Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Het algemene doel van deze procedure is om patch clamp opnames uit te voeren van maximaal 12 cellen in whole cell modus. Dit wordt bereikt door eerst de positie van elke cel van belang te markeren en elke cel een pipet toe te wijzen. De tweede stap is om de punt van elke pipet te lokaliseren en de pipetten automatisch naast hun toegewezen cellen te verplaatsen.

Vervolgens benadert u elke cel met één pipet tegelijk. Om strakke verzegelingen met het celmembraan tot stand te brengen, is de laatste stap het scheuren van het membraan van de cellen en het uitvoeren van whole cell opnames. Uiteindelijk wordt computerondersteunde multi-elektrode patch clamp opname gebruikt om de netwerkeigenschappen van kleine neuronale circuits met hoge resolutie te tonen.

Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals handmatige patch clamp is dat het aantal verbindingen dat in een netwerk kan worden waargenomen, groeit met het kwadraat van het aantal neuronen dat wordt opgenomen. Visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk omdat de patch clamp stappen moeilijk te leren kunnen zijn vanwege de complexiteit en de snelheid waarmee ze moeten worden uitgevoerd. Begin deze procedure door een herfsnede met het gebied van belang in het midden van het verplaatsingsbereik van de microscoop te plaatsen.

Identificeer vervolgens de cellen van belang. Sla vervolgens de positie van de cellen op op basis van het microscoop coördinatensysteem. De grafische interface geeft de geselecteerde cellen en de micropipetten weer voor een globaal overzicht, en de software voegt een markering toe op de celpositie die op de afbeeldingen wordt gelegd.

Daarnaast wordt een afbeelding van de cel vastgelegd voor toekomstig gebruik. Nadat de cellen van belang zijn geselecteerd, wijst u de pipetten toe die zullen worden gebruikt om de afzonderlijke cellen op te nemen door de toewijzingscontroles in de grafische interface in te stellen. Visualiseer een voorbeeld van de uiteindelijke configuratie door het selectievakje te selecteren dat de uiteindelijke posities toont.

Bereid nu de pipetten voor met intracellulaire oplossing en plaats ze op hun houders. Plaats de hoofdtrappen in hun bevestigingen, maar schuif ze niet naar voren. Om te voorkomen dat de badtip met de punt van de pipet raakt, schakel de positieve drukkregeling in en selecteer alle pipetten.

Om ervoor te zorgen dat de punten schoon blijven, schuift u elke hoofdtrap voorzichtig op zijn plaats. Positioneer vervolgens de microscoop op een centrale positie met de focus van twee millimeter boven de plak door de R twee knop in te drukken terwijl u knop A ingedrukt houdt. Gebruik de overeenkomstige positie voor elke manipulator zoals opgeslagen uit het vorige experiment door de L twee knop in te drukken terwijl u knop A ingedrukt houdt. Op dit punt zou er ofwel een duidelijke schaduw van de pipet in zicht moeten zijn ofwel een kleine beweging langs de as van de pipet moet genoeg zijn om het te observeren. Compensatie voor de lichte verschillen in pipetvorm moet handmatig worden uitgevoerd.

Breng vervolgens de pipettip in focus. Plaats vervolgens de tip op het rode centrale punt van het videoscherm. Zonder de microscoop te verplaatsen, informeert u de software dat de pipet in het midden van het scherm staat door de Z knop in te drukken terwijl u knop C van de controller ingedrukt houdt.

Nadat de punt van de individuele pipet is gevonden, stuurt u die pipet naar achteren, zodat de volgende kan worden gevonden door de L een knop in te drukken terwijl u knop a ingedrukt houdt. Zodra alle pipetpunten precies zijn geplaatst en elke pipet aan een cel is toegewezen. Positioneer de pipetten automatisch dicht bij hun respectieve cellen door eenvoudigweg met de rechtermuisknop op het centrum van de groep cellen in het grafische weergavevenster te klikken en de optie cluster te selecteren in het pop-upmenu.

Selecteer in het clusteroptiesvenster alle pipetten die u op dit moment wilt positioneren en klik op gaan met de gecontroleerde pipetten. Herhaal deze procedure voor elke cluster van cellen van belang. Om de laatste nadering uit te voeren, specificeert u de positie van de pipetten ten opzichte van de cellen als 200 micron van de cel weg in de as van de pipet en 200 micron erboven in de verticale richting, wat voldoende is om de pipettip buiten het weefsel te houden.

Wacht vervolgens tot de positionering van de pipetten is voltooid. Vervolgens beweegt u de microscoop naar de pipet door de R een knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Herkalibreer elke pipetpositie door de microscoop op de punt ergens in het videobeeld te focussen en de B knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Er zou kort een vierkant raster moeten verschijnen die de geïdentificeerde positie van de pipet aangeeft. Als de positie niet correct is, plaatst u de punt op het centrale punt van het videobeeld en drukt u de Z knop in terwijl u knop C van de controller ingedrukt houdt.

Bevestig nu dat de cel van belang voor de huidige pipet correct is gemarkeerd, actief gemarkeerd. Anders verplaatst u de microscoop om de cel van belang overeen te laten komen met de centrale rode stip markeert de cel door de Y knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Druk vervolgens op de L twee knop terwijl u knop C ingedrukt houdt. Om de pipet 200 micron weg van zijn toegewezen cel te positioneren, zal de microscoop automatisch naar de overeenkomstige positie bewegen. Pas de pipetpositie aan zodat deze overeenkomt met de rode stip.

Pas vervolgens de pipetverplaatsing aan door de R een knop in te drukken. Terwijl u knop x ingedrukt houdt. Activeer de testpuls door de L een knop in te drukken terwijl u knop x ingedrukt houdt.

Beweeg vervolgens langzaam de pipet naar zijn toegewezen cel. Bij het waarnemen van de vorming van een kuiltje op het oppervlak van het celmembraan, brengt u een korte puls van negatieve druk aan door de Y knop in te drukken terwijl u knop Z ingedrukt houdt om de toegepaste druk de cel te laten bereiken. Een houdpotentiaal van ongeveer negatief 65 millivolt moet op dit punt worden ingesteld door