Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System
October 18th, 2013
Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.
Het algemene doel van deze procedure is om patch clamp opnames uit te voeren van maximaal 12 cellen in whole cell modus. Dit wordt bereikt door eerst de positie van elke cel van belang te markeren en elke cel een pipet toe te wijzen. De tweede stap is om de punt van elke pipet te lokaliseren en de pipetten automatisch naast hun toegewezen cellen te verplaatsen.
Vervolgens benadert u elke cel met één pipet tegelijk. Om strakke verzegelingen met het celmembraan tot stand te brengen, is de laatste stap het scheuren van het membraan van de cellen en het uitvoeren van whole cell opnames. Uiteindelijk wordt computerondersteunde multi-elektrode patch clamp opname gebruikt om de netwerkeigenschappen van kleine neuronale circuits met hoge resolutie te tonen.
Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals handmatige patch clamp is dat het aantal verbindingen dat in een netwerk kan worden waargenomen, groeit met het kwadraat van het aantal neuronen dat wordt opgenomen. Visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk omdat de patch clamp stappen moeilijk te leren kunnen zijn vanwege de complexiteit en de snelheid waarmee ze moeten worden uitgevoerd. Begin deze procedure door een herfsnede met het gebied van belang in het midden van het verplaatsingsbereik van de microscoop te plaatsen.
Identificeer vervolgens de cellen van belang. Sla vervolgens de positie van de cellen op op basis van het microscoop coördinatensysteem. De grafische interface geeft de geselecteerde cellen en de micropipetten weer voor een globaal overzicht, en de software voegt een markering toe op de celpositie die op de afbeeldingen wordt gelegd.
Daarnaast wordt een afbeelding van de cel vastgelegd voor toekomstig gebruik. Nadat de cellen van belang zijn geselecteerd, wijst u de pipetten toe die zullen worden gebruikt om de afzonderlijke cellen op te nemen door de toewijzingscontroles in de grafische interface in te stellen. Visualiseer een voorbeeld van de uiteindelijke configuratie door het selectievakje te selecteren dat de uiteindelijke posities toont.
Bereid nu de pipetten voor met intracellulaire oplossing en plaats ze op hun houders. Plaats de hoofdtrappen in hun bevestigingen, maar schuif ze niet naar voren. Om te voorkomen dat de badtip met de punt van de pipet raakt, schakel de positieve drukkregeling in en selecteer alle pipetten.
Om ervoor te zorgen dat de punten schoon blijven, schuift u elke hoofdtrap voorzichtig op zijn plaats. Positioneer vervolgens de microscoop op een centrale positie met de focus van twee millimeter boven de plak door de R twee knop in te drukken terwijl u knop A ingedrukt houdt. Gebruik de overeenkomstige positie voor elke manipulator zoals opgeslagen uit het vorige experiment door de L twee knop in te drukken terwijl u knop A ingedrukt houdt. Op dit punt zou er ofwel een duidelijke schaduw van de pipet in zicht moeten zijn ofwel een kleine beweging langs de as van de pipet moet genoeg zijn om het te observeren. Compensatie voor de lichte verschillen in pipetvorm moet handmatig worden uitgevoerd.
Breng vervolgens de pipettip in focus. Plaats vervolgens de tip op het rode centrale punt van het videoscherm. Zonder de microscoop te verplaatsen, informeert u de software dat de pipet in het midden van het scherm staat door de Z knop in te drukken terwijl u knop C van de controller ingedrukt houdt.
Nadat de punt van de individuele pipet is gevonden, stuurt u die pipet naar achteren, zodat de volgende kan worden gevonden door de L een knop in te drukken terwijl u knop a ingedrukt houdt. Zodra alle pipetpunten precies zijn geplaatst en elke pipet aan een cel is toegewezen. Positioneer de pipetten automatisch dicht bij hun respectieve cellen door eenvoudigweg met de rechtermuisknop op het centrum van de groep cellen in het grafische weergavevenster te klikken en de optie cluster te selecteren in het pop-upmenu.
Selecteer in het clusteroptiesvenster alle pipetten die u op dit moment wilt positioneren en klik op gaan met de gecontroleerde pipetten. Herhaal deze procedure voor elke cluster van cellen van belang. Om de laatste nadering uit te voeren, specificeert u de positie van de pipetten ten opzichte van de cellen als 200 micron van de cel weg in de as van de pipet en 200 micron erboven in de verticale richting, wat voldoende is om de pipettip buiten het weefsel te houden.
Wacht vervolgens tot de positionering van de pipetten is voltooid. Vervolgens beweegt u de microscoop naar de pipet door de R een knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Herkalibreer elke pipetpositie door de microscoop op de punt ergens in het videobeeld te focussen en de B knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Er zou kort een vierkant raster moeten verschijnen die de geïdentificeerde positie van de pipet aangeeft. Als de positie niet correct is, plaatst u de punt op het centrale punt van het videobeeld en drukt u de Z knop in terwijl u knop C van de controller ingedrukt houdt.
Bevestig nu dat de cel van belang voor de huidige pipet correct is gemarkeerd, actief gemarkeerd. Anders verplaatst u de microscoop om de cel van belang overeen te laten komen met de centrale rode stip markeert de cel door de Y knop in te drukken terwijl u knop C ingedrukt houdt. Druk vervolgens op de L twee knop terwijl u knop C ingedrukt houdt. Om de pipet 200 micron weg van zijn toegewezen cel te positioneren, zal de microscoop automatisch naar de overeenkomstige positie bewegen. Pas de pipetpositie aan zodat deze overeenkomt met de rode stip.
Pas vervolgens de pipetverplaatsing aan door de R een knop in te drukken. Terwijl u knop x ingedrukt houdt. Activeer de testpuls door de L een knop in te drukken terwijl u knop x ingedrukt houdt.
Beweeg vervolgens langzaam de pipet naar zijn toegewezen cel. Bij het waarnemen van de vorming van een kuiltje op het oppervlak van het celmembraan, brengt u een korte puls van negatieve druk aan door de Y knop in te drukken terwijl u knop Z ingedrukt houdt om de toegepaste druk de cel te laten bereiken. Een houdpotentiaal van ongeveer negatief 65 millivolt moet op dit punt worden ingesteld door
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel bespreekt de automatisering van multi-elektrode patch-clamp opnames, waarbij wordt benadrukt hoe dit de efficiëntie en kwaliteit van neuronale opnames verbetert. De procedure maakt het mogelijk om tot 12 cellen in de whole cell-modus op te nemen, wat de studie van kleine neuronale circuits vergemakkelijkt.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschap
- Celbiologie
Achtergrond
- Multi-elektrode patch-clamp opnames zijn complex en tijdrovend.
- Automatisering kan de snelheid en kwaliteit van deze opnames verbeteren.
- Het begrijpen van neuronale circuits is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Deze methode maakt hoge resolutie analyse van netwerkeigenschappen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om het proces van multi-elektrode patch-clamp opnames te automatiseren.
- Om de prestaties en hoeveelheid opnames te verbeteren.
- Om de studie van neuronale circuiteigenschappen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Het markeren van de positie van elke cel van belang.
- Het toewijzen van een pipet aan elke cel.
- Het automatisch bewegen van pipetten naar toegewezen cellen.
- Het vestigen van strakke afdichtingen en het uitvoeren van whole cell opnames.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle automatisering van het patch-clamp proces.
- Verbeterde efficiëntie bij het opnemen van meerdere cellen.
- Hoge resolutie gegevens over kleine neuronale circuits.
- Aangetoonde netwerkeigenschappen van neuronen.
Conclusies
- Automatisering verbetert de patch-clamp opnamecapaciteiten aanzienlijk.
- Deze methode kan leiden tot een beter begrip van neuronale netwerken.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden in verschillende neurowetenschappelijke onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multi-electrode patch-clamp systems enable high-resolution mapping of neuronal network connectivity, a critical step in target validation for CNS drug discovery. By increasing throughput and reliability of electrophysiological recordings, this approach supports mechanistic de-risking of synaptic modulators and network-modulating compounds. The computer-assisted interface reduces operator-dependent variability, improving data consistency for lead optimization decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic connectivity and circuit-level phenotypes in disease-relevant neuronal preparations.
- Operational Value: Increases recording yield per experiment, reducing time and resource investment per data point.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets by measuring direct physiological effects on network dynamics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative electrophysiological readouts (e.g., IPSC amplitude, seal formation) suitable for compound screening cascades.
- Reproducibility: Standardized pipette positioning and pressure controls minimize well-to-well variability across multi-electrode arrays.
- Scalability: Capacity to record up to 12 cells simultaneously enables dose-response profiling across interconnected neuronal populations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Recordings from layer 5 pyramidal neurons in brain slices support translational validity for cortical circuit disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of polysynaptic recruitment and inhibition patterns (e.g., Martinotti cell mediation) to predict off-target circuit effects.
- Translational Continuity: Connectivity mapping provides a biomarker-aligned readout for assessing compound impact on network homeostasis.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement validation to preclinical mechanism of action studies, particularly for compounds modulating synaptic transmission or neuronal excitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of synaptic protein targets by measuring functional consequences on connected neurons.
- Screening: Enables assay standardization through automated pipette alignment and test pulse validation, improving Z'-factor potential.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables such as holding potential, seal resistance, and postsynaptic current amplitude for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links molecular perturbations to emergent network properties like small-world clustering and common neighbor effects.
- Enterprise Reuse: Centralized software interface allows cross-project standardization across electrophysiology teams and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by revealing poly-synaptic mechanisms and circuit-level compensation.
- Operational Value: Reduces hands-on time per recording and increases success rate through guided visual feedback and error-proofing steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early insight into network-level drug effects beyond single-cell physiology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate specific connectivity patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, neuronal slicing, and patch-clamp technique.
- Depends on compatible microscope, manipulator, and pressure control systems integrated with custom software.
- Necessitates standardization of cell identification, pipette assignment, and positioning protocols across users.
- Adaptation to disease models requires validation of neuronal health and slice viability in the preparation.
- Limited by the physical accessibility of target brain regions and the health of neurons in acute slices.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Cell Selection
2:23
Prepare the Pipettes and Locate the Pipette Tips
4:07
Approaching the Cells
5:38
Establish the Cell-attached and Whole-cell Configuration for Recording
7:58
Results: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System
10:16
Conclusion
