Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe optische projectietomografie kan worden gebruikt voor visualisatie en driedimensionale kwantificering van atherosclerotische en neointimale laesies bij de muis. Dit wordt bereikt door eerst arteriële laesies in muizen te genereren, hetzij chirurgisch of door muizen met een predispositie voor atherosclerose een hoog cholesteroldieet te voeren. De volgende stap is om de doelarterie te isoleren en deze te scannen met behulp van optische projectietomografie.

De laatste stappen zijn het uitvoeren van beeldadherstel, het identificeren van de laesie en het meten van het laesievolume. Uiteindelijk kunnen resultaten anatomische reconstructies van de laesie en kwantificering van het laesievolume en arteriële vernauwing tonen door middel van beeldanalyse. Onze groep is geïnteresseerd in het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van laesies die arteriële vernauwing veroorzaken, wat leidt tot levensbedreigende complicaties zoals een hartaanval en een beroerte.

Deze toepassing van optische projectietomografie werd ontwikkeld in onze groep door Dr. Nicholas Kirkby, in samenwerking met Dr. Lucy Lowe, en zal worden gedemonstreerd door Dr. Jung Shi Wu, een postdoctoraal wetenschapper die in onze laboratoria werkt. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals histologie en immunohistochemie is dat het minder arbeidsintensief is en driedimensionale in plaats van tweedimensionale analyse mogelijk maakt. Deze techniek om femorale arteriële laesies te induceren is aangepast van die van R en collega's en Sada en collega's.

Het tekstprotocol legt uit hoe atherosclerotische laesies kunnen worden geïnduceerd door dieetmanipulatie. Begin met een 10 tot 12 weken oude C 57 zwarte zes muis met een gewicht tussen de 25 en 30 gram. Nadat de muis is verdoofd, plaats deze op een warme pad om de lichaamstemperatuur te handhaven en geef isofluorine af met twee tot 3% via een neuskoker.

Wanneer de muis niet reageert op een teenprik, geeft u buprenorfine toe met 0,1 milligram per kilogram. Leg vervolgens de muis op zijn rug en scheer het ventrale oppervlak van de linker achterpoot. Maak vervolgens een incisie om de spieren van de bovenste achterpoot bloot te leggen tussen de bifurcatie van de popliteale ader en de buikwand.

Maak een stompe dissectie om de femorale zenuw van de femorale ader en ader gedurende het hele proces te isoleren. Houd de weefsels vochtig met 1% gewicht per volume li canine. Plaats vervolgens tijdelijke 6.0 Mers zijden ligaturen rond de femorale ader en ader dicht bij de buikwand en onmiddellijk onder de tak met de popliteale ader.

Dit is om de bloedstroom te controleren. Isoleer vervolgens de popliteale ader, twee tot vijf millimeter distaal van de tak met de femorale ader, en lig de popliteale ader onder de popliteale ader. Plaats een tweede ligatuur.

Maak nu een kleine incisie voor de inbreng van de draad in de popliteale ader onmiddellijk distaal van de tak met de femorale ader. Oefen druk uit op de proximale tijdelijke ligatuur om bloeding door de incisie en in de femorale ader richting de buikwand te voorkomen. Breng een 0,014 inch G-draad in, ongeveer één tot 1,5 centimeter.

Laat het 30 seconden op zijn plaats en verwijder het vervolgens. Gebruik vervolgens de ligaturen om de popliteale ader boven de incisie te liggen. Wees voorzichtig om de femorale ader niet te occluderen.

Verwijder nu de tijdelijke ligaturen. Sluit de wond met discontinue lopende hechtingen met behulp van 5.0 mercal. Breng vervolgens EMLA-crème aan.

Laat het dier bewustzijn en beweging herwinnen in de herstelkooi voordat het terugkeert naar de thuiskooi. De poot zal naar verwachting kreupel zijn voor twee of drie dagen, maar dit betekent niet dat de muis geïsoleerd moet worden. Voor OPT moet de muis worden geëuthanaseerd, terminale anesthesie wordt geïnduceerd door pentobarbital.

Maak vervolgens een transcardiale perfusiefixatie met exsanguinatie. Isoleer nu de femorale aders of de aortaboog en zijn takken. Verwijder eventueel overtollig materiaal in het proces.

Postfixeer vervolgens het weefsel gedurende een nacht in 10% neutraal gebufferde formaline. De volgende dag bewaar of sla het weefsel op in 70% ethanol of ga verder door de aders in gefilterde 1,5% LMP-aeros in te bedden. Laat het weefsel voorzichtig in de gesmolten aeros zakken op ongeveer 40 graden Celsius.

Snijd de aeros af om een kegelvormige vorm te maken. Dehydrateer nu deze voorbereiding in 100% methanol gedurende ten minste 12 uur. Eenmaal gedehydrateerd, maakt u de vaten helder in een een-tot-twee mengsel van benzoalcohol en benzobenzoaat.

Laat de vaten gedurende 12 tot 24 uur in deze oplossing incuberen. De volgende dag laadt u het gewiste monster in de tomograaf, die vooraf gekalibreerd moet zijn. De resolutie is ingesteld op 1024.

Door 1024 pixels. Stel de vergroting in voor het gebied van belang. De Z-as wordt automatisch ingesteld op dezelfde resolutie.

De voxelgrootte zal ongeveer 200 micron zijn. Gebruik vervolgens het Brightfield-kanaal om de positie van het monster zo in te stellen dat het om zijn eigen as draait in het midden van het gezichtsveld. Gebruik de GFP-een filter emissiekanaal om de focus in te stellen en pas de belichting aan om het dynamische bereik van het beeld te maximaliseren.

Vermijd oververzadiging. Scan nu het vat in het GFP-een emissiekanaal alleen met stappen van 0,9 graden. De monsters moeten vervolgens gedurende ten minste 24 uur in 100% methanol worden teruggeplaatst voordat ze in was worden ingebed.

Voor histologische analyse opent u de verkregen beelden in n recon-software of vergelijkbare software met behulp van data viewer-software. Controleer de kwaliteit van de beeldreconstructie, verbeter de beeldkwaliteit, pas de beeldintensiteit aan en laat de software compenseren voor eventuel