Analyse van vetzuurgehalte en Compositie in Microalgen

Het algemene doel van deze procedure is het meten van het totale vetzuurgehalte en de samenstelling in microalgen. Dit wordt bereikt door eerst een monster voor te bereiden dat een bekende hoeveelheid geliofiliseerde algbiomassa bevat. De tweede stap bestaat uit het disrupten van de microalgenbiomassa.

Vervolgens worden de lipofiele componenten geëxtraheerd en geïsoleerd. De laatste stap is de transesterificatie van de ACell-lipiden tot vetzuurmethylesters. Ten slotte wordt gaschromatografie gebruikt om de vetzuren te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals tric-bepalingen, is dat deze methode zeer nauwkeurig is en specifiek alle vetzuren en alle andere lipofiele componenten meet. De procedure zal worden gedemonstreerd door NDI Afer, een technicus uit ons laboratorium. Bepaal vóór het starten van deze procedure de concentratie van het drooggewicht van de algen in gram per liter in het kweekmedium, zoals beschreven in de vermelde referentie. Overbreng een volume kweekmedium dat vijf tot 10 milligram drooggewicht van de algen bevat naar een glazen centrifugebuis.

Bereken de exacte hoeveelheid overgedragen biomassa met behulp van de eerder bepaalde biomassaconcentratie en centrifugeer het monster vijf minuten bij 1200 Gs. Verwijder een deel van het supernatant, waarbij ongeveer 0,25 milliliter in de buis achterblijft. Resuspendeer vervolgens de algen in het resterende supernatant door het pellet voorzichtig met een pipet op en neer te zuigen, en breng het celmengsel over naar een beadbeater-buis.

Spoel met een 200 µL pipet de centrifugebuis en de pipetpunt spoelen met ± 0,15 mL milli-Q water en breng de vloeistof over naar de bead beater-buis. Centrifugeer de bead beater-buis gedurende één minuut op maximaal toerental om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen onderin de buis achterblijven. Lyofiliseer het materiaal in de buis vervolgens volgens deze procedure.

Bereid een oplossing van 50 milligram per liter trip Penta Deano in een versterkte volumeverhouding van chloroform tot methanol. Voeg met een positive-displacement pipet één milliliter van de tripod, no-oplossing toe aan de bead-tube. Controleer of er geen beads achtergebleven zijn in de dop van de bead-beater tube, aangezien dit kan leiden tot lekkage van de beads uit de tube.

Behandel de beadbeaterbuis acht keer bij 2 500 RPM gedurende elk 60 seconden, met een interval van 12 seconden tussen elke beading-cyclus. Draag vervolgens de oplossing met beads over van de beadbeaterbuis naar een schone, hittebestendige glazen centrifugebuis van 15 milliliter met een Teflon inzet-schroefdop. Was de beadbeaterbuis met één milliliter van de tripod, no-oplossing en voeg het waswater toe aan de glazen centrifugebuis.

Herhaal dit nog twee keer. Vortex het monster vijf seconden en soniciseer het vervolgens 10 minuten. Voeg na de sonicatie 2.5 milliliters van een pH zeven milli cube wateroplossing met 50 millimolar triss en één molar natriumchloride toe aan de centrifugebuis.

Zodra het monster is gevortexd en voor een tweede keer is gesoniceerd, wordt het gedurende vijf minuten gecentrifugeerd bij 1200. Zet daarna voorzichtig de onderste chloroformafscheiding over naar een schone glazen buis met behulp van een glazen Pasteurpipet en herhaal de extractie met één milliliter chloroform. Verzamel na voltooiing de chloroformafscheiding met een glazen Pasteurpipet en voeg deze samen met de eerste chloroformfractie.

Verdampt het chloroform met een stroom stikstofgas om de gedroogde geëxtraheerde lipiden te verkrijgen. Voeg vervolgens drie milliliter methanol met 5% zwavelzuur toe aan de buis met de gedroogde geëxtraheerde lipiden en sluit deze stevig af. Vortex het monster gedurende vijf seconden.

Incubeer de monsters gedurende drie uur bij 70 °C in een blokverwarmer. Controleer periodiek of de monsters niet koken en vortex de buis telkens nadat de monsters zijn gecontroleerd. Zodra het monster is afgekoeld tot kamertemperatuur, worden drie milliliter milli-Q water en drie milliliter n-hephaan aan de buis toegevoegd, gevolgd door vortex-menging.

Agiteer het monster gedurende 15 minuten met een reageerbuisrotator. Na het verwijderen van de monsters uit de reageerbuisrotator, centrifugeert u deze vijf minuten bij 1200 Gs. Collecteer met een glazen pipet twee milliliters van de bovenste hexaanfase en breng deze over naar een schoon glazen buisje. Om de verzamelde hexaanfase te wassen, voegt u twee milliliters milli Q water toe aan het glazen buisje.

Vortex vervolgens het monster gedurende vijf seconden en centrifugeer het gedurende vijf minuten. Transfer bij 1200 Gs de hexaanfase vanuit de glazen buis naar een GC-vial met behulp van een glazen pastierpipet. Plaats daarna een dop op de GC-vial en draai deze vast om verdamping van het oplosmiddel te voorkomen.

Plaats het monsterflesje in de autosampler van het GC-instrument. Analyseer tot slot het monster op het instrument met een nieuwe capillaire kolom, gebruikmakend van een totale flow van 20 milliliters per minuut en een injectievolume van één microliter. Raadpleeg het tekstprotocol voor de kolomspecificaties en chromatografische condities.

Een typisch chromatogram dat via dit proces wordt verkregen, wordt hier getoond. Vetzuurmethylesters worden door de GC-kolom gescheiden op basis van grootte en verzadigingsgraad; bij het gebruikte protocol hebben vetzuren met een kortere ketenlengte en meer verzadigde vetzuren kortere retentietijden. De gebruikte GC-kolom en het protocol zijn niet bedoeld om vetzuurisomeren te scheiden, maar dit zou kunnen worden bereikt door gebruik te maken van een andere GC-kolom en een ander protocol.

Het vetzuurgehalte en de vetzuursamenstelling van C Desus UEX 3 93 onder zowel stikstofvoldoende als stikstofarme omstandigheden worden hier weergegeven. De totale vetzuurgehaltes waren respectievelijk 8,6 ± 0,5% onder stikstofrijke en 44,7 ± 1,7% onder stikstofarme kweekomstandigheden. Deze waarden tonen aan dat de vetzuursamenstelling en het vetzuurgehalte sterk worden beïnvloed door stikstoftekort.

In ESBL zijn palmitinezuur en oliezuur de twee meest voorkomende vetzuren. Raadpleeg het tekstprotocol voor details over het berekenen van het vetzuurgehalte en de samenstelling. Het vetzuurgehalte en de samenstelling van Odum Trico UEX 6 4 0 onder zowel stikstofrijke als stikstofarme omstandigheden worden hier getoond.

Net als bij schuine UU's worden het vetzuurgehalte en de samenstelling sterk beïnvloed door stikstoftekort. Onder stikstofvoldoende en stikstofarme omstandigheden waren de totale vetzuurgehaltes respectievelijk 11,7 ± 0,9% en 30,5 ± 1,1%. P trium produceert ook aanzienlijke hoeveelheden sterk onverzadigde vetzuren, zoals I csap, Penta IC-zuur.

Daarnaast kunnen met deze methode ook zeer lange-keten vetzuren, zoals lignerzuur, worden aangetoond. Deze procedure kan worden uitgebreid door een stap voor de scheiding van lipidestolsels op te nemen tussen de lipidextractie en de transesterificatiestap, om aanvullend inzicht te verkrijgen in de samenstelling van de lipidklassen van micro LG, zoals beschreven in de referenties in de protocoltekst.