Oprichting van een

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een in vitro kweekmodel om het intracellulaire gedrag van een opportunistische humane schimmelpathogeen te bestuderen. Candida albicans in macrofagen afgeleid van de humane monocytaire cellijn THP-1. Om dit te bereiken worden THP-1 monocyten eerst behandeld met PMA om ze te differentiëren tot macrofagen.

Vervolgens worden THP-1 macrofagen twee uur na infectie geïnfecteerd met Candida GTA-cellen. Niet gefagocyteerde Candida GTA-cellen worden verwijderd door wassingen met PBS en intracellulaire cellen worden teruggewonnen voor verdere studies door osmose van geïnfecteerde macrofagen. Dit protocol kan worden gebruikt om zowel de virale load van Candida GTA-cellen in macrofagen als de fasen van rijping en de cytokinerespons in THP-1 macrofagen na Candida GTA-infectie te beoordelen.

Daarnaast kan dit protocol worden opgeschaald om de candida collaborator mutantbibliotheek op een semi-high-throughput manier te screenen op gewijzigde overlevingsprofielen in TSP one macrofagen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het relatief goedkoop is, zeer reproduceerbaar is en eenvoudig aanpasbaar is aan verschillende immuuncellen alsmede schimmelpathogenen. Om de procedure te starten, brengt u twee dagen vóór de infectie de THP-monocytische cellen naar 80% confluentie; haal op dag één het kweekvat eruit en resuspendeer alle cellen langzaam en voorzichtig.

Breng de THP-1 monocytcel-suspensie over naar een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende vier minuten bij 1000 RPM. Giet het medium af in een afvalbak, voeg 5 ml vooraf opgewarmd RPMI-medium toe aan de buis en resuspendeer. Suspendeer het THP-1 celpellet door het medium voorzichtig drie tot vier keer te pipetteren.

Neem 10 µL van de celsuspensie om de celdichtheid te bepalen met een hemocytometer en pas de celdichtheid aan naar 1 miljoen cellen per ml. Voeg één µL van een 60 µM PMA-stockoplossing toe aan de celsuspensie zodat de uiteindelijke concentratie 16 nM is en meng dit goed. Verdeel één ml celsuspensie, overeenkomend met 1 miljoen cellen, over elke put van een 24-wells weefselkweekplaat en plaats deze in een incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2.

Gooi na 12 uur incubatie het oude medium weg. Voeg één ml pre RPI-medium toe aan elke put en incubeer de plaat nogmaals 12 uur. Deze cellen worden gebruikt voor de Canada atory-infectie, die later zal worden getoond.

Inoculeer met gebruik van goede microbiologische praktijken een enkele EA-kolonie in een kolf met 1 mL YPD-medium. Incubeer de kolf gedurende 14 tot 16 uur in een incubator ingesteld op 30 °C. Centrifugeer na incubatie 1 mL cultuur bij 4.000 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en was de cellen drie keer met steriele PBS. Na het verwijderen van de wasbuffer wordt de celpellet gesuspendeerd in 1 ml steriele PBS door voorzichtig te pipetteren. Meet vervolgens de absorptie van de celsuspensie in een spectrofotometer bij 600 nanometer en stel de celdichtheid bij naar 2 miljoen cellen per ml met PBS.

Neem 50 µL van de celsuspensie en verdun deze honderdvoudig in PBS. Zaai 100 µL van de cultuur uit op YPD AGA-medium. Incubeer de plaat bij 30 °C en tel na één of twee dagen het aantal koloniën dat op de YPD-plaat is verschenen. Vermenigvuldig dit aantal met de overeenkomstige verdunningsfactor om de colony forming units op tijdstip nul te berekenen. Deze hoeveelheid colony forming units van Canada Reta zal worden gebruikt om DHE op macrofagen te infecteren.

Voeg in de volgende stap 50 µL van de celсусpensie van Canada clater toe aan de macrofaagmonolaag in een 24-wellse kweekplaat. Schud de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen en incubeer bij 37 °C. Verwijder na een incubatie van twee uur het medium door de kweekplaat omgekeerd in een bak te houden. Spoel elke well van de kweekplaat voorzichtig langs de zijkant met 1 ml steriele PBS, spoel de wells grondig door en verwijder de buffer.

Herhaal deze stap nog twee keer. Voeg vervolgens, met uitzondering van de eerste well, 1 mL RPI-medium toe aan alle andere wells; deze kunnen worden gebruikt om de intracellulaire replicatie van Candida albicans-cellen te monitoren op 4, 6, 12 en 24 uur na infectie. Om de intracellulaire cellen na twee uur macrophage-infectie terug te winnen, voegt u 1 mL steriel water toe aan de wells. Schraap de well na twee minuten voorzichtig met de punt van een 1 mL pipetpunt om macrophage-debris uit de well te verwijderen.

Spoel de well uit en verzamel het lysaat in een macrocentrifugebuis. Bereid een honderdvoudige verdunning van het microFIT-cellysaat in PBS en plateer 100 µL op YPD AGA-medium. Incubeer de plaat bij 30 °C gedurende één tot twee dagen en tel het aantal colony forming units.

Vermenigvuldig dit getal met de passende verdunningsfactor om het aantal *Candida albicans*-cellen te tellen dat na twee uur infectie is gefagocyteerd door T2-cellen en macrofagen. Op dezelfde wijze kan het aantal intracellulaire *Candida albicans*-cellen op verschillende tijdstippen na infectie worden bepaald. Intracellulaire replicatie na infectie kan worden weergegeven als een toename van de CFU's na 24 uur in vergelijking met de hier getoonde geïnternaliseerde CFU's na twee uur.

Andere resultaten van een typisch experiment waarbij het totaal aantal met TV one-macrofagen geïnfecteerde canida gator-cellen 6 × 10²⁴ is. Het aantal cellen dat na 24 uur is teruggewonnen is 3,76 × 10⁴. Dit illustreert dat cellen worden gefagocyteerd met een snelheid van 62,66% tijdens de co-incubatieperiode van 24 uur.

Can vertoonde een 5,2-voudige replicatie naarmate het aantal intracellulaire e-cellen toenam van 3,76 × 10⁴ naar 1,96 × 10⁵. In dit experiment kan de intracellulaire replicatie van canida TER-cellen ook worden beoordeeld met behulp van GFP-expresserende E-cellen, waarbij een confocale microscoop hiervoor wordt gebruikt. Bereid THV en macrofagen voor en infecteer deze in een vierkamer-objectglas volgens het eerder beschreven protocol voor de 24-wells kweekplaat.

Twee uur na infectie. Verwijder het medium door het objectglas omgekeerd in een afvalbak te legen en voeg 500 µL PBS toe aan elke kamer van het objectglas. Spoel goed na en verwijder de PBS.

Herhaal deze stap nog twee keer met 500 µL 3,7% formaldehye om de cellen te fixeren. Incubeer de slide 20 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het formaldehyde. Was elke put met 500 µL PBS om de macrofagen te permeabiliseren met 500 µL Triton X. Verwijder na een incubatie van vijf minuten Triton X en was de put met PBS.

Demonteer voorzichtig de chamber slide met behulp van een chamber removal- en air rider slide. Plaats één druppel Vector Shield montage medium met DPI op elke sector van de slide, breng een dekglas aan en verzegel de randen met nagellak; visualiseer de cellen onder een confocale microscoop. Hier worden representatieve confocale beelden getoond van TP1-macrofagen geïnfecteerd met GFE-expresserende wild-type Canida laboratory-cellen; een ongeveer zesvoudige toename van het aantal intracellulaire e-cellen van 2 tot 24 uur is indicatief voor Canida laboratory-replicatie in TP1-macrofagen. De signature tag mutagenese-benadering wordt op grote schaal gebruikt om virulentiefactoren in microbiële pathogenen te identificeren, waarbij een groot aantal mutanten gelijktijdig wordt gescreend op groeidefecten via een unieke oligonucleotidenvolgorde-tag.

Hier beschrijven we ons protocol voor de STM-screening van de Canada-bibliotheek en de mutantbibliotheek, die uit de volgende drie stappen bestaat. Eerst worden 96 plasmiden, die elk een unieke oligonucleotide sequentiestapel bevatten, geïmmobiliseerd op een nylon membraan.

In de tweede stap wordt een pool van 96 CANIDA ator-mutanten gescreend op gewijzigde overlevingsprofielen in THV one-macrofagen, gevolgd door het herstel van YPD-gekweekte en door macrofagen geïnternaliseerde mutante e-cellen, die respectievelijk worden aangeduid als input- en output-monsters. Ten slotte worden DNA-signatuurtags via PCR geamplificeerd en radioactief gelabeld vanuit de genomische DNA-monsters van de input en output. Het PCR-product wordt gehybridiseerd met unieke tags, waarna de radioactieve signalen op het membraan worden gekwantificeerd en geanalyseerd.

Om het 96 12 dot board apparaat te assembleren, plaatst u een nat nylon membraan bovenop een vochtig swap wind tree papier en draait u de schroeven van de unit vast. Was het membraan met steriel water, gevolgd door een wasbeurt met 0,4 M natriumhydroxide. Transfer 200 ng PLA BDNA-oplossing van het 96 12 blok naar de overeenkomstige wells van het dot blood apparaat, na een wasbeurt met 0,4 M natriumhydroxide.

Verwijder het membraan uit het dot blood-apparaat na een referentie in twee XXSC waarbij het overgedragen plasma BDNA aan het membraan wordt gekoppeld in een UV-crosslinker. Incubeer de membranen in antennale pre-hybridisatiebuffer en voeg UNE-flesjes toe gedurende twee uur bij 42 °C. Bereid radiolabel-sondes voor via PCR met gebruik van genomisch DNA, geëxtraheerd uit input- en output-celpellets, en primers tegen de invert flankerende regio van unieke tags.

Denatureer de radiogestempelde probes 5 minuten lang bij 99 °C en koel deze direct af op ijs. Breng de probes over naar de input- en outputflessen en incubeer deze 14 tot 16 uur bij 42 °C. Post-hybridisatie.

Was de input- en outputmembranen zoals beschreven in het protocol. Haal de membranen uit de flessen, laat ze aan de lucht drogen en stel ze bloot aan een fosforbeeldscherm. Scan na twee tot drie uur het fosforscherm en leg de beelden vast.

In dit voorbeeld worden twee gehybridiseerde membraanfilters getoond, wat de screening van één pool van 96 canida Gatory-mutanten voor veranderde overleving representeert. In thv onthulden de kwantificering van macrofagen en de bepaling van de verhouding van de signaalintensiteit van elke spot op het outputmembraan ten opzichte van het inputmembraan dat tagnummers 13 26 75 en 85 ondervertegenwoordigd zijn in de output. Deze stacks zijn rood omcirkeld en weerspiegelen de groei van vier verschillende mutanten.

In tegenstelling hiermee zijn mutanten met de unieke sequenties 11 en 81, gemarkeerd in het groen, oververtegenwoordigd in het outputmonster. Met andere woorden: uit deze screening van een pool van 96 mutanten zouden twee mutanten de overleving moeten verhogen, terwijl vier mutanten een groei in macrofagen vertonen. De gewijzigde overlevingsfenotypes die in een dergelijke poolscreening zijn geïdentificeerd, moeten worden geverifieerd in assays met enkelvoudige infecties.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een in vitro oraal systeem implementeert om het intra-groeiprofiel van de schimmelpathogeen van uw interesse te bestuderen. Daarnaast zou u nu in staat moeten zijn om grootschalige screening van mutantpoolen uit te voeren met behulp van dit systeem.