Name: Oprichting van een In vitro Systeem om Intracellular Gedrag van Studie Candida glabrata In Human THP-1 macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T20:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer een in vitro-model opzetten om intracellulair gedrag van Candida glabrata in menselijke THP-1 macrofagen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van fungale virulentie en gastheer-pathogeen interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 en BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subsidie ​​van de afdeling Biotechnologie, de regering van India en de kern fondsen van Centrum voor DNA-vingerafdrukken en Diagnostics, Hyderabad. MNR en GB zijn de ontvangers van de Junior en Senior Research Fellowships van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek naar het nastreven van een doctoraat van de Manipal University. SB is de ontvanger van Junior en Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie, op het voeren van een doctoraat van de Manipal University.

Het wordt aanbevolen om C. te voeren glabrata infectie experimenten in een laboratorium met bioveiligheid inperkingsniveau 2 (BSL-2). <ol><li> Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag. </li><li> Bereiding van C. glabrata celsuspensie. </li><li> Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata cellen. </li><li> Meting van fagocytose snelheid en intracellulaire replicatie via kolonievormende eenheid assay. </li><li> Monitoring van de intracellulaire replicatie via confocale laser scanning microscopie. </li></ol> 1. Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag <ol><li> THP-1 is een cellijn van menselijke monocyten afkomstig uit het perifere bloed van een 1-jarige man kind dat lijdt aan acute monocytische leukemie 14. THP-1, een suspensie cellijn, wordt routinematig gehandhaafd op 37 ° C in bevochtigde 5% CO2 in RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum). Behandeling met forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA een forbolester) levert terminale differentiatie van THP-1 monocytische cellen in macrofagen. Belangrijk is dat PMA behandeling geen invloed levensvatbaarheid van de cellen en gedifferentieerde cellen niet delen. </li><li> Zaad ongeveer 1,5 x 10 6 THP-1 monocyten in 100 mm kweekschalen in RPMI-1640 compleet medium (RPMI-1640 medium aangevuld met 10% serum, 2 mM glutamine en antibiotica 1x, 10 ml / schaal) en liet cellen groeien bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 2 dagen. </li><li> Zodra THP-1-cellen een dichtheid van 8 x 10 5 cellen / ml bereikt hebben, de overdracht van de cultuur schotel om de celkweek laminaire stroming kap en draai voorzichtig met het vaste cellen opnieuw in suspensie. </li><li> Pipet de celsuspensie uit, breng het in een 15 ml steriele buis en centrifugeer bij 1000 rpm (130 xg) gedurende 4 minuten. Gooi supernatant en schorten THP-1 cel pellet in 5 ml vers, voorverwarmd, RPMI-1640 compleet medium. </li><li> Opsommen cellen met een hemocytometer en verdun de cell suspensie tot een uiteindelijke dichtheid van 10 6 cellen / ml met voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium </li><li> Voeg 1 ul van 160 mM voorraad PMA (forbol 12-myristaat 13-acetaat bereid in dimethylsulfoxide) aan 10 ml THP-1 celsuspensie (eindconcentratie 16 nM) en meng. Breng 1 ml celsuspensie in elk putje van een 24-well weefselkweek plaat en incubeer plaat in de incubator op 37 ° C met 5% CO2 gedurende 12 uur. </li><li> Verwijder oude medium, voeg 1 ml voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium en laat cellen herstellen gedurende 12 uur bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Let cellen onder een omgekeerde microscoop zodat ovale THP-1 monocytische cellen in suspensie zijn gedifferentieerd in afgeplatte, spoelvormige en hechtende macrofagen. Deze gedifferentieerde cellen zijn nu klaar om C. te voeren glabrata infectie studies. </li></ol> 2. Bereiding van C. glabrata &amp; #160; Cell Suspension C. glabrata wildtype Lg2 wordt gebruikt om THP-1 macrofagen infecteren. C. glabrata cellen worden routinematig gekweekt in vloeibaar YPD (gistextract (1%)-pepton (2%) dextrose (2%)) medium. Solid YPD medium bereid door 2% agar medium voor autoclaaf. <ol><li> Om een cultuur van C. bereiden glabrata, kies een enkele kolonie uit de agarplaat met een steriele wegwerpspuit lus en beënt in 10 ml YPD vloeibaar medium en incubeer 14-16 uur onder schudden (200 rpm) bij 30 ° C. </li><li> Centrifuge deze cultuur (1 ml) bij 4.000 tpm (1.800 x g) gedurende 5 minuten in een tafelmodel microcentrifuge, cellen driemaal wassen met steriele PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,4) en suspendeer celpellet in 1 ml PBS. </li><li> Meet OD 600 van C. glabrata celsuspensie en verdunnen met een geschikt volume steriel PBS tot een dichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml te krijgen (OD 600= 0,1). Alternatief kan de gewenste celdichtheid bereikt door optelling gistcellen met behulp van een hemocytometer. </li></ol> 3. Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata Cellen <ol><li> Voeg 50 ul C. glabrata celsuspensie THP-1 macrofagen (10 6 cellen per well van een 24-putjes plaat) een MOI (multipliciteit van infectie) van 0,1 te verkrijgen en incubeer plaat bij 37 ° C met 5% CO2. </li><li> Levensvatbare gist tellingen te bepalen, te verdunnen 50 ul C. glabrata celsuspensie 100-voudig in steriele PBS en de plaat 100 ul op YPD vast medium. Incubeer de platen bij 30 ° C en tel handmatig het aantal gist kolonies verschijnen na 1-2 dagen. Deze aantallen zullen voortaan worden aangeduid als 0 uur C. glabrata CFU (kolonie vormende eenheden). </li><li> Na 2 uur coculturing van THP-1 cellen met C. glabrata cellen, verwerp kweekmedium door het omkeren van 24-well weefselkweek plaat ina reservoir en was voorzichtig driemaal met voorverwarmde steriele PBS te nonphagocytosed extracellulaire C. verwijderen glabrata cellen. Gentle wassen met PBS zijn absoluut noodzakelijk om volledige verwijdering van alle extracellulaire gist bereiken zonder schade aan de THP-1 macrofaag monolaag. </li></ol> 4. Meting van Fagocytose Beoordeel en intracellulaire replicatie via Colony Forming Unit Assay <ol><li> Lyse C. glabrata geïnfecteerd THP-1 macrofagen in 1 ml steriele H 2 O 2 min, schraap zachtjes om de macrofaag puin uit de put en vang cellysaat in een microcentrifugebuis. Microscopische verificatie van complete macrofaag lysis is cruciaal voor het herstel van alle geïnternaliseerd gist. </li><li> Bereid een 100-voudige verdunning van lysaat in steriele PBS, 100 ul plaat op vast medium YPD platen en incubeer bij 30 ° C. </li><li> Na 1-2 dagen tellen handmatig het aantal C. glabrata kolonies die apdwenen op YPD medium, te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (2 uur CFU&#39;s) en bereken fagocytose snelheid die verwijst naar het percentage van C. glabrata cellen die worden ingenomen door THP-1 macrofagen na 2 uur co-incubatie met de volgende formule. Fagocytose% = [(CFU 2 h) / (KVE bij 0 h)] X 100 </li><li> Om de snelheid van de intracellulaire replicatie van C. meten glabrata cellen in THP-1 macrofagen verzamelen intracellulaire gist op verschillende tijdstippen na infectie dwz. 4, 6, 8, 10, 12 en 24 uur, door stap 3,3-4,3. </li><li> Bereken vouw survival / replicatie van C. glabrata cellen in THP-1 macrofagen door de totale CFU op een bepaald tijdstip met de 2 uur (gefagocyteerd gist). </li></ol> 5. Monitoring van intracellulaire replicatie via confocale Laser Scanning Microscopie <ol><li> De stappen in Deel 1 beschreven zaad PMA behandelde 5 x 10 5 THP-1 cellen in elk putje van twee vier putjes kamer glijbanen en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 12 uur. </li><li> Vervang oude medium met voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium en laat de cellen te herstellen van PMA behandeling gedurende 12 uur. </li><li> Bereid GFP (green fluorescent protein)-tagged C. glabrata celsuspensie zoals beschreven in hoofdstuk 2 en infecteren aan THP-1 macrofagen een MOI van 1. Als C. glabrata stammen die GFP beschikbaar zijn, gistcellen gelabeld met FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) kan worden gebruikt om na vroege gebeurtenissen na infectie weten. fagocytose tarief en phagolysosomal rijping op 2 uur. </li><li> Incubeer dia&#39;s voor 2 uur bij 37 ° C met 5% CO 2, keer ze zorgvuldig tot middelgrote weggooien en was 3x met steriele, voorverwarmde PBS. </li><li> Voeg 500 ul voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium aan elke kamer van een dia en incubeer deze bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 22 uur. </li><li> Om 2 uur C. repareren glabrata geïnfecteerde THP-1 macrofagen, voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde (bereid in PBS) aan elke kamer van de andere slede en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker. </li><li> Was schuif driemaal met PBS, voeg 500 pl Triton-X (0,7%), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker. </li><li> Wassen dia 3x met PBS, verwijder kamer van cultuur glijbaan en lucht drogen voor 3-5 minuten in het donker. </li><li> Monteer een dekglaasje voorzichtig met Vectashield montage medium met DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool) op dia vermijden van de vorming van luchtbellen. Verwijder voorzichtig de overtollige vloeistof met Kimwipe en afdichting dekglaasje randen met nagellak. WINKEL dia in het donker bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Herhaal de stappen 5.4 en 5,6-5,9 om THP-1-cellen te verwerken 24 uur na infectie. </li><li> Afbeelding cellen met behulp van een laser scanning confosche microscoop (60x olie-immersie objectief, excitatie bij 405 nm en 488 nm voor GFP en DAPI kleuring, respectievelijk). </li></ol>

<ol><li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Candidiasis%3A+a+Persistent+Public+Health+Problem%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem.</a> Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).</li>
<li>Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+the+ARTEMIS+DISK+global+antifungal+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance study.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (4), 1366-1377 (1997).</li>
<li>Chakrabarti, A., Chatterjee, S. S., Shivaprakash, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+opportunistic+fungal+infections+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Overview of opportunistic fungal infections in India.</a> Jpn. J. Med. Mycol. 49 (3), 165-172 (2008).</li>
<li>Kaur, R., Domergue, R., Zupancic, M. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+by+any+other+name%3A+Candida+glabrata+and+its+interaction+with+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8 (4), 378-384 (2005).</li>
<li>Silva, S., Negri, M., Henriques, M., Oliveira, R., Williams, D. W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%2C+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis%3A+biology%2C+epidemiology%2C+pathogenicity+and+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li>
<li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), 7628-7633 (2007).</li>
<li>Seider, K., Brunke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187 (6), 3072-3086 (2011).</li>
<li>Rai, M. N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863(2012).</li>
<li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Schüller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li>
<li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+THP-1+Cells%3A+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li>
<li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line%2C+THP-1%2C+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li>
<li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li>
<li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+leukemia+cell+line%2C+THP-1%3A+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li>
<li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li>
<li>Castaño, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol bij de controle van opportunistische schimmelinfecties. Macrofagen bijdragen aan de verdediging antifungale door inname en verwoesting van de pathogene schimmel. Zo zal opheldering van factoren die nodig zijn voor overleving en / of tegengaan van de antimicrobiële functies van macrofagen ons begrip van schimmels virulentie strategieën bevorderen. In deze context hebben we een in vitro celkweek modelsysteem middels macrofagen afgeleid van een humane monocytisch...

Candida-soorten zijn de belangrijkste oorzaak van levensbedreigende invasieve schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten 1. Candida glabrata, een opkomende nosocomiale pathogeen, is de tweede of derde meest frequent geïsoleerd Candida-soorten uit patiënten Intensive Care Unit, afhankelijk van de geografische ligging 1-3. Fylogenetisch, C. glabrata, een haploïde gist, is nauwer verwant aan de niet-pathogene model gist Saccharomyces cerevisiae dan pathogene Candida spp. waaronder C. albicans 4. Consistent hiermee C. glabrata mist een aantal belangrijke schimmels virulentie eigenschappen, waaronder de paring, uitgescheiden proteolytische activiteit en morfologische plasticiteit 4-5. Hoewel C. glabrata vormt geen schimmeldraden, het kan overleven en repliceren in muis en mens macrofagen 6-8 suggereert dat het unieke pathogenese mechanismen heeft ontwikkeld. Beperkte informatie beschikbaar is over de strategieën die C. glabrata telt overleven voedselarme intracellulaire macrofaag milieu en het tegengaan van oxidatieve en nonoxidative gastheer responsen bevestigd door gastheer immuuncellen 5. Een pertinente macrofaag modelsysteem is een voorwaarde om de interactie van C. af te bakenen glabrata met gastheer fagocytcellen via functionele genomics en proteomics aanpak. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) van humane en muriene oorsprong respectievelijk zijn eerder gebruikt om de interactie van C. bestuderen glabrata met gastheer immuuncellen 7,9. Echter, moeilijkheden bij het verkrijgen PBMCs en BMDMs, hun beperkte levensduur en intrinsieke variatie tussen verschillende donoren zoogdieren beperken het gebruik van deze cellen zo veelzijdig modelsystemen. Hier beschrijven we een methode voor het opstellen van een in vitro systeem om de intracellul studerenar gedrag van C. glabrata cellen macrofagen afkomstig van menselijke monocytische cellijn THP-1. De algemene doelstelling van dit protocol was om een ​​eenvoudige, goedkope, snelle en reproduceerbare celcultuurmodel systeem dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om verschillende aspecten van gastheer-pathogene schimmel interactie te bestuderen vaardigen. THP-1-cellen zijn eerder gebruikt om de immuunrespons tegen een groot aantal pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels 10-12 ontcijferen. Monocytische THP-1 cellen zijn gemakkelijk te onderhouden en kunnen worden onderscheiden, op forbolester behandeling, tot macrofagen die-monocyten afgeleide macrofagen van de menselijke na te bootsen en te uiten passende macrofaag markers 13. De belangrijkste voordelen van THP-1 macrofagen modelsysteem zijn het gemak-of-gebruik en het ontbreken van geavanceerde apparatuur vereiste. De hier gepresenteerde protocol gemakkelijk aan de interactie van andere menselijke schimmels met hos bestuderent immuuncellen. De huidige procedure kan ook worden gebruikt om virulentie te identificeren voor het organisme van belang met behulp van high throughput mutant schermen. Deze proof-of-concept werd geïllustreerd door het succesvolle gebruik van THP-1 cultuur modelsysteem om een set van 56 genen die nodig zijn voor de overleving van C. glabrata in menselijke macrofagen 8 identificeren.

<table><tbody><tr><td>THP-1</td><td>American Type Culture Collection</td><td>TIB 202</td><td>Human acute monocytic leukemia cell line</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30096.01</td><td>Voor het onderhouden van THP-1 cellen</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 8139</td><td>Let op: Gevaarlijk</td></tr><tr><td>YPD&nbsp;</td><td>BD-Difco</td><td>242710</td><td>Voor het kweken van Candida glabrata cellen</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Voor het fixeren van C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen</td></tr><tr><td>Fosfaat buffer oplossing (PBS)</td><td></td><td></td><td>Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Fosfaat, 2,7 mM KCl,&nbsp; pH 7,4) voor wasbeurten</td></tr><tr><td>Souline-natriumcitraat (SSC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Buffer (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat voor 20x concentratie) voor wasbeurten</td></tr><tr><td>Prehybridisatie buffer</td><td></td><td></td><td>Buffer (50% formamide, 5x Denhardt's oplossing, 5x SSC, 1% SDS) voor hybridisatie</td></tr><tr><td>VECTASHIELD montage medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td>Voor het monteren van slides voor confocale microscopie</td></tr><tr><td>32P-gelabelde &alpha;-dCTP</td><td>JONAKI-BARC</td><td>LCP-102</td><td>Voor radiolabeling van signature tags</td></tr><tr><td>100 mm weefselkweek schaaltjes</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Voor het kweken van THP-1 cellen</td></tr><tr><td>24-well weefselkweek plaat</td><td>Corning</td><td>3527</td><td>Om C. glabrata infectie studies in THP-1 macrofagen uit te voeren</td></tr><tr><td>4-kamer weefselkweek-behandelde glasplaatje</td><td>BD Falcon</td><td>REF354104</td><td>Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te beeldvormen</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Rohem India</td><td></td><td>Voor het tellen van cellen</td></tr><tr><td>Bureaucentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 18</td><td>Om cellen in microtubes te centrifugeren</td></tr><tr><td>Bureaucentrifuge</td><td>Remi</td><td>R-8C</td><td>Om cellen in 15 ml buisjes te centrifugeren</td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>Ultraspec 10</td><td>Om de absorptie van gistcellen te monitoren</td></tr><tr><td>Plate incubatiekast</td><td>Labtech</td><td>Gekoeld</td><td>Om C. glabrata cellen te kweken</td></tr><tr><td>Schud-incubatiekast</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 43</td><td>Om C. glabrata cellen te kweken</td></tr><tr><td>Watermantel CO2&nbsp; incubatiekast</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>Forma serie 2</td><td>Om THP-1 cellen te kweken</td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Carl Ziess</td><td>Ziess LSM 510 meta</td><td>Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te observeren</td></tr><tr><td>Compound microscoop</td><td>Olympus</td><td>CKX 41</td><td>Om C. glabrata en THP-1 macrofagen te observeren</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>BioRad</td><td>DNA Engine</td><td>Om unieke tags uit input en output genomisch DNA te versterken</td></tr><tr><td>Hybridisatie oven</td><td>Labnet</td><td>Problot 12S</td><td>Voor hybridisatie&nbsp;</td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>Fujifilm</td><td>FLA-9000</td><td>Voor het scannen van gehybridiseerde membranen</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer Comfort</td><td>Voor denaturatie van radiogelabelde signature tags</td></tr><tr><td>Gel documentatie unit</td><td>Alphainnontech</td><td>Alphaimager</td><td>Om ethidium bromide-gekleurd DNA in agarose gels te visualiseren</td></tr></tbody></table>

oprichting van een<em&gt; in vitro</em&gt; systeem om intracellular gedrag van studie<em&gt; candida glabrata</em&gt; in human thp-1 macrofagen

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Celkweek modelsysteem het, om nabootser host omgevingsomstandigheden, kan dienen als een goedkope, reproduceerbare en gemakkelijk manipuleerbaar alternatief diermodellen voor de studie van een specifieke stap van microbiële pathogeen infectie. Een cellijn van menselijke monocyten THP-1, die na forbolester behandeling, is onderverdeeld in macrofagen, is eerder gebruikt om virulentie strategieën van vele intracellulaire pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis bestuderen. Hier bespreken we een protocol bij een in vitro celkweek model vaardigen systeem met THP-1 macrofagen de interactie van een opportunistische pathogeen humaan gist Candida glabrata met menselijke fagocyten bakenen. Dit model is eenvoudig, snel, ontvankelijk voor hoog-mutant schermen, en vereist geen geavanceerde apparatuur. Een typische THP-1 macrofaag infectie experiment duurt ongeveer 24 uur met een extra 24-48 uur tot herstelde intracellulaire toestaangist om te groeien op rijk medium voor kolonievormende eenheden gebaseerd levensvatbaarheid. Als andere in vitro modelsystemen, een mogelijke beperking van deze benadering moeilijk extrapolatie van de verkregen zeer complex immuuncel circuits die in de menselijke gastheer resultaten. Echter, ondanks dit, het huidige protocol is zeer nuttig om de strategieën die een pathogene schimmel kan gebruiken om te ontwijken / tegen antimicrobiële respons en te overleven, aan te passen, en zich vermenigvuldigen in de voedselarme omgeving van gastheer immune cellen op te helderen.

Infectie analyses van PMA behandelde THP-1 macrofagen met C. glabrata wildtype (wt) cellen onthulde dat wt cellen gefagocyteerd door macrofagen met een snelheid van 55-65% na 2 uur co-incubatie. Verder C. glabrata cellen konden doden weerstaan ​​door THP-1 macrofagen en onderging een matige 5 - tot 7-voudige toename in CFU&#39;s na 24 uur van coculturing met THP-1 macrofagen 8. Intracellulaire replicatie van wildtype cellen getransformeerd met GFP expressie plasmide in THP-...

Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een in vitro kweekmodel om het intracellulaire gedrag van een opportunistische humane schimmelpathogeen te bestuderen. Candida albicans in macrofagen afgeleid van de humane monocytaire cellijn THP-1. Om dit te bereiken worden THP-1 monocyten eerst behandeld met PMA om ze te differentiëren tot macrofagen.Vervolgens worden THP-1 macrofagen twee uur na infectie geïnfecteerd met Candida GTA-cellen. Niet gefagocyteerde Candida GTA-cellen worden verwijderd door wassingen met PBS en intracellulaire cellen worden teruggewonnen voor verdere studies door osmose van geïnfecteerde macrofagen. Dit protocol kan worden gebruikt om zowel de virale load van Candida GTA-cellen in macrofagen als de fasen van rijping en de cytokinerespons in THP-1 macrofagen na Candida GTA-infectie te beoordelen.Daarnaast kan dit protocol worden opgeschaald om de candida collaborator mutantbibliotheek op een semi-high-throughput manier te screenen op gewijzigde overlevingsprofielen in TSP one macrofagen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het relatief goedkoop is, zeer reproduceerbaar is en eenvoudig aanpasbaar is aan verschillende immuuncellen a

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

In this video, we perform the microglial phagocytosis assay for neuroblastoma using induced pluripotent stem cells. The assay helps assess the impairment of microglial function in neurodegenerative diseases.

Microglial Phagocytosis Assay: An In Vitro Assay to Establish Microglial Phagocytosis Model for Neuroblastoma Cells Using iPSC Macrophages

In this video, we demonstrate the efferocytosis assay to study the clearance of apoptotic cells using confocal microscopy. Efferocytosis is a multi-step process where apoptotic cells are engulfed by phagocytes and degraded within vesicles called efferosomes. This protocol provides a method to visualize internalized and non-internalized portions of individual apoptotic cells and quantify efferocytosis.

Fixed Cell Efferocytosis Assay: A Method to Study Efferocytic Uptake of Apoptotic Cells by Macrophages Using Fluorescence Microscopy

This video demonstrates an assay to quantify the intracellular growth of parasites in bone marrow-derived macrophages (BMMs). The macrophage cells are infected with the motile and non-motile invasive stages of Leishmania, metacyclic promastigotes and amastigotes, respectively. The parasites invade the macrophages, getting internalized into a parasitophorous vacuole and multiplying inside. The intracellular parasite growth is quantified using a microscope upon fluorescently staining the...

An In Vitro Assay to Quantify the Intracellular Growth of Parasite in Macrophages

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Hier is een protocol voor het opsporen van macrofaag extracellulaire trap (met) productie in levende celcultuur met behulp van microscopie en fluorescentie kleuring. Dit protocol kan verder worden uitgebreid om specifieke MET eiwit markers te onderzoeken door immunofluorescentie kleuring.

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

Het mechanisme geassocieerd met fagocytose bij Leishmania-infectie blijft slecht begrepen. Hier beschrijven we methoden om de vroege gebeurtenissen te evalueren die plaatsvinden tijdens leishmania-interactie met de gastheercellen.

Onderzoek naar de fagocytose van Leishmania met behulp van confocale microscopie

De techniek waarbij de fagocytose van schimmelconidia door macrofagen wordt gebruikt, wordt veel gebruikt voor studies die de modulatie van de immuunresponsen tegen schimmels evalueren. Het doel van dit manuscript is om een methode te presenteren voor het evalueren van de fagocytose en klaringsmogelijkheden van mononucleair afgeleide macrofagen in menselijk perifeer bloed gestimuleerd met Trichoderma stromaticum conidia.

Levensvatbaarheidstest van Trichoderma stromaticum Conidia in menselijk perifeer bloed Mononucleair-afgeleide macrofagen

Monocyten en macrofagen zijn zeer plastische en herprogrammeerbare immuuncellen die cruciaal zijn voor gezondheid en ziekte. Ze detecteren en reageren op een breed scala aan stimuli door specifieke differentiatieprogramma's en fenotypes aan te nemen. We hebben een in-vitro model gestandaardiseerd om macrofagen polarisatie en herprogrammering te bestuderen, wat een waardevol hulpmiddel voor onderzoek biedt.

Reprogrammeringsmodel van humane monocyte-afgeleide macrofagen voor in-vitro analyses

Leer een in vitro-model opzetten om intracellulair gedrag van Candida glabrata in menselijke THP-1 macrofagen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van fungale virulentie en gastheer-pathogeen interacties.

Oprichting van een

Meer video's verkennen