringende cellen 8. Het is door een stapsgewijze progressie die de kankercellen verwerven het vermogen om te migreren en te koloniseren verre plaatsen in een proces genaamd metastase. Ons begrip van hoe de tumorcel overwint de beperkingen die het lichaam barrières is nog in de kinderschoenen, maar de opkomende beeld uit onderzoek gedaan tot nu toe wijst op een herhaald gebruik van normale ontwikkelingsprocessen en signaalwegen door de kankercellen 11-13. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft enorm bijgedragen aan onze understanding van de normale ontwikkeling en ziekte door het gebruik van geavanceerde genetische technieken ontwikkeld in de afgelopen tientallen jaren 14-17. Met behulp van mutagenese en overexpressie tools die we zijn aangekomen op een beter begrip van verschillende oncogenen en tumor suppressor genen 18-22. Echter, tumormetastase is een gevolg van de samenwerking tussen verschillende genetische laesies die is voornamelijk bestudeerd in celkweekmodellen 23,24 en verschillende xenograftmodellen 25-27. Deze modellen maar krachtig hebben hun beperkingen omdat zij niet volledig nabootsen omstandigheden in een levend organisme. Bovendien transgene modellen beschikbaar in muizen zijn omslachtig en niet bevorderlijk voor de genetische analyse van invasief gedrag 28,29. Verschillende studies hebben geprobeerd om de invasie van tumorcellen te begrijpen in Drosophila 30,31. Deze technieken voornamelijk gebruik maken van transplantatie van primaire tumoren aan hosts en dan vertrouwen op het volgen van de transplanted tumoren voor invasie van aangrenzende weefsels 32,33. Een krachtige techniek genaamd marcm 10 werd aangepast door Pagliarini en Xu model tumor invasie in Drosophila 9. Dit elegante genetisch model van tumorinvasie benut de samenwerking tussen een geactiveerde oncogen en verlies van celpolariteit. De kracht van deze modellen is het feit dat de invasieve tumoren zijn gemaakt in een intact organisme dus omzeilen de noodzaak voor transplantatie van weefsels. Om de oncogene samenwerking brengen, wordt een geactiveerd Ras oncogen als V12 uitgedrukt in klonen van cellen in het larvale oog antennal disc. Door de marcm techniek deze klonen ook aangeduid met groen fluorescerend eiwit (GFP) voor eenvoudige visualisatie en zijn homozygoot voor celpolariteit mutanten als dodelijk reuze larven, krabbelde en grote schijven gemaakt. Het resultaat GFP gelabeld invasieve tumoren in de Cephalic complex. In dit rapport Idemonstreren hoe te induceren, en visualiseer deze invasieve tumoren, zowel in het kader van een intact larven en in ontleed uit cephalic complex. De tumor inductie gepresenteerde gebruikt reagentia op het tweede chromosoom van Drosophila. In tabel 2 geef ik een overzicht van voorraden X en 3e chromosomen die kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel. Ik geloof dat deze vereenvoudigde protocol deze techniek gemakkelijk toegankelijk voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van de moleculaire basis van de progressie van de tumor zal maken.

<table><tbody><tr><td>10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde 1X PBS pH7.2 werkoplossing</td><td>Invitrogen, Sigma Aldrich</td><td></td><td>Maak vers en koel, kan tot een week worden gebruikt</td></tr><tr><td>Flynap</td><td>Carolina Biologicals</td><td></td><td>Fly anesthesie nodig om larven te anesthetiseren</td></tr><tr><td>Fixeermiddel</td><td>0,1M PIPES, pH 7,2, 4% Paraformaldehyde</td><td></td><td>Nodig om het gedissekteerde cefaalcomplex te fixeren</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Meerdere</td><td></td><td>Houd oplossingen op ijs. Dissecteer ook het cefaalcomplex in gekoelde 1X PBS en plaats het vervolgens op ijs in een Eppendorfbuisje</td></tr><tr><td>1,7ml Eppendorfbuisje</td><td>Verschillende</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen plaatjes, dekglaas</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montage Medium of enig ander montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon 200 of 700 Olie</td><td>Polysciences Inc. of Halocarbon.com</td><td></td><td>Halocarbon 200 wordt gebruikt om de larven te monteren voor visualisatie op een fluorescentie stereoscoop</td></tr><tr><td>Sally Hansen "Hard as Nails" nagellak</td><td>Te vinden in elke winkel voor algemene artikelen</td><td></td><td>Nodig om de randen van het dekglaas af te dichten</td></tr><tr><td>Een Leica MZ16.5 fluorescentie stereomicroscoop of een andere fluorescentie stereomicroscoop</td><td>Leica en anderen</td><td></td><td>Nodig om de GFP-fluorescentie in larven waar te nemen</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9-wel spotplaat of een andere dissectiebak</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verfkwast</td><td>Te vinden in elke winkel voor algemene artikelen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 1. Benodigdheden voor het uitvoeren van het experimentele protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd.</td></tr></tbody></table>

een protocol voor genetische inductie en visualisatie van goedaardige en invasieve tumoren in cephalic complexen van<em&gt; drosophila melanogaster</em

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila heeft ons begrip van de genetische basis van de normale ontwikkeling en de ziekte van de afgelopen decennia en vandaag het blijft enorm bijdragen aan ons begrip van complexe ziekten 1-7 verlicht. Progressie van tumoren van een goedaardige van een uitgezaaide staat is een complex evenement 8 en is gemodelleerd in Drosophila om ons te helpen beter inzicht in de genetische basis van deze ziekte 9. Hier presenteer ik een eenvoudig protocol om genetisch te induceren, observeren en vervolgens de progressie van tumoren in Drosophila larven analyseren. De tumor inductie techniek is gebaseerd op het marcm systeem 10 en gebruikt de samenwerking tussen een geactiveerde oncogene Ras V12 en verlies van celpolariteit genen (opgekladde, schijven groot en dodelijke reuze larven) invasieve tumoren 9 genereren. Ik laten zien hoe deze tumoren kan worden gevisualiseerd in de intacte larven enhoe deze kunnen worden ontleed uit voor verdere analyse. De vereenvoudigde protocol hier gepresenteerde moet het mogelijk deze techniek wordt gebruikt door onderzoekers vindt het begrijpen van de rol van een gen in tumor invasie.

Als gevolg van het protocol hier gepresenteerde zal de gebruiker in staat zijn om goedaardige tumoren te induceren door overexpressie een geactiveerd oncogen in het larvale oog antennal imaginaire disc. De gebruiker zal ook invasieve tumoren induceren in het oog antennaal disc overexpressie een geactiveerde oncogen in klonen van cellen mutant ook een celpolariteit gen. De tumoren kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van een fluorescerende stereomicroscoop als &quot;groen fluorescerend&quot; weefsel in het ge...

Samenwerking tussen een geactiveerd oncogen zoals RAS V12 en mutaties in cel polariteit genen zoals gekrabbeld, leiden tot tumorgroei in Drosophila waar tumorcellen ook weergeven invasief gedrag. Hier een eenvoudig protocol voor de inductie en observatie van de goedaardige en invasieve tumoren wordt gepresenteerd.

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Het algemene doel van deze procedure is om goedaardige en invasieve tumoren te induceren bij drosophila, om deze vervolgens te visualiseren door middel van dissectie van het cefale complex van de larve. Dit begint met het opzetten van kruisingen tussen de gewenste stammen en het isoleren van de larvale nakomelingen die ofwel invasieve of goedaardige tumoren hebben. De volgende stap is hetly dissecteren van de geselecteerde larven.Om het cefale complex bloot te leggen, worden deze eerst voor twee derde doorgesneden, vastgezet en vervolgens binnenstebuiten gekeerd. Vervolgens worden vetlichaam- en darmweefsels verwijderd, waarna ook alle zenuwen die nog verbonden zijn met het ventrale zenuwstreng en de larvale epidermis worden doorgebroken. De laatste stap is het afbeelden van het cefale complex of het fixeren hiervan voor verdere toepassingen.Uiteindelijk kunnen de resultaten GFP-gelabelde invasieve of goedaardige tumoren laten zien aan de hand van fluorescentiemicroscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele kernvragen in de kankerbiologie. Zo kunt u bijvoorbeeld willen begrijpen welke genen de progressie van tumoren in een intact organisme kunnen remmen.Zodra d

a-protocol-for-genetic-induction-visualization-benign-invasive-tumors

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

We beschrijven een protocol voor dissectie, fixatie en immunokleuring van steroidogenic organen in Drosophila larven en volwassen vrouwtjes steroïde hormonen biosynthese en haar reguleringsmechanisme bestuderen. Naast steroïdogene organen visualiseren we de innervatie van steroidogenic organen en steroidogene doelcellen zoals kiemlijn stamcellen.

Protocollen voor het visualiseren steroidogenic organen en hun Interactive Organen met Immunokleuring in de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.

Inductie en diagnose van tumoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor de initiële en voortgezette generatie allotransplantatie van Drosophila-tumoren in de buik van volwassen gastheren voor het bestuderen van verschillende aspecten van neoplasie. Met behulp van een auto-injectorapparaat kunnen onderzoekers verbeterde efficiëntie en tumoropbrengsten bereiken in vergelijking met die bereikt door traditionele, handmatige methoden.

Tumor allotransplantatie in Drosophila melanogaster met een programmeerbare Auto-Nanoliter Injector

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Leer hoe je goedaardige en invasieve tumoren induceert in Drosophila melanogaster en deze visualiseert door dissectie van het larvencephalisch complex. Dit protocol combineert geactiveerde oncogenen met mutaties in celpolariteitsgenen.

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Een protocol voor Genetische Inductie en Visualisatie van goedaardige en Invasieve Tumoren in Cephalic Complexen van

Meer video's verkennen