Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Het algemene doel van deze procedure is om intacte eiwitten groter dan 100 kilodalton op een gevoelige manier te analyseren door middel van MALDI-massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst de matrixoplossingen voor te bereiden. De tweede stap is het aanbrengen van de dunne laagoplossing op het doelwit.

Vervolgens worden het monster en het mengsel van matrices op het doelwit aangebracht. De laatste stap is het observeren van de monsterspotjes onder de microscoop. Uiteindelijk wordt een multi-tot-massaspectrometer gebruikt om intacte eiwitten te analyseren en massaspectra op te nemen.

Het belangrijkste voordeel van MALDI-massaspectrometrie boven andere analytische benaderingen, zoals elektrospray-ionisatie, is dat het toleranter is voor zout, verontreiniging en detergentia. Een ander voordeel van MALDI is dat het ionen genereert met minder ladingen in vergelijking met elektrospray. Daarom is het verwerven en interpreteren van MDI-gegevens vrij eenvoudig.

Om met de rech-kristallisatie te beginnen, giet u 10 milliliter 40% ethanol in een Pyrex-que. Verwarm vervolgens 600 milligram van een matrix in een waterbad met een weerstandsverhitter. Warm de matrixoplossing op en roer totdat de matrix volledig is opgelost.

Herhaal de vorige stappen totdat de oplossing verzadigd is. Laat de oplossing enkele uren langzaam afkoelen op kamertemperatuur en bewaar deze vervolgens een nacht bij vier graden Celsius. Als er geen kristallen zijn gevormd, krast u het binnenste van de beker net onder het oplossingsoppervlak met een glazen staaf om kristallisatie te induceren.

Verzamel ten slotte de matrixkristallen door middel van filtratie. Spoel de resterende kristallen in de kolf met een minimale hoeveelheid ijskoud oplosmiddel en filtreer ze. Zodra de filtratie voltooid is, laat u de kristallen drogen om de MALDI-doelplaat schoon te maken.

Spoel het met methanol en veeg het voorzichtig af met een kim-doekje. Spoel het vervolgens met water en veeg het af met een kim-doekje. Plaats de MALDI-doelplaat in een beker van 600 milliliter en bedek deze met 50% ethanol.

Ultrasoon behandel de doelplaat vervolgens 10 minuten in de ethanoloplossing in een ultrasone bad. Als er nog restanten op de plaat aanwezig zijn, herhaalt u de vorige stappen. Spoel de doelplaat af met methanol of water, de gebruikte oplosmiddel bepaalt hoeveel het monster zich verspreidt.

Kanteel vervolgens de doelplaat zodat al het vocht op een Kim-doekje wordt verzameld. Droog de doelplaat met behulp van een stroom stikstofgas. In de volgende stap lost u alpha CHCA op in aceton.

Om een verzadigde oplossing te maken, doopt u een pipettip van 10 microliter in de verzadigde alpha CHCA-oplossing zodat een kleine hoeveelheid van de oplossing in de tip stroomt. Raak de MALDI-doelplaat snel aan met de pipettip om de alpha CHCA-oplossing op de MALDI-doelplaat af te zetten met behulp van een kunststof buis van 1,5 milliliter. Bereid een oplossing van 20 milligram per milliliter alpha CHCA door alpha CHCA op te lossen in een zeven-tot-drie volumeverhouding van acetonitril tot 5% formijnzuur, en label de oplossing als alpha CHCA-oplossing.

Bereidt vervolgens een oplossing van 20 milligram per milliliter DHB voor door DHB op te lossen in een zeven-tot-drie volumeverhouding van acetyl nitril tot 0,1% Tri fluoro azijnzuur, en label de oplossing als DHB-oplossing. Meng de alpha CHCA-oplossing en de DHB-oplossing in een een-op-een volumeverhouding. Om de C-H-C-A-D-H-B-oplossing te verkrijgen voordat u met deze procedure begint, is het een optionele stap om de eiwitmonsters te zuiveren door middel van bufferuitwisseling, zoals weergegeven in de vermelde referentie.

Anders zet u een ongezuiverd eiwitmonster af op de MALDI-doelplaat. Deponeer vervolgens 0,5 microliter van het eiwitmonster op de voorbereide alpha CHCA-dunne laag. Voeg onmiddellijk daarna 0,5 microliter van de C-H-C-A-D-H-B-oplossing toe.

Deponeer 0,5 microliter van de Cain-standaard op de MALDI-plaat en voeg vervolgens 0,5 microliter van de matrixoplossing toe. Zodra de monsters en de cain zijn opgedroogd, kunt u de vlekken onder een microscoop observeren, de doelplaat in het instrument plaatsen en de juiste instrumentinstelling kiezen. Kies vervolgens het juiste massatot-ladingsverhoudingsbereik.

Verwerf de spectra van de ca en kalibreer het instrument met de juiste laserintensiteit. Verwerf de spectra van de eiwitmonsters. MALDI toff-analyse van een intact chromosoomgebied met behoud van één eiwit wordt hier getoond.

De C-H-C-A-D-H-B-mengsel leverde massaspectra van hogere kwaliteit op in termen van signaal-ruisverhouding en gevoeligheid. In het bijzonder kon 0,5 picomol eiwit dat op de MALDI-doelplaat was afgezet, worden gedetecteerd, terwijl dezelfde hoeveelheid eiwit nauwelijks detecteerbaar was. Met behulp van SINO NIC-zuur met behulp van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel, werden meervoudig geladen ionen van het eiwit waargenomen, waardoor de massa met hogere nauwkeurigheid kon worden bepaald, omdat de piekresolutie omgekeerd evenredig is met de master-ladingsverhouding in het geval van een axiaal multi-toff-instrument. Bovendien, met behulp van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel, was onze voorkeursmethode voor de matrixdeposities de dunne laagbenadering.

Met behulp van de opgedroogde druppelmethode werden eiwitten met een massa hoger dan 100 kilodalton niet gedetecteerd. Het monomere beta collectaase-eiwit werd ook geanalyseerd door multi TOF. De C-H-C-A-D-H-B-spectra waren beter dan de SINO NIC-zuurspectra in termen van gevoeligheid en resolutie.

Bovendien maakte de aanwezigheid van meervoudig geladen ionen bevestiging van de massa van het eiwit met hogere nauwkeurigheid mogelijk. MALDI to-analyse van een intact immunoglobuline wordt hier getoond. De spectra die met be