Forward Genetische technieken in

Het algemene doel van deze procedure is om genetische analyse uit te voeren op chlamydia tritus door middel van chemische mutagenese en het bepalen van genotype-fenotype-associaties. Dit wordt bereikt door eerst chlamydia tracom-mutante stammen te genereren met behulp van chemische mutagenese. Vervolgens worden alle chemisch gegenereerde mutaties geïdentificeerd via whole genome sequencing, gevolgd door referentiegestuurde genoomassemblage.

Vervolgens worden de associaties tussen fenotype en genotype in de mutante stammen geïdentificeerd. Ten slotte worden deze associaties bevestigd door recombinante stammen te genereren en te analyseren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat een mutatie in een specifiek chlamydia-gen leidt tot een fenotype van belang, door middel van een combinatie van klassieke chemische mutagenese-benaderingen en next-generation sequencing.

Er zijn momenteel geen methoden beschikbaar voor genvervanging in chlamydia en moleculair-genetische instrumenten voor de studie hiervan staan nog in de kinderschoenen. Deze methode vereist geen transformatie met recombinant DNA of de ontwikkeling van moleculair-genetische instrumenten, maar bereikt toch hetzelfde doel. Dat is het toewijzen van een functie aan individuele genproducten.

Om de gecultiveerde cellen voor te bereiden, worden ongeveer 1 × 10⁶ vir-cellen per 25 cm² geplaatst in 3 mL DMEM aangevuld met 10% FBS en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO₂. Wanneer de cellen na ongeveer 24 uur confluentie bereiken, wordt het medium afgezogen en worden de cellen geïnfecteerd met chlamydia bij een multiplicity of infection van vijf. In een totaal volume van 3 mL DMEM-FBS bevattende 200 ng/mL cycloheximide. Om de mutagenese te starten op 18 uur post-infectie, wordt onder een chemische afzuigkap 20 mg/mL ethylmethansulfonaat of EMS in PBS met calciumchloride en magnesiumchloride bereid.

EMS is een krachtig mutageen en carcinogeen. Raadpleeg daarom het tekstprotocol voor de verwijdering ervan. Aspireer het medium van de Vero-cellen en was ze één keer met drie milliliter PBS met magnesiumchloride en calciumchloride.

Voeg vervolgens drie milliliters EMS-oplossing toe en incubeer gedurende één uur in de zuurkast bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de EMS en plaats het in een houder met één molar natriumhydroxide om het mutagen te inactiveren, alvorens de cellen drie keer te wassen om alle resterende EMS te verwijderen. Voeg vervolgens zes milliliters DMEM 10%FBS toe met 200 nanograms per milliliter cycloheximide en 25 micrograms per milliliter gentamycine en incubeer bij 37 °C met 5% koolstofdioxide gedurende 48 tot 72 uur.

Inclusies lijken vrij van bacteriën ongeveer 36 uur na mutagenese bij 72 uur. Ongeveer 10% van de inclusies is gevuld met bacteriën, terwijl de rest leeg blijft. Om elementaire lichaampjes of EB's te extraheren via hypotone lysis, dient het medium volledig te worden weggezogen. Voeg één milliliter water toe en schud 10 minuten om de cellen los te maken; lyseer de cellen door deze minimaal 10 keer op en neer te pipetteren.

Nadat het lysaat in een microcentrifugebuis is verzameld, voegt u 0,25 milliliter van een vijf x sucrose, fosfaat-glutamaatbuffer, of SPG toe tot een eindconcentratie van één x en bewaart u dit bij minus 80 graden Celsius. Zet convergente monolagen van VES-cellen in zes-well platen door ongeveer 0,4 × 10⁶ cellen in drie milliliter DMEM 10% FBS per well uit te zaaien; laat de cellen gedurende de volgende 24 uur een homogene monolaag vormen. Zet vervolgens een stockoplossing van mutagene chlamydia op ijs.

Bereid vervolgens zes buisjes van een tienvoudige seriële verdunning in een totaal volume van 200 µL per verdunning in DMEM 10%FBS en plaats deze op ijs. Gebruik drie milliliters PBS per well om de Vero-cellen twee keer te wassen. Voeg daarna drie milliliters DMEM toe aan elke well voor zes-wellplaten en 100 µL van de bacteriële verdunning in dubbeltoestelling.

Draai de plaat rond om een gelijkmatige menging te garanderen. Centrifugeer de geïnfecteerde platen bij 2.700 g gedurende 30 minuten bij 15 °C. Incubeer ze vervolgens gedurende één tot twee uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.

Bereid ondertussen 0,54% AROS in DMEM voor door eerst de volgende ingrediënten samen te voegen en te mengen. Meng vervolgens 18,9 milliliter warme steriele 1,2% AROS in water erdoor terwijl u roert om klontjes te voorkomen. Houd het mengsel warm in een waterbad van 55 °C.

Zuig de bacteriële suspensie uit de schalen en voeg zes milliliters van de warme aro-oplossing toe. Laat dit volledig stollen bij kamertemperatuur buiten de zuigkast. Droog de platen vervolgens gedurende nog eens 15 minuten in de veiligheidskast met de deksels verwijderd. Wanneer de platen zijn opgedroogd, worden ze gedurende zeven tot 10 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een koolstofdioxide-incubator.

Plaques moeten zichtbaar zijn met behulp van een dissectiemicroscoop één dag vóór het isoleren van mutanten. Zaai 1 × 10⁴ cellen in 100 µL per putje. In een 96-wells plaat zullen de cellen binnen 24 uur confluent zijn.

Markeer de te plukken plaques onder een dissectiemicroscoop en gebruik vervolgens een steriele barrièrepipet van één milliliter om pluggen van de plaques te verzamelen. Resuspendeer de plaques in 100 µL DMEM aangevuld met 10% FBS, 400 ng/mL cycloheximide en 50 µg/mL gentamicin om de mutante stammen uit te breiden; breng de suspensie vervolgens aan als overlay op confluente monolagen van Vero-cellen.

Centrifugeer de platen bij 2.700 g en 15 °C gedurende 30 minuten voordat u de oogst incubeert wanneer meer dan 50% van de cellen geïnfecteerd is, wat al na 48 uur post-infectie en tot 14 dagen kan gebeuren. Deze hoeveelheid geïnfecteerde cellen maakt het mogelijk om voldoende levensvatbare bacteriën op te slaan om EV's te extraheren via hypotone lysis van geïnfecteerde cellen. Aspireer na afloop het medium, voeg 160 µL steriel water toe en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

Gebruik barrier-tips om de cellen te lyseren door meerdere keren op en neer te pipetteren om volledige lysis te garanderen. Draag vervolgens 160 µL van elk lysaat over naar microcentrifugebuisjes. Voeg 40 µL van five XSPG toe en bewaar dit bij -80 °C tot het moment van assay en het screenen van mutanten op fenotypes van belang.

Blootstelling aan een mutageen leidt tot inclusies die schijnbaar geen bacteriën bevatten, vermoedelijk als gevolg van bacteriële celdood. Normaal gesproken zal serovar LGVL two geïnfecteerde cellen binnen 48 uur na infectie volledig lyseren, maar behandeling met mutagenen kan deze cyclus verlengen tot meer dan 90 uur, waarbij in onze experimenten wordt verwacht dat ongeveer 10% van de inclusies herstelt. Geïnfecteerde Vero-cellen behandeld met 20 mg/mL EMS leidden tot een afname van 99% in het herstel van infectieuze nakomelingen vergeleken met onbehandelde controles, zoals te zien is in deze figuur.

Behandeling met mutagenen leidde ook tot het ontstaan van plaques met gewijzigde morfologieën, waaronder kleine plaques. Andere morfologieën omvatten plaques die granulair, klonterig of honingraatvormig lijken, zoals hier getoond. De doses EMS die in deze studies zijn gebruikt, kunnen leiden tot tussen de drie en 30 mutaties per KCL-genoom, zoals experimenteel beoordeeld via NGS.

Hoewel gradiëntgezuiverde EBS grotendeels vrij zijn van gastcelmateriaal, wordt er ook gast-DNA gedetecteerd, wat ongeveer 10 tot 15% van de genomische preparaten na deze procedure uitmaakt. Er kunnen screens worden uitgevoerd voor fenotypes zoals een verminderde replicatie in weefselkweekcellen, verlies van biochemische activiteiten of gewijzigde bacteriële morfologieën om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke bacteriële factoren vereist zijn voor de vorming en het behoud van chlamydia-pathogene factoren.