Name: Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer MALDI-TOF massaspectrometrie voor analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa. Deze methode toont verbeterde gevoeligheid en tolerantie voor verontreinigingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Christophe Masselon (iRTV, CEA, Grenoble) en leden van de virale infectie en kanker Group op de IBS, voor hun kritische beoordeling van het manuscript en voor nuttige discussies. We zijn dankbaar voor Cyril Dian voor het soort geschenk van het eiwit CRM1. Dit wetenschappelijk werk vond plaats in de massaspectrometrie faciliteit van Grenoble Instrueer Centre (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Het werd financieel ondersteund door de Franse infrastructuur voor Integrated Structural Biology Initiative (Frisbi, ANR-10-InSb-05-02), GRAL (ANR-10-LabX-49-01) [binnen de Grenoble Partnerschap voor Structurele Biologie] en door het Franse Nationale Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS).

1. Eiwitmonster Bereiding: Buffer Exchange (optioneel) 5-25 ul van micromolaire concentraties eiwit (1 tot 20 uM) noodzakelijk. Buffer uitwisseling kan worden uitgevoerd middels centrifugale ultrafiltratie (bijv. Vivaspin, Sartorius) of microcentrifuge gelfiltratiekolommen (bijvoorbeeld Micro Bio-Spin 6 chromatografiekolommen, Bio-Rad) 29,30. Stappen buffer uitwisseling kan worden herhaald 2-3x. Gedetailleerde beschrijving van bufferuitwisseling werd eerder gepresenteerd 29,30. Zo maken we 20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris di) pH 8 buffer als definitief. Opmerking: Deze stap kan worden overgeslagen in veel gevallen. Er moet worden uitgevoerd als een eiwit monstermoleculen of buffers die sterk kunnen verstoren MS detectie bevat [bv. glycerol, 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur, HEPES]. Het is ook nuttig om de qu verbeterenliteit van de spectra. 2. Herkristallisatie van Matrices om hun Zuiverheid (optioneel) Improve <ol><li> Giet 10 ml 40% ethanol (EtOH) in een Pyrex kolf. </li><li> Voeg 600 mg van een matrix. </li><li> Met behulp van een waterbad en een verwarmingselement, warm de matrix oplossing en roer totdat de matrix volledig is opgelost met behulp van een glazen staaf of een magneetroerder. </li><li> Herhaal stap 2 tot je een verzadigde oplossing. </li></ol> Opmerking: Het gebruik van een te groot volume oplosmiddel of oplossen van de matrix ver onder het kookpunt van de oplossing een slechte opbrengst van kristallen of kristallen niet helemaal veroorzaken. <ol start="5"><li> Laat de oplossing langzaam afkoelen. Laat je hem gewoon bij kamertemperatuur gedurende enkele uren en dan bij 4 ° C gedurende de nacht. Opmerking: Als geen kristallen gevormd, kan kristallisatie worden geïnduceerd door krassen op de binnenzijde van de beker (net onder het oppervlak oplossing) met een glazen roerstaaf. </li><li> Verzamel de matrix kristallen afgefiltreerd. </li><li> De kristallen spoelen met een minimale hoeveelheid ijskoude oplosmiddel en filtreren hen. </li><li> Laat de kristallen te drogen. U kunt vacuum gebruiken voor deze stap. </li></ol> 3. Reiniging van MALDI RVS Doel <ol><li> Spoel de MALDI plaat met methanol (MeOH) en veeg voorzichtig met een reinigingsdoekje speciaal gemaakt voor laboratorium toepassingen (bijv. Kimwipe). </li><li> Spoel de doelgroep met H 2 O en schoon met een reinigingsdoekje. </li><li> Plaats de MALDI plaat in een bekerglas van 600 ml en dek het af met 50% EtOH. </li><li> Ultrasone trillingen het doel in het EtOH oplossing gedurende 10 minuten in een ultrasoonbad. </li><li> Als er resten nog op de plaat, herhaalt u de stappen nogmaals 1-4. </li><li> Spoel ten slotte het doel met MeOH (of met water, zie de opmerking hieronder), kantel het op een manier die alle vloeistof wordt verzameld op een reinigingsdoekje. Laat het doel drogen bij kamertemperatuur of met een stikstof-gasstroom. </li></ol> Opmerking: Een soortgelijke procedure is eerder beschreven 15. Opmerking: Het oplosmiddel (MeOH of water) gebruikt voor de laatste spoeling van de doelgroep bepaalt aantal doelgebieden functies. Als het doel gespoeld met MeOH, het monster spreidt op het doel veel meer dan bij water. 4. α-CHCA Dunnelaagproces Oplossing: Voorbereiding en depositie op de MALDI Target <ol><li> Los α-CHCA in aceton om een ​​verzadigde oplossing te maken. </li><li> Met de hand (zonder pipet) dip een 10 ul tip (bv. GELoader Tip, Eppendorf) in α-CHCA verzadigde oplossing: een kleine hoeveelheid van de oplossing zal stromen in de punt (als gevolg van capillaire werking). </li><li> Raak zeer snel (dwz 1 sec) de MALDI doel met pipet en breng de α-CHCA acetonoplossing op de MALDI doel. Dit zal de matrix dunne laag, waarbij het eiwit vormtmonster zal worden gestort. Probeer een dunne laag vlek zo klein mogelijk te genereren. </li></ol> Opmerking: Bij het ​​gebruik van SA als matrix, bereiden we een dunne laag met behulp van een verzadigde oplossing van SA in aceton. 5. Voorbereiding van Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB en CHCA_DHB Mengsel 25 <ol><li> Bereid een 20 mg / ml oplossing SA in ACN 0,1% TFA (70:30, vol / vol). </li><li> Bereid 20 mg / ml α-CHCA oplossing ACN en 5% mierenzuur (70:30, vol / vol) [genoemd als &quot;α-CHCA oplossing&quot;]. </li><li> Bereid een 20 mg / ml oplossing DHB in ACN en 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) (70:30, vol / vol) [genoemd als &quot;DHB oplossing&quot;]. </li><li> Mix &quot;α-CHCA oplossing&quot; en &quot;DHB oplossing&quot; in 1:1 verhouding (vol / vol), de &quot;CHCA_DHB oplossing&quot; te vinden. </li></ol> Opmerking: Men kan &quot;α-CHCA oplossing&quot; en &quot;DHB oplossing&quot; te mengen in verschillende verhoudingen, bij het ​​analyseren van eiwitten met massa van minder dan 100 kDa. Voor EXAmple een verhouding van 40:60 tussen α-CHCA en DHB (vol / vol) levert een betere resolutie, maar minder gevoeligheid (zie bespreking). 6. Monster Afzetting op de MALDI Target <ol><li> Borg 0,5 ul van het eiwit monster op de eerder bereide α-CHCA dunne laag. Direct daarna, voeg 0,5 ul van de matrix oplossing (dwz de SA oplossing of de α-CHCA oplossing of de &quot;CHCA_DHB mix&quot;). Dit impliceert het mengen van het monster en de matrix op het doel. </li></ol> Opmerking: Meestal mengt het eiwit monster met de matrix in een 1:1 verhouding. Deze verhouding is van cruciaal belang voor de goede kwaliteit van de MALDI spectra. Als u wilt verschillende concentraties in het monster te testen, kunt u de ACN_formic zure oplossing (zoals hierboven beschreven) te gebruiken om het monster te verdunnen. Opmerking: Als u wilt, kunt u het monster en de matrix in een buis te mengen en storten dan de gemengde &quot;sample_matrix oplossingentie &quot;op de dunne laag. Opmerking: Wij raden u aan om verschillende concentraties in het monster testen, omdat het monster te verdunnen kunt u de interferentie van verontreinigende stoffen te verminderen. Om het monster te verdunnen, kunt u de ACN_formic zure oplossing (zoals hierboven beschreven) te gebruiken om het monster te verdunnen. 7. Kalibrant Deposition <ol><li> Borg 0,5 ul van de kalibrant norm (bijv. &quot;eiwitstandaard II&quot;, Bruker Daltonics, Bremen) voeg dan 0,5 ul van de matrix oplossing. </li></ol> Opmerking: Laad de kalibrant op de MALDI plaat naast de eiwitmonster plekken (zie bespreking). 8. MALDI Spectra Overname van Calibrant en eiwitmonsters Zodra de monsters en de kalibrant worden gedroogd, kunt u de &quot;spots&quot; observeren onder een microscoop. Deze waarneming is optioneel en kan vooral interessant zijn om beginners. Om de steekproef spectra te verkrijgen, plaatst the doel in de MALDI-TOF instrument en kies de gewenste instrumentele parameters die verschillend zijn voor elk type apparatuur. Om de meest geschikte set-up te krijgen moet men de aanbevelingen van de fabrikant te volgen. Als algemene overwegingen bij het analyseren van intacte eiwitten, moet men het instrument te gebruiken in lineaire mode (niet in de reflector modus, die geschikt is voor peptiden analyses is). Normaal gesproken maken we gebruik van ons instrument in positieve-ion-modus. Bovendien is een belangrijke parameter is de &quot;gepulseerde ion winning&quot;, die de instrumentale resolutie 31 verbetert. In eenvoudige termen kan de &quot;gepulseerde ionen uitlezen&quot; worden gedefinieerd als een pauze tussen de generatie van de monsterionen en het tijdstip waarop de ionen worden versneld naar de detector. Bij de analyse van intacte eiwitten, moet men gebruik gemaakt van een &quot;pulserende ion extractie&quot; (bijvoorbeeld 500 nsec) groter dan bij het ​​observeren peptiden (bijvoorbeeld 80 nsec). Kies de juiste m / z bereik, het verwerven van de spectra of de kalibrant, en het instrument kalibreren. Wanneer u de spectra van uw monsters te verwerven, gebruik de juiste laser-intensiteit (zie bespreking).

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography+%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science - Taylor & Francis Group. (2010).</li>
<li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li>
<li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li>
<li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li>
<li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular & cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407(2011).</li>
<li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-plate%3A+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li>
<li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Hoffmann%2C+E+%22Mass+Spectrometry%3A+Principles+and+Applications%22">Mass Spectrometry: Principles and Applications</a>. , Wiley. (2007).</li>
<li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10%2C000+daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100%2C000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li>
<li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+of+biopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li>
<li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+sample+preparation%3A+the+ultra+thin+layer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192(2007).</li>
<li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li>
<li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+mass+spectrometry%22%5BJournal%5D)">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li>
<li>Madler, S., Boeri Erba,, E,, Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li>
<li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li>
<li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li>
<li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li>
<li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphite+supported+preparation+%28GSP%29+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+%28CHCA%29+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+%28MALDI-MS%29+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li>
<li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li>
<li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSparkman%2C+DO+%22Mass+Spectrometry+Desk+Reference%22">Mass Spectrometry Desk Reference</a>. , Global View Publishing. (2000).</li>
<li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li>
<li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li>
<li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954(2010).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li>
<li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We presenteerden een gedetailleerd protocol van hoge kwaliteit massa spectra van grote intacte eiwitten te verwerven met moleculaire gewichten groter dan 100 kDa, met behulp van een MALDI-TOF instrument. Een aantal kritische aspecten van de monstervoorbereiding moet zorgvuldig worden overwogen om de kwaliteit van de massaspectra verbeteren. Matrices en oplosmiddelen van hoge zuiverheid zijn kritisch omdat alle in de matrices en oplosmiddelen verontreinigingen worden geconcentreerd op de MALDI doel na verdamping van het oplosmiddel. Om de zuiverheid van de MALDI matrices te verhogen is het mogelijk om ze te zuiveren met behulp van klassieke herkristallisatie methoden (zie hierboven). Wij raden ook aan vers voorbereiding van de matrices oplossingen (minstens een keer per week) aan de matrix kristallisatie te verbeteren en matrix degradatie te voorkomen. De matrix afzetting benadering is zeer kritisch voor de uiteindelijke kwaliteit van de spectra. Zoals hierboven beschreven, de dunne laag werkwijze onze methode of keuze 12. Bovendien hebben we geoptimaliseerd de aanpak voor het deponeren van de eerste laag. Wanneer de matrix wordt opgelost in aceton om een ​​verzadigde oplossing te verkrijgen, het propanon maakt een snelle verdamping van het oplosmiddel, maar maakt ook de grootte van de eerste laag zeer moeilijk te controleren. We raden het gebruik van een GELoader tip zo weinig borstel die je onderdompelen in de matrix_acetone oplossing tot een minimum volume dat u snel storten op het doel te krijgen. De grootte van de eerste laag regelt of andere manier de uiteindelijke grootte van de spot MALDI: een kleine vlek (bijvoorbeeld 0,5-0,75 mm diameter) de voorkeur omdat dan het monster concentratie hoger dan bij een grote vlek. Het verkrijgen van een kleine plek verschilt van de ultra-dunne laag benadering eerder in een JOVE video 15 voorgesteld. In Fenyo et al.. Wordt de dunne laag oplossing verspreid over de MALDI doel met behulp van de zijkant van een pipet tip. Deze aanpak vereist het testen van de dunne laag die specifieke criteria moeten voldoen(Bijvoorbeeld de snelheid van de verdamping van het oplosmiddel). Indien niet aan het criterium wordt voldaan, moet de MALDI doel worden gewassen en een nieuwe dunne laag moet worden voorbereid. Dit maakt de voorbereiding nogal bewerkelijk voor een beginner. Bovendien is de afzetting van monster / matrix mengsel op de plaat moet het streven van de overmaat oplosmiddel met behulp van een vacuüm lijn en een wasstap met behulp van TFA 15 is noodzakelijk, waardoor de Fenyo et al.. Voorbereiding een beetje moeilijker dan onze aanpak. De volumeverhouding tussen de matrix en het monster is heel belangrijk voor een succesvolle analyse van intacte eiwitten door MALDI-TOF. Na het testen van verschillende verhoudingen raden wij u aan een verhouding van 1:1 te gebruiken. Een andere matrix: steekproefproportie kan de kwaliteit van de spectra gevaar, waarschijnlijk door homogene kristallisatie. De volgorde waarin de matrix en monster worden gedeponeerd is ook kritisch. Na afzetten van de matrix dunne laag wordt het monster aangebracht en onmiddellijk na (vóór sample spot wordt droog) de CHCA_DHB mengsel wordt toegevoegd. Deze procedure is gedefinieerd als &quot;sandwich-methode&quot; 27, waarbij alleen het monster wordt aangebracht tussen twee lagen matrix. Als alternatief kan de CHCA_DHB oplossing en het monster gemengd in 0,5 ml buis en vervolgens door aanstippen op CHCA dunne laag 12. Dit levert een plek met een homogene laag van kristallen resulteert in hoge kwaliteit spectra. Bij het ​​analyseren van eiwitten met een massa van minder dan 100 kDa, de concentratie DHB worden verhoogd (bijv. 60:40 DHB: CHCA), dit kan scherpere piek produceren, maar kon de meting gevoeligheid (minder intense pieken) compromitteren. Voor een correcte kalibratie, is het essentieel om de kalibratieoplossing normen vlakbij het monster plaatsen deponeren, zodat men een betere nauwkeurigheid van massa te verkrijgen. Een &quot;pseudo-interne kalibratie&quot; werd eerder gesuggereerd 15: na de overname van een monster spectrum, de kalibrant plek is laser schot en signaal van de kalibrant worden toegevoegd aan het monster spectrum. Hierdoor kunt u intern kalibreren het monster spectrum met behulp van de kalibrant pieken. De laserenergie moeten zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de spectra overname. Meestal hogere energie verhoogt de gevoeligheid, maar verlaagt de resolutie. We raden het gebruik van zo min mogelijk laserenergie, zonder afbreuk te doen aan de gevoeligheid van de overname. Bovendien, om spectrale kwaliteit te verbeteren, kan men meer schoten op elk monster plek te verwerven. Normaal gesproken meer foto u afneemt (1000-2000 schoten), hoe hoger de intensiteit van het signaal. Bij het ​​raken van de plek met de laser, moet men de juiste positie (dwz &quot;sweet spot&quot;) te vinden, omdat het monster niet homogeen verdeeld. U kunt opnamen maken op dezelfde plaats totdat het signaal neemt toe, en dan proberen om een ​​ander gebied met het monster te vinden. Concluderend, hoge zuiverheid van matrices en SOLVouders, het gebruikt voor het monster en matrices depositie op het doel methoden, de positie van de normen die voor de kalibratie, de intensiteit van de laser-energie, het tijdstip van verwerving (aantal opnamen / spot) zijn kritische factoren die men moet rekening houden bij het analyse van intacte eiwitten met MALDI-TOF MS. Auteur Bijdragen LS en EBE ontwierp de experimenten, uitgevoerd de massaspectrometrie-experimenten, de data geanalyseerd en schreef het manuscript.

Structurele biologie is gebaseerd op de productie van hoogwaardige eiwitten 1 en moet daarom worden gekoppeld aan een efficiënte en betrouwbare technieken voor het eiwit analyse 2,3. In onze massaspectrometrie (MS) laboratorium in een instituut van structurele biologie moeten we primaire sequentie van eiwitten bevestigen beoordeelt de aanwezigheid van mutaties en posttranslationele modificaties, de afbraak van eiwitten, het monster homogeniteit en de kwaliteit van isotopische labeling (bijvoorbeeld gedeutereerde eiwitten voor nucleaire magnetische resonantie studies 4). Aangezien structurele biologen gebruiken beperkte proteolyse structureel stijve domeinen onderscheiden van flexibele delen, moeten we betrouwbaar karakteriseren dergelijke afgeknotte eiwitten met behulp van MS. Wanneer biomoleculen worden geanalyseerd door MS, zijn twee mogelijke benaderingen gebruikt om zachtjes te ioniseren dergelijke zware en labiele moleculen. Elektrospray ionisatie (ESI) ioniseert moleculen direct van devloeibare fase 5; matrix-assisted laser desorptie ionisatie (MALDI) vereist dat de biomoleculen zijn co-gekristalliseerd met ultraviolet absorberende organische moleculen (dwz matrixmoleculen) 6. ESI time-of-flight (TOF) MS gekoppeld met vloeistofchromatografie is een routine techniek voor de analyse van intacte eiwitten, omdat hiermee bepaling van de massa met een hoge nauwkeurigheid (≤ 50 ppm). Het is echter zeer gevoelig voor de samenstelling van de monsterbuffer (met name zouten en detergentia) en verontreinigingen (bijvoorbeeld polymeren) die soms moeilijk te elimineren, waardoor de onderdrukking van de analyt signaal. MALDI-TOF MS een doeltreffend alternatief voor ESI-MS, omdat de prestatie wordt minder beïnvloed door buffercomponenten, detergenten en verontreinigingen, en maakt intacte eiwit bepaling van de massa met voldoende nauwkeurigheid (≤ 500 ppm) voor sequentie-validatie. Na protein digestie, MALDI-TOF MS kan ook worden gebruikt om de verkregen peptiden voor verdere primaire sequentie bevestigd analyseren de zogenaamde &quot;peptide mass fingerprinting&quot;. In onze handen, de massa bepaling van intacte eiwitten, die groter dan 100 kDa en heterogeen (door veranderingen of inkortingen) zijn, gemakkelijker door MALDI-MS dan door ESI-MS. Dit is te wijten aan het gebrek aan overlappende laadtoestand distributies aanwezig ESI spectra. Aangezien de MALDI proces niet afhankelijk van de analyt maat 7, dergelijke methode levert hoge gevoeligheid bij een biomolecuul massa boven 100 kDa. Opmerkelijke analyse van intacte eiwitten werden uitgevoerd met zelfgemaakte instrumenten tussen het einde van de jaren 1980 en begin jaren 1990 8-11. MALDI-TOF kan ook worden gebruikt als screeningsmethode om de kwaliteit van eiwitmonsters evalueren omdat het minder tijd voor de monstervoorbereiding en is minder gevoelig voor INTERFERENces te wijten aan gemeenschappelijke verontreinigingen (bijv. zouten). Na een eerste, snelle evaluatie door MALDI-MS, kan een monster nader geanalyseerd door ESI-TOF tot massa te bepalen met een grotere nauwkeurigheid. Bovendien MALDI genereert ionen die minder kosten dan ESI en dus het verwerven en interpreteren van MALDI gegevens wordt eenvoudiger. Hierdoor kunnen studenten die in structurele biologie om hun recombinante eiwitten analyseren net na een korte training. Twee belangrijke factoren beïnvloeden de kwaliteit van de MALDI spectra: de matrix en de techniek voor de matrix afzetting (bijv. gedroogd druppel 8 en dunne 12-16,17,18). Een organische matrix [bijv. sinapinezuur (SA) 19-21 of α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (α-CHCA) 14,22,23] wordt vaak gebruikt voor MS onderzoek van intacte eiwitten en verknoopt eiwitcomplexen . Met behulp van α-CHCA, Chait groep eerder presenteerde een gedetailleerd protocol voor prepareren van een ultra dunne laag voorafgaand aan MALDI analyse van oplosbare en membraaneiwitten 14,15. Onlangs, Gorka et al.. Geïllustreerde grafiet gebaseerde doel coating om de MALDI analyse van peptiden en eiwitten met α-CHCA als matrix 24 te verbeteren. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor de analyse van intacte eiwitten met MALDI-TOF MS, onder toepassing van een mengsel van twee matrices: 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) en α-CHCA 25. We systematisch onderzocht de prestaties van de DHB-CHCA mix opzichte van de SA en α-CHCA matrices voor de bestrijding van intacte eiwitten. De matrix mengsel zorgt voor een betere resolutie (dwz het eiwit pieken zijn veel scherper). Bovendien zal de aanwezigheid van intense meerdere aankopen ionen (bijvoorbeeld M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, enz.) maakt een nauwkeuriger bepaling van de massa omdat de resolutie van axiale MALDI-TOF instrumenten hoger bij lagere massa en lading (m / z) 26. Dit is bijzonder nuttig voor de bepaling molecuulgewicht van eiwitten groter dan 100 kDa. Hogere gevoeligheid is ook bereikbaar via de DHB-CHCA mengsel (0,5 pmol eiwit gespot op de MALDI doel). Zoals we hierboven vermeld, een belangrijke factor die moet worden overwogen bij het gebruik van MALDI instrument is de matrix depositie. Laugesen et al.. Voorgesteld het gebruik van DHB-CHCA mengsel gedurende de eerst 25 gebruikmaking van de gedroogde druppelafzetting. Maar we waargenomen betere resultaten (bijvoorbeeld veel hogere gevoeligheid) wanneer we gebruik gemaakt van de dunne laag methode waarbij de eerste laag wordt gevormd door de α-CHCA opgelost in aceton. De dunne laag werkwijze 12,27 impliceert de vorming van een homogene matrix substraat van kristallen op de MALDI doel die werd beschreven in Jupiter video eerder 15. Vervolgens wordt het monster afgezet op dit substraat, en tenslotteAanvullende matrix afgezet (zie hieronder). In dit artikel hebben we ook laten zien hoe het monster op de MALDI doel te deponeren, maar ook hoe je de doelgroep 15 reinigen, rekristalliseren, en de voorbereiding van de matrices. Tot slot willen we alle noodzakelijke informatie voor de analyse van intacte eiwitten aan wetenschappers (met name structurele biologen) die behoefte hebben om de kwaliteit van de geproduceerde eiwitten te evalueren op een snelle en eenvoudige manier en die zorgen zijn niet zo vertrouwd met MALDI-TOF MS. Zoals voorspeld in het midden van de jaren 1990 28, heeft MS een verhoogde impact op biologisch onderzoek had, als de toegankelijkheid tot biologen is toegenomen. We hopen dat de informatie die we hebben nuttige aan MALDI-TOF toegankelijk voor biologen en wetenschappers die wil beginnen met massaspectrometrie te maken zal zijn.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizima</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6221</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>Sartorius</td><td>VS0122</td><td>various molecular weight cut off</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fluka</td><td>14262</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fluka</td><td>02860</td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td><td>Kimberly Clark</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td><td>Fluka</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>GELoader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030 001.222</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Fluka</td><td>09676</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Protein Standard II</td><td>Bruker Daltonics</td><td>207234</td><td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine </td></tr><tr><td>Immunoglobulin G</td><td>ABSciex</td><td>GEN602151</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td><td>ELGA LabWater</td><td>89204-052</td><td></td></tr><tr><td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF target</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

matrix-laserdesorptie / ionisatie time of flight (maldi-tof) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kda

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectief bepalen van massa&#39;s van eiwitten is essentieel voor vele biologische studies (bijv. voor structurele biologie onderzoeken). Nauwkeurige massabepaling maakt het mogelijk om de juistheid van eiwitten primaire sequenties te evalueren, de aanwezigheid van mutaties en / of post-translationele modificaties, de mogelijke afbraak van eiwitten, het monster homogeniteit en de mate van incorporatie isotoop bij kenmerking (bijvoorbeeld 13 C etikettering ). Electrospray ionisatie (ESI) massa spectrometrie (MS) wordt veel gebruikt voor massa-bepaling van gedenatureerde eiwitten, maar de efficiëntie wordt beïnvloed door de samenstelling van de monsterbuffer. Met name de aanwezigheid van zouten, detergentia en verontreinigingen ernstig ondermijnt de doeltreffendheid van eiwitanalyse door ESI-MS. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) MS is een aantrekkelijk alternatief, vanwege de zouttolerantie en de eenvoud van data-acquisitie en interpretatietie. Bovendien moet de massa bepaling van grote heterogene eiwitten (groter dan 100 kDa) gemakkelijker door MALDI-MS door de afwezigheid van overlappende hoge laadtoestand distributies die aanwezig ESI spectra. Hier presenteren we een toegankelijke benadering voor het analyseren van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-time of flight (TOF). We illustreren de voordelen van een mengsel van twee matrices (dat wil zeggen 2,5-dihydroxybenzoëzuur en α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur) en het nut van de dunne laag Werkwijze benadering monster depositie. We bespreken ook de cruciale rol van de matrix en oplosmiddel zuiverheid van de gebruikte standaarden voor de kalibratie van de laser-energie, en van de overname tijd. Over het algemeen geven we informatie die nodig is om een ​​beginnende voor de analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

We analyseerden een intact eiwit (Chromosome regio onderhoud 1 eiwit, CRM1, molecuulgewicht: 123.386 Da) met twee verschillende matrices, twee depositiemethoden en dezelfde laser intensiteit (Figuur 1). SA en CHCA_DHB mengsel werden gebruikt als matrices. Het mengsel leverde massa spectra van hogere kwaliteit in termen van signaal-ruisverhouding en gevoeligheid (figuren 1A en B). In het bijzonder, kunnen we 0,5 pmol eiwit afgezet op de MALDI doel (figuur 1C) te detecteren. Dezelfde hoeveelheid eiwit was nauwelijks detecteerbaar met SA (figuur 1D). Bovendien, met de matrices mengsel, de werkwijze van keuze voor de matrix depositie was de &quot;dunne&quot; benadering (figuur 1A). De &quot;gedroogde druppel&quot;-methode, we elk eiwit detecteert met een massa groter dan 100 kDa (gegevens niet getoond). Gebruik makend van de CHCA_DHB mengsel (figuren 1A en 1C), meervoudig geladen ionen van de protein waargenomen, waardoor de massa bepaling met grotere nauwkeurigheid omdat de piek resolutie axiale MALDI-TOF instrumenten is omgekeerd evenredig met het m / z 26. We analyseerden ook monomere beta-galactosidase (116.300 Da) (figuur 2). De CHCA_DHB spectra waren beter dan de SA spectra in termen van gevoeligheid en resolutie. Bovendien is de aanwezigheid van meervoudig geladen ionen (M + 2, M 3 + en 4 + M) konden we de massa van het eiwit met hogere nauwkeurigheid (Figuren 2A en 2C) bevestigd. De dunne laag benadering hebben we de uitvoering van de CHCA_DHB mengsel SA en α-CHCA alleen voor de analyse van een immunoglobuline IgG (148.500 Da) (figuur 3). Als we correleren de verschillende gegevens eiwitsignalen hoger en betere resolutie in CHCA_DHB spectra. Tot slot, het gebruik van de CHCA_DHB mengsel en de dunne laag depositie methode<html> vertoonden een significante verbetering van de kwaliteit van grote intacte eiwit massa spectra verkregen met behulp van een MALDI TOF instrument. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Figuur 1. MALDI-TOF analyse van het intacte chromosoom regio onderhoud 1 eiwit, (CRM1), moleculair gewicht: 123.386 Da. A) 1 pmol CRM1 werd geanalyseerd met behulp van de DHB_CHCA mix als matrix B) hoeveelheid: 1. Pmole; matrix:. SA C) bedraagt: 0,5 pmol; matrix:. DHB_CHCA D) bedrag: 0,5 pmol; matrix: SA. Het signaal van de pieken, uitgedrukt in een willekeurige intensiteit schaalverdeling is genormaliseerd tot de maximale waarde die in elk spectrum. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. MALDI-TOF analyse van intacte bèta-galactosidase (116.300 Da). A) bedragen: 20 pmol; matrix DHB_CHCA B) hoeveelheid:. 20 pmol; matrix:. SA C) bedragen: 5 pmol; matrix:. DHB_CHCA D) hoeveelheid: 5 pmol; matrix: SA. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> Figuur 3. MALDI-TOF analyse van een intact immunoglobuline, IgG (148.500 Da); bedrag:. 1.7 pmol De spectra verkregen met behulp van de CHCA_DHB mengsel waren veel intenser (maximum: 8200 willekeurige eenheid, au) dan de SA spectra (maximum: 1200 au) en α-CHCA spectra (maximum: 4500 au)

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Het algemene doel van deze procedure is om intacte eiwitten groter dan 100 kilodalton op een gevoelige manier te analyseren met MALDI-massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst de matrixoplossingen voor te bereiden. De tweede stap is het aanbrengen van de dunne laag oplossing op het target.Vervolgens worden het monster en het matrixmengsel op het target aangebracht. De laatste stap is het observeren van de monsterplekjes onder de microscoop. Ten slotte wordt een MALDI-massaspectrometer gebruikt om intacte eiwitten te analyseren en massaspectra vast te leggen.Het belangrijkste voordeel van MALDI-massaspectrometrie ten opzichte van andere analytische benaderingen, zoals electrospray-ionisatie, is dat het toleranter is voor zouten, contaminanten en detergentia. Een ander voordeel van MALDI is dat het ionen genereert met minder ladingen in vergelijking met electrospray. Daarom is het verkrijgen en interpreteren van MALDI-data vrij eenvoudig.Om te beginnen met de herkristallisatie, giet 10 milliliters 40%ethanol in een Pyrex-reageerbuis. Voeg vervolgens 600 milligrams van een matrix toe met behulp van een waterbad en een weerstandverwarming. Verwarm de matrixoplossing en roer deze totdat de matrix volledig is opgelost.Herhaal de voorgaande stappen totdat de oplossing verzadigd is. Laat de oplossing gedurende enkele uren langzaam afkoelen op kamertemperatuur en bewaar deze vervolgens een nacht bij vier graden Celsius. Indien er geen kristallen zijn gevormd, kras dan met een glazen staaf tegen de binnenkant van het bekerglas net onder het oppervlak van de oplossing om kristallisatie op te wekken.Verzamel ten slotte de matrixkristallen door filtratie. Spoel de resterende kristallen in de kolf met een minimale hoeveelheid ijskoud oplosmiddel en filtreer deze. Zodra de filtratie is voltooid, laat u de kristallen drogen om de MALDI-targetplaat te reinigen.Spoel het af met methanol en veeg het voorzichtig schoon met een Kimwipe. Spoel het vervolgens af met water en veeg het schoon met een Kimwipe. Plaats de MALDI-target in een bekerglas van 600 milliliter en bedek deze met 50% ethanol.Sonicate vervolgens het target gedurende 10 minuten in de ethanoloplossing in een ultrasoonbad. Als er residuen op de plaat achterblijven, moeten de vorige stappen worden herhaald. Spoel het target af met methanol of water; het gebruikte oplosmiddel bepaalt in welke mate het monster zich verspreidt.Kantel vervolgens het target zodat alle vloeistof wordt opgevangen door een Kim wipe. Droog het target met een stikstofgasstroom. Los in de volgende stap alpha CHCA op in aceton.Om een verzadigde oplossing te maken, doopt u een pipetteertip van 10 µL in de verzadigde alpha CHCA-oplossing zodat er een kleine hoeveelheid van de oplossing in de tip stroomt. Raak het MALDI-target snel aan met de pipetteertip om de alpha CHCA-oplossing op het MALDI-target aan te brengen met behulp van een plastic buisje van 1,5 mL. Bereid een alpha CHCA-oplossing van 20 mg/mL door alpha CHCA op te lossen in een volumeverhouding van zeven tot drie Acetonitril ten opzichte van 5% mierenzuur, en label de oplossing als alpha CHCA-oplossing.Bereid vervolgens een DHB-oplossing van 20 milligram per milliliter door DHB op te lossen in een volumeverhouding van zeven op drie van acetonitril en 0,1% trifluorazijnzuur; label deze oplossing als DHB-oplossing. Meng de alfa-CHCA-oplossing en de DHB-oplossing in een volumeverhouding van één-op-één. Om de C-H-C-A-D-H-B-oplossing te verkrijgen voordat u aan deze procedure begint, is een optionele stap het zuiveren van de eiwitmonsters via bufferuitwisseling, zoals beschreven in de vermelde referentie.Plaats anderszins een ongezuiverd eiwitmonster op het MALDI-target. Breng vervolgens 0,5 µL van het eiwitmonster aan op de voorbereide alpha-CHCA-dunne laag. Voeg direct daarna 0,5 µL van de C-H-C-A-D-H-B-oplossing toe.Breng 0,5 µL van de Cain-standaard aan op de MALDI-plaat en voeg vervolgens 0,5 µL van de matrixoplossing toe. Zodra de monsters en de Cain zijn opgedroogd, kunnen de spots onder een microscoop worden geobserveerd, waarna het target in het instrument kan worden geplaatst en de juiste instrumentinstellingen kunnen worden gekozen. Selecteer vervolgens het passende bereik voor de massa-ladingsverhouding.Verwerf de spectra van de ca en kalibreer het instrument met de passende laserintensiteit. Verwerf de spectra van de eiwitmonsters. De MALDI-TOF-analyse van de intacte chromosoomregio Maintenance one-eiwit wordt hier getoond.Het C-H-C-A-D-H-B-mengsel leverde massaspectra van hogere kwaliteit op in termen van signaal-ruisverhouding en gevoeligheid. In het bijzonder konden 0,5 picomoles eiwit gedeponeerd op het MALDI-target worden gedetecteerd, terwijl dezelfde hoeveelheid eiwit nauwelijks detecteerbaar was met SINO NIC-zuur. Bij gebruik van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel werden meervoudig geladen ionen van het eiwit waargenomen, wat massabepaling met een hogere nauwkeurigheid mogelijk maakte omdat de piekresolutie bij een axiaal multi-TOF-instrument omgekeerd proportioneel is aan de massa-ladingsverhouding. Bovendien was bij gebruik van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel de dunne-laagmethode onze voorkeursmethode voor de depositie van de matrix.Met de dried droplet-methode werden eiwitten met een massa hoger dan 100 kilodaltons niet gedetecteerd. Het monomerische bèta-collectinase-eiwit werd wel gedetecteerd en werd tevens geanalyseerd met multi-TOF. De C-H-C-A-D-H-B spectra waren superieur aan de SINO NIC-zuurspectra wat betreft gevoeligheid en resolutie.Bovendien maakte de aanwezigheid van meervoudig geladen ionen een bevestiging van de massa van het eiwit met een hogere nauwkeurigheid mogelijk. MALDI-analyse van een intact immunoglobuline wordt hier getoond. De spectra die met het C-H-C-A-D-H-B-mengsel werden verkregen, waren veel intenser dan de SA- en alpha CHCA-spectra.Meer specifiek waren de eiwitsignalen sterker en hadden ze een betere resolutie in de C-H-C-A-D-H-B spectra. Het gebruik van het C-H-C-A-D-H-B mengsel en de methode van dunne-laagdepositie resulteerde in significante verbeteringen in de kwaliteit van grote, intacte eiwitmassaspectra, verkregen met behulp van een MALDI-instrument.Het gepresenteerde protocol illustreert hoe hoogwaardige massespectra van eiwitten met een hoog molecuulgewicht kunnen worden verkregen met behulp van een multi-instrument. Bij het uitvoeren van dit type analyse zijn drie zaken belangrijk. Ten eerste het gebruik van een vers bereide matrixoplossing.Ten tweede, om uw monster correct op het Mali-target te deponeren. En ten derde, om de juiste instrumentinstellingen te gebruiken, zoals de laserintensiteit.

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.

Laag moleculair gewicht eiwitverrijking op mesoporeuze silica dunne films voor de ontdekking van biomarkers

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Een massaspectrometrie-beeldvormingsbron (MSI) die op atmosferische druk werkte, werd ontwikkeld door mid-infrarood laserdesorbentie te koppelen met post-ionisatie door middel van elektrospray. Exogeen ijsmatrix werd gebruikt als de energieabsorberende matrix om resonante desorbentie van weefselgerelateerd materiaal te vergemakkelijken. Dit manuscript biedt een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van IR-MALDESI MSI van een neonatale muis in zijn geheel.

Whole-body massaspectrometrie Imaging door Infrared Matrix-geassisteerde laser desorptie electrospray ionisatie (IR-MALDESI)

Een protocol voor de laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie tijd van de vlucht de karakterisering van de Spectrometrie van de massa (MALDI-TOF MS) van synthetische polymeren wordt beschreven, met inbegrip van de optimalisering van de bereiding van de monsters, spectrale acquisitie en data-analyse.

Karakterisering van synthetische polymeren via Matrix bijgestaan Laser desorptie ionisatie tijd van de Spectrometrie van de massa van de vlucht (MALDI-TOF)

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Zoogdieren omhulsel bevat oplosmiddel-extraheerbare lipiden die chemische samenstelling kenmerkend is voor individuele soorten kan bieden. Dit document presenteert een routinemethode voor het scheiden brede lipideklassen Integumentair geïsoleerd uit weefsels met behulp van dunnelaagchromatografie en waarin de triacylglyceride profiel door matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie.

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Een protocol voor het karakteriseren van de chemische samenstelling van uitgeademde adem in real-time met behulp van ionisatie van de secundaire nanoelectrospray gekoppeld aan hoge resolutie massa spectrometrie wordt aangetoond.

Real-time adem analyse met behulp van secundaire Nanoelectrospray ionisatie gekoppeld aan massaspectrometrie voor hoge resolutie

Een protocol voor het verbeteren van koolhydraten ion signalen in de Spectrometrie van de massa van de MALDI door hervorming kristallijnen structuren tijdens preparatietechnieken voor monster wordt aangetoond.

Een efficiënte Sample voorbereiding methode om koolhydraten Ion signalen in Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie

Leer MALDI-TOF massaspectrometrie voor analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa. Deze methode toont verbeterde gevoeligheid en tolerantie voor verontreinigingen.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa (Video) | JoVE Journal

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Meer video's verkennen