Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Het algemene doel van deze procedure is om intacte eiwitten groter dan 100 kilodalton op een gevoelige manier te analyseren met MALDI-massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst de matrixoplossingen voor te bereiden. De tweede stap is het aanbrengen van de dunne laag oplossing op het target.

Vervolgens worden het monster en het matrixmengsel op het target aangebracht. De laatste stap is het observeren van de monsterplekjes onder de microscoop. Ten slotte wordt een MALDI-massaspectrometer gebruikt om intacte eiwitten te analyseren en massaspectra vast te leggen.

Het belangrijkste voordeel van MALDI-massaspectrometrie ten opzichte van andere analytische benaderingen, zoals electrospray-ionisatie, is dat het toleranter is voor zouten, contaminanten en detergentia. Een ander voordeel van MALDI is dat het ionen genereert met minder ladingen in vergelijking met electrospray. Daarom is het verkrijgen en interpreteren van MALDI-data vrij eenvoudig.

Om te beginnen met de herkristallisatie, giet 10 milliliters 40%ethanol in een Pyrex-reageerbuis. Voeg vervolgens 600 milligrams van een matrix toe met behulp van een waterbad en een weerstandverwarming. Verwarm de matrixoplossing en roer deze totdat de matrix volledig is opgelost.

Herhaal de voorgaande stappen totdat de oplossing verzadigd is. Laat de oplossing gedurende enkele uren langzaam afkoelen op kamertemperatuur en bewaar deze vervolgens een nacht bij vier graden Celsius. Indien er geen kristallen zijn gevormd, kras dan met een glazen staaf tegen de binnenkant van het bekerglas net onder het oppervlak van de oplossing om kristallisatie op te wekken.

Verzamel ten slotte de matrixkristallen door filtratie. Spoel de resterende kristallen in de kolf met een minimale hoeveelheid ijskoud oplosmiddel en filtreer deze. Zodra de filtratie is voltooid, laat u de kristallen drogen om de MALDI-targetplaat te reinigen.

Spoel het af met methanol en veeg het voorzichtig schoon met een Kimwipe. Spoel het vervolgens af met water en veeg het schoon met een Kimwipe. Plaats de MALDI-target in een bekerglas van 600 milliliter en bedek deze met 50% ethanol.

Sonicate vervolgens het target gedurende 10 minuten in de ethanoloplossing in een ultrasoonbad. Als er residuen op de plaat achterblijven, moeten de vorige stappen worden herhaald. Spoel het target af met methanol of water; het gebruikte oplosmiddel bepaalt in welke mate het monster zich verspreidt.

Kantel vervolgens het target zodat alle vloeistof wordt opgevangen door een Kim wipe. Droog het target met een stikstofgasstroom. Los in de volgende stap alpha CHCA op in aceton.

Om een verzadigde oplossing te maken, doopt u een pipetteertip van 10 µL in de verzadigde alpha CHCA-oplossing zodat er een kleine hoeveelheid van de oplossing in de tip stroomt. Raak het MALDI-target snel aan met de pipetteertip om de alpha CHCA-oplossing op het MALDI-target aan te brengen met behulp van een plastic buisje van 1,5 mL. Bereid een alpha CHCA-oplossing van 20 mg/mL door alpha CHCA op te lossen in een volumeverhouding van zeven tot drie Acetonitril ten opzichte van 5% mierenzuur, en label de oplossing als alpha CHCA-oplossing.

Bereid vervolgens een DHB-oplossing van 20 milligram per milliliter door DHB op te lossen in een volumeverhouding van zeven op drie van acetonitril en 0,1% trifluorazijnzuur; label deze oplossing als DHB-oplossing. Meng de alfa-CHCA-oplossing en de DHB-oplossing in een volumeverhouding van één-op-één. Om de C-H-C-A-D-H-B-oplossing te verkrijgen voordat u aan deze procedure begint, is een optionele stap het zuiveren van de eiwitmonsters via bufferuitwisseling, zoals beschreven in de vermelde referentie.

Plaats anderszins een ongezuiverd eiwitmonster op het MALDI-target. Breng vervolgens 0,5 µL van het eiwitmonster aan op de voorbereide alpha-CHCA-dunne laag. Voeg direct daarna 0,5 µL van de C-H-C-A-D-H-B-oplossing toe.

Breng 0,5 µL van de Cain-standaard aan op de MALDI-plaat en voeg vervolgens 0,5 µL van de matrixoplossing toe. Zodra de monsters en de Cain zijn opgedroogd, kunnen de spots onder een microscoop worden geobserveerd, waarna het target in het instrument kan worden geplaatst en de juiste instrumentinstellingen kunnen worden gekozen. Selecteer vervolgens het passende bereik voor de massa-ladingsverhouding.

Verwerf de spectra van de ca en kalibreer het instrument met de passende laserintensiteit. Verwerf de spectra van de eiwitmonsters. De MALDI-TOF-analyse van de intacte chromosoomregio Maintenance one-eiwit wordt hier getoond.

Het C-H-C-A-D-H-B-mengsel leverde massaspectra van hogere kwaliteit op in termen van signaal-ruisverhouding en gevoeligheid. In het bijzonder konden 0,5 picomoles eiwit gedeponeerd op het MALDI-target worden gedetecteerd, terwijl dezelfde hoeveelheid eiwit nauwelijks detecteerbaar was met SINO NIC-zuur. Bij gebruik van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel werden meervoudig geladen ionen van het eiwit waargenomen, wat massabepaling met een hogere nauwkeurigheid mogelijk maakte omdat de piekresolutie bij een axiaal multi-TOF-instrument omgekeerd proportioneel is aan de massa-ladingsverhouding. Bovendien was bij gebruik van het C-H-C-A-D-H-B-mengsel de dunne-laagmethode onze voorkeursmethode voor de depositie van de matrix.

Met de dried droplet-methode werden eiwitten met een massa hoger dan 100 kilodaltons niet gedetecteerd. Het monomerische bèta-collectinase-eiwit werd wel gedetecteerd en werd tevens geanalyseerd met multi-TOF. De C-H-C-A-D-H-B spectra waren superieur aan de SINO NIC-zuurspectra wat betreft gevoeligheid en resolutie.

Bovendien maakte de aanwezigheid van meervoudig geladen ionen een bevestiging van de massa van het eiwit met een hogere nauwkeurigheid mogelijk. MALDI-analyse van een intact immunoglobuline wordt hier getoond. De spectra die met het C-H-C-A-D-H-B-mengsel werden verkregen, waren veel intenser dan de SA- en alpha CHCA-spectra.

Meer specifiek waren de eiwitsignalen sterker en hadden ze een betere resolutie in de C-H-C-A-D-H-B spectra. Het gebruik van het C-H-C-A-D-H-B mengsel en de methode van dunne-laagdepositie resulteerde in significante verbeteringen in de kwaliteit van grote, intacte eiwitmassaspectra, verkregen met behulp van een MALDI-instrument.

Het gepresenteerde protocol illustreert hoe hoogwaardige massespectra van eiwitten met een hoog molecuulgewicht kunnen worden verkregen met behulp van een multi-instrument. Bij het uitvoeren van dit type analyse zijn drie zaken belangrijk. Ten eerste het gebruik van een vers bereide matrixoplossing.

Ten tweede, om uw monster correct op het Mali-target te deponeren. En ten derde, om de juiste instrumentinstellingen te gebruiken, zoals de laserintensiteit.