Name: Forward Genetische technieken in Chlamydia trachomatis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer genetische analyse van Chlamydia trachomatis via chemische mutagenese en whole genome sequencing. Deze methode identificeert genotype-fenotype associaties en ontwikkelt een DNA-uitwisselingssysteem voor genetische mapping.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Chemische mutagenese Opmerking: We vonden dat de replicatieve vorm RB ontvankelijker voor chemische mutagenese dan de EB vorm. Midden in de cyclus (tussen de 18 tot 20 hpi), RBS zijn op de grootste aantallen voorafgaand aan RB-EB overgang. Omdat Chlamydia trachomatis is een obligaat intracellulair pathogeen, kunnen de effecten van de mutagene stof op de gezondheid gastheer bacteriën herstel beperken. Vero-cellen bleken beter bestand tegen de nadelige effecten van hoge niveaus van EMS dan andere geteste cellijnen. Scheiding van mutaties door recombinatie vereist selectie van antibioticaresistente recombinante nakomelingen. We raden gebruik van resistente bacteriestammen (bijv. rifampine, spectinomycine of trimethoprim) voor het genereren van mutanten op het vermogen om recombinant analyses uit te voeren en isogene stammen te isoleren. Antibiotica resistente stammen werden gegenereerd door een stapsgewijze selectie (15, 16). Niete: Chlamydia trachomatis (stam L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) is BSL2 pathogeen. Raadpleeg institutionele standard operating procedures (SOP) voor de behandeling van dergelijke pathogenen. <ol><li> Bereiding van celcultuur en infectie <ol><li> Seed ongeveer 1 x 10 6 cellen Vero (ATCC CCL-81) per 25 cm 2 (T25) kolf in 3 ml Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS). Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. De cellen moeten een confluente monolaag vormen binnen de 24 uur. </li><li> Aspireren medium. Infect confluente T25 flessen van Vero cellen met Chlamydia bij een multipliciteit van infectie (moi) van 5 (14 x 10 ~ 6) in een totaal volume van 3 ml medium (DMEM, 200 ng / ml cyclohexamide, 10% FBS). </li></ol></li><li> Begin mutagenese bij 18 uur na infectie (hpi): <ol><li> Bereid 20 mg / ml EMS (Ethyl methaansulfonaat) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,9 mM calciumchloride en 0,49 mM magnesiumchloride in een chemisch veiligheidsrapport kap als EMS is een vluchtige vloeistof. Opmerking: EMS is een krachtige mutageen en carcinogeen. Neutraliseren EMS afval en ontsmetten morsen, plastic, papier en glaswerk met 1 M natriumhydroxide. </li><li> Aspireren medium en cellen een keer wassen met 3 ml PBS / MgCl2 / CaCl2. Incubeer cellen met 3 ml van 20 mg / ml EMS in PBS / MgCl2 / CaCl2 gedurende een uur in de zuurkast bij kamertemperatuur. Vero-cellen zijn in staat om deze concentratie van EMS en omstandigheden die buiten de couveuse overleven voor korte periodes. Vergeet niet om een ​​controlemonster dat niet is gemutageniseerd bevatten. </li><li> Verwijder medium met EMS en plaats het in een container van 1 M NaOH aan het mutageen inactiveren. Was geïnfecteerde cellen 3 keer in 3 ml PBS + MgCl 2 / CaCl2 om resterende mutageen verwijderen. Voeg 6 ml DMEM/10% FBS met 200 ng / ml cyclohexamide en 25 ug / ml gentamicine en incubeer bij 5% CO <sub&gt; 2, 37 ° C gedurende 48-72 uur. Insluitsels lijken verstoken van bacteriën ongeveer 36 uur na mutagenese. 72 uur ongeveer 10% van de insluitsels zijn gevuld met bacteriën terwijl de rest leeg blijven. </li><li> Extract EBS door hypotone lysis: Geheel zuigen medium. Voeg 1,0 ml H2O en Rock om cellen los gedurende 10 minuten. Lyse cellen door pipetteren en deze gedurende ten minste 10 maal. Verzamel lysaat in een microfuge en voeg 0,250 ml 5x sucrose fosfaat glutamaat buffer (SPG) om het naar 1x uiteindelijke concentratie te brengen. Bewaren bij -80 ° C. Opmerking: Het niveau van mutagenese kan worden beoordeeld door de inductie van resistentie rifampin. Om bepaling van de frequentie van rifampicine resistentie, plaque 1 x 10 7 en 8 x 10-voudige seriële verdunningen van bacteriën in de aanwezigheid van 200 ng / ml rifampicine. De frequentie van rifampicine resistentie wordt gedefinieerd als het aantal rifampicine resistente plaques gedeeld door het totaal aantal bacteriën geplateerd. Zie hieronder voor plaque instructies. </li></ol></li></ol> 2. Klonale isolatie van Chlamydia trachomatis mutantstammen door Plaque Zuivering <ol><li> Set confluente monolagen van Vero-cellen in 6 well platen: Zaad ~ 0,4 x 10 6 cellen in 3 ml DMEM/10% FBS per putje. Laat cellen om een ​​homogene monolaag de volgende 24 uur te vormen. </li><li> Ontdooien voorraad oplossing van gemutageniseerde Chlamydia op ijs. Uitvoeren 6 x 10-voudige seriële verdunningen in een totaal volume van 200 ul per verdunning in DMEM/10% FBS en zet ze op ijs. Opmerking: Bacteriële titer in opname vormende eenheden (IFU) is een goede schatting van plaque vormende eenheden (PFU). Doel om plaque 10, 100, en 1000 pfu. </li><li> Was de Vero-cellen tweemaal met 3 ml PBS per well. </li><li> Voeg 3 ml DMEM aan elk putje voor platen met 6 putjes en 100 gl van de bacteriële verdunningen in duplo. Swirl de plaat om zelfs mengsel zorgen. </li><li> Spin geïnfecteerde platen bij 2700 xg gedurende 30 min bij 15 ° C en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde,5% CO2 incubator gedurende 1-2 uur. </li><li> Bereid 0,54% agarose in DMEM (6 putjes): <ol><li> Voeg de volgende bestanddelen: 18,9 ml koude 2 x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml cyclohexamide, 0,021 ml 50mg/ml gentamicine. Meng goed. </li><li> Meng in 18,9 ml hete steriele 1,2% agarose / H 2 O, roeren om klonten te voorkomen. Mengsel moet warm aan te raken zijn. Houd in een warm waterbad bij 55 ° C voor het toevoegen aan geïnfecteerde cellen. </li></ol></li><li> Aspireren bacteriële suspensie van gerechten en toepassing 6 ml 0,54% agarose / DMEM per put. Laat agarose volledig stollen bij kamertemperatuur buiten de kap 15 minuten. Droog de platen met de deksels verwijderd, in de bioveiligheid kap gedurende 15 minuten. Opmerking: Trillingen van de biologische inperking kap kan vervormen de stollende agarose. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in CO2 incubator gedurende 7-10 dagen. Plaques moet zichtbaar met behulp van een dissectie microscoop. (Refer naar figuur 3 voor een typisch beeld van plaques.) </li><li> Een dag voor het isoleren van mutanten, zaad 1 x 10 4 Vero cellen in 100 ul per putje in een 96-well plaat. Cellen zullen samenvloeiing binnen 24 uur. </li><li> Met behulp van een dissectie microscoop, merk plaques om geplukt te worden. Verzamel stekkers van plaques met een steriele 1,0 ml barrière pipet tip. </li><li> Resuspendeer plaques in 100 ul DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 400 ng / ml cyclohexamide, 50 ug / ml gentamicine. </li><li> Om mutantstammen breiden, overlappen de schorsing op samenvloeiing monolagen van Vero-cellen. Spin platen bij 2700 xg, 15 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Harvest EBS bij&gt; 50% van de cellen geïnfecteerd, wat kan optreden zo vroeg als 48 hpi en zo laat als 14 dagen. Deze hoeveelheid geïnfecteerde cellen laat voldoende levensvatbare bacteriën worden opgeslagen. Mutante stammen verschillen in groeipercentages en besmettelijkheid. Laat langzaam groeiende stammen naturally herinfecteren naburige cellen totdat er voldoende cellen worden geïnfecteerd. </li><li> Extract EBS door hypotone lysis van geïnfecteerde cellen: <ol><li> Volledig aspireren medium. </li><li> Voeg 160 ul van steriel water. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Verstoren cellen door en neer te pipetteren meerdere malen om volledige lysis te garanderen, gebruiken barrière tips om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Breng 160 pi van lysaten te microfugebuizen. </li><li> Meng in 40 pi 5x SPG. Bewaren bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Assay en scherm mutanten voor fenotype (s) van belang. </li></ol> 3. Hele Genome Sequencing van Selected Chlamydia Mutants <ol><li> Uittreksel genomisch DNA van gradiënt-gezuiverd EBS, die grotendeels vrij van verontreinigende gastheer-DNA. Protocollen voor grootschalige kweek van Chlamydia en zuivering van EVSA&#39;s zijn te vinden in ref. (17). Gebruik commerciële genomische DNA-zuivering kits (bijv. cat Qiagen. 69504) aan extRact DNA van 2 x 10 9 bacteriën volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Gebruik een fluorometer (qubit, Invitrogen cat. Q32866) om de hoeveelheid DNA nauwkeurig meten. 1,5 ug van gezuiverd DNA is vereist voor de Illumina sequencing platform. Opmerking: meerdere platforms kunnen worden gebruikt om de sequentie bacterieel genoom, waaronder Illumina/Solexa- en Solid-systemen. We kozen ervoor om HiSeq (Illumina) gebruiken als het produceert een hoge dichtheid van de korte, maar hoge kwaliteit sequencing leest. Kleinere schaal genoom sequencers zoals IonTorrent (Life Technologies) en MySeq (Illumina) te geschikt en meer dan voldoende voor multiplexen deze quencing tot 4 Chlamydia genomen tegelijk dat de minimale dekking van 25X adequate genoom montage overschrijdt. Bereiding van DNA sequencing bibliotheken voor Illumina platform worden hieronder beschreven. </li><li> Fragment DNA op de juiste grootte (300-400 baseparen voor Illumina sequencing) met behulp van een Adaptive Gericht Akoestiek S220 instrument (Covaris) volgens de aanbevolen instellingen van de fabrikant. Opmerking: DNA-fragmentatie door verneveling leidt tot groter verlies van het monster als gevolg van aërosolvorming van het monster. </li><li> Bereid de genome sequencing bibliotheken met behulp van commerciële bouwpakketten (Illumina FC-102-1001), volgens de instructies van de fabrikant. Bibliotheken kunnen worden geïndexeerd met behulp van barcode primers (Illumina FC-121-1003), zodanig dat meerdere monsters kunnen worden samengevoegd en tegelijkertijd gesequenced. </li><li> Run sequencing monsters. Deze stap wordt meestal uitgevoerd door commerciële diensten of kernfaciliteiten geëxploiteerd door toegewijde technische staf. Volg hun procedures en aanbevelingen. </li><li> Illumina leest (FASTQ format) kunnen worden samengevoegd tot een referentie genoom met gebruikersvriendelijke grafische user interface software, zoals Geneious (Biomatters), die ook kan worden gebruikt voor SNP / mutatie identificatie. Naar map mutaties, parameters tot 90% voor minimum variant frequentie en 50X voor minimale dekking. Open source genoom monteurs, zoals MAQ (18) en BWA (19), kunnen ook worden gebruikt. </li><li> Bevestig mutaties door Sanger sequentiebepaling: Gebruik genomisch DNA als template voor PCR amplificatie van 300-500 bp flankerende sequentie geïdentificeerd mutaties en gezuiverde of verdund (1:20) PCR producten van Sanger sequentiebepaling. </li></ol> 4. Generatie van Chlamydia Recombinanten Opmerking: Chlamydia ruilen DNA tijdens infectie, waardoor de productie van recombinante stammen (12, 13, 20). Na co-infectie van cellen met twee unieke antibiotica resistentie, recombinant &quot;nageslacht&quot; selecteren voor dubbele antibiotische weerstand (12, 13). We hebben gebruik gemaakt van dit fenomeen om mutaties te scheiden en te co-isogene stammen genereren. Daarom werden mutante stammen gegenereerd antibiotica resistente achtergrond (bijv. rifampine weerstand (R rif) H471Y in CTL0567 (rpoB)) zodat zij kunnen worden gekruist met wild type stam bearinga verschillende antibiotica-resistente allel (bijv. spectinomycineresistentie (spc R), G1197A in r01/r02 (16SRNA exemplaren nrs. 1 en 2)). Voor details met betrekking tot DNA-uitwisseling en recombinatie in Chlamydia, zie referenties (12, 13). <ol><li> Co-infecteren wild type en klonale mutante stammen door centrifuging6 x 10 5 bacteriën uit elke stam op confluente monolagen van Vero-cellen gekweekt op een 24-well plaat. Parallel infecteren monolagen met elke stam alleen. </li><li> Op 44 hpi, oogst EBS door hypotone lysis van geïnfecteerde cellen: <ol><li> Volledig aspireren medium. </li><li> Voeg 0,4 ml steriel water en laat gedurende 10 minuten staan. </li><li> Lyse cellen door krachtig pipetteren up &amp; down voor ten minste 10 keer. Transfer lysaten een microfugebuis. </li><li> Meng 0,1 ml 5x SPG een eindconcentratie van 1 x SPG. </li><li> Ruwe lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of bewaard bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Plaquette 50 ul van de ruwe EB preps eend 5 x 01:10 seriële verdunningen in agarose / DMEM aangevuld met geschikte antibiotica te kiezen voor recombinanten. (Zie tabel voor de concentratie van typische antibiotica voor de selectie van recombinanten.) </li><li> Plaque zuiveren en te verrijken recombinante stammen zoals hierboven. Score recombinanten voor aanwezigheid of afwezigheid van het gewenste fenotype. Uittreksel DNA van recombinante stammen van DNAzol behandeling (volgende sectie) voor de genotypering van de aanwezigheid of de afwezigheid van mutaties. </li><li> Kruisen kan worden herhaald met stammen dragen andere antibioticaresistentiemarkers verder te scheiden mutaties, en het genereren van isogene stammen. Co-infecteren geselecteerde recombinanten naar een ander wild type stam met een verschillend antibioticum marker. </li></ol> Tabel 1: antibiotica concentraties voor de selectie van recombinanten: <table border="1"><tbody><tr><th> Final Concentratie </th><th> Bereidingsinstructies </th></tr><tr><td> 200 ng / ml rifampicine </td&gt; <td> Maak 25 mg / ml opslag stock in dimethylsulfoxide (DMSO). Make up 200 pg / ml werkoplossing door verdunning van de opslag stock met H 2 O. Bewaar bij -20 ° C in het donker. </td></tr><tr><td> 200 ug / ml trimethoprim </td><td> Maak een 100 mg / ml voorraad in DMSO. Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 ug / ml spectinomycine </td><td> Maak een 100 mg / ml voorraad in water in 100 ul monsters. Bewaren bij -20 ° C. Vermijd herhaalde vries dooi. </td></tr></tbody></table> 5. Extractie van Genomic DNA van recombinante stammen voor Genotyping NB Het gebaseerde zuivering kits kunnen ook worden gebruikt. Een voordeel van DNA-extractie door DNAzol behandeling kost. <ol><li> Infect 1,2 x 10 5 chlamydiae op monolagen van Vero-cellen gekweekt op platen met 12 putjes. </li><li> Op 36-48 hpi, zuigen medium en voeg 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10503-027). Schud voorzichtig de cellen en pipet de lysates in een ml microfugebuis 1.5. </li><li> DNA precipitaat door toevoeging van 0.188 ml 100% ethanol. Meng door omkeren. </li><li> Extract DNA door spoolen met een pipet tip en plaats het in een schone buis. Alternatief, de DNA pellet door centrifugeren bij topsnelheid gedurende 2 min bij kamertemperatuur of 4 ° C en giet supernatant. </li><li> Wassen DNA precipitaat tweemaal met 1,0 ml 75% ethanol. </li><li> De lucht drogen DNA na het verwijderen van de ethanol gedurende 15 sec. </li><li> Oplosbaar DNA met 0,2 ml 8 mM NaOH vervolgens neutraliseren tot pH 8,0 met 20,2 gl 0,1 M HEPES. Brengen tot een uiteindelijk volume van met water of TE 0,5 ml. Als alternatief, resuspendeer DNA in TE-buffer (DNA pellet wordt niet volledig opgelost.). </li><li> Gebruik DNAzol geëxtraheerd DNA als template voor PCR amplificatie van 300-500 bp flankerende geïdentificeerde mutaties. Sequence gezuiverd of verdund (1:20) PCR-producten door Sanger sequencing. </li></ol>

<ol><li>Haggerty, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+of+sequelae+after+Chlamydia+trachomatis+genital+infection+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women.</a> J Infect Dis. 201, Suppl 2. S134-S155 (2010).</li>
<li>Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+mechanisms+of+Chlamydia+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry.</a> Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Chlamydia+trachomatis+entry+into+nonphagocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells.</a> Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).</li>
<li>Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+intractable+-+approaching+the+genetics+of+Chlamydiales%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling the intractable - approaching the genetics of Chlamydiales.</a> Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).</li>
<li>Stephens, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+an+obligate+intracellular+pathogen+of+humans%2C+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis.</a> Science. 282 (5389), 754-759 (1998).</li>
<li>Thomson, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+genome+sequence+analysis+of+lymphogranuloma+venereum+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates.</a> Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Harris, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+analysis+of+diverse+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+phylogenetic+relationships+masked+by+current+clinical+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing.</a> Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).</li>
<li>Somboonna, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypervirulent+Chlamydia+trachomatis+clinical+strain+is+a+recombinant+between+lymphogranuloma+venereum+%28L%282%29%29+and+D+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages.</a> MBio. 2 (3), e00045-00011(2011).</li>
<li>Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+psittaci+genome%2C+a+comparative+analysis+of+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens.</a> PLoS One. 7 (4), e35097(2012).</li>
<li>Jeffrey, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+recent+clinical+Chlamydia+trachomatis+strains+identifies+loci+associated+with+tissue+tropism+and+regions+of+apparent+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination.</a> Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).</li>
<li>Gomes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Chlamydia+trachomatis+diversity+occurs+by+widespread+interstrain+recombination+involving+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots.</a> Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).</li>
<li>DeMars, R., Weinfurter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+gene+transfer+in+Chlamydia+trachomatis+in+vitro%2C+mechanism+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance.</a> J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).</li>
<li>Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+gene+transfer+in+vitro+in+the+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis.</a> J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li>
<li>Tipples, G., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+initial+characterization+of+a+series+of+Chlamydia+trachomatis+isolates+selected+for+hydroxyurea+resistance+by+a+stepwise+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure.</a> J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).</li>
<li>Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+trimethoprim-+and+sulphisoxazole-resistant+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis.</a> Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).</li>
<li>Scidmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+Laboratory+Maintenance+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11(2005).</li>
<li>Li, H., Ruan, J., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+short+DNA+sequencing+reads+and+calling+variants+using+mapping+quality+scores%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores.</a> Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+tetracycline+resistance+among+Chlamydia+spp.+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).</li>
<li>Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incision+by+UvrABC+excinuclease+is+a+step+in+the+path+to+mutagenesis+by+psoralen+crosslinks+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%2C+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathog. 7 (9), e1002258(2011).</li>
</ol>

Er is niets te onthullen.

Deze methode voldoet aan de basiseisen voor genetische analyse als het vaststelt koppeling tussen genotypes en fenotypes. Belangrijk is dat deze wordt gerealiseerd zonder de hulp van conventionele moleculaire hulpmiddelen voor recombinant DNA transformatie en insertie inactivatie van genen in bacteriën, die vaak een snelheidsbeperkende stap in de analyse van genfunctie in non-model microben. Een cruciale stap is om klonaliteit van plaque-gezuiverde mutanten te garanderen. Kruisbesmetting met...

De obligaat intracellulaire bacterie Chlamydia trachomatis is goed voor een geschatte 2,8 miljoen genitale infecties per jaar in de Verenigde Staten (Center for Disease Control) met bijbehorende complicaties zoals bekken ontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschappen en onvruchtbaarheid (1). Chlamydia spp hebben een unieke fysiologie met een bifasische ontwikkelingscyclus uit twee vormen: de infectieuze maar niet replicerende elementaire lichaam (EB) en infectueuze maar replicatieve netvormige body (RB). Infectie begint met de bevestiging van EBS aan epitheelcellen endoctyotosis gevolgd door (2). Binnen een membraangebonden vacuole genoemd een opname, EBS differentiëren in de RB vorm, die vervolgens repliceert door binaire splijting. Halverwege de cyclus, RBS overgangen terug in EBS, die vervolgens worden uitgestoten in de extracellulaire ruimte om nieuwe serie infecties teweeg wanneer de gastheercel lyses (3). C. trachomatis isongevoelig routine manipulatie met standaard moleculaire genetische hulpmiddelen, zoals gerichte genvervanging, transposons en transducerende fagen, die centraal in de meeste studies in bacteriële genetica hebben, is onduidelijk welke mate individuele Chlamydia genen in het ontduiken van aangeboren immuniteit , nutriënten verwerving, ontwikkelings overgangen of andere processen van belang voor het overleven van de ziekteverwekker in een eukaryotische gastheer (4). Bijgevolg is deze ziekteverwekker blijft slecht gekarakteriseerd ondanks zijn klinisch belang. De genomen van Chlamydia spp. zijn relatief klein (~ 1 Mb) (5) met meerdere soorten en biovars gesequenced met behulp van Next Generation sequencing technologieën. Vergelijkende genoomanalyse door WGS heeft een uniek inzicht in de evolutie van Chlamydia species en hun aanpassing aan de mens (6-8) en tot op zekere hoogte heeft enige informatie verstrekt over de mogelijke functie van virulentiefactoren (9, 10). THij genetische diversiteit weergegeven door klinische isolaten niet voorziet de resolutie die nodig is om systematisch in kaart de functie van de meeste virulentiefactoren, vermoedelijk omdat mutaties in dergelijke genen zou zijn gemakkelijk geselecteerd tegen. Zonder verstorende effecten van natuurlijke selectie, mutageen-geïnduceerde gen variant, in combinatie met gedefinieerde assays die maatregel defecten in virulentie, kan het spectrum van mutaties die kunnen worden onderzocht breiden. Chemische mutagenen, in het bijzonder, zijn nuttig als ze null, voorwaardelijke, hypomorphic (verminderde functie) te genereren en hypermorphic (gain of function) allelen. Met de komst van robuuste volgende generatie genoom-sequencing technologieën, kunnen dergelijke mutaties gemakkelijk worden geïdentificeerd en in kaart gebracht. Op deze wijze kan worden sterke associaties tussen veranderingen in een gen of genetische weg en een gemeenschappelijk fenotype, waardoor de toepassing van voorwaartse genetische methoden. Het genoom sequenties van klinische stammen geopenbaard mosaicism bussen serovars en loci van frequente recombinatie (11). Empirisch bewijs voor recombinatie werd aangetoond door de co-infectie van twee verschillende antibiotica resistente stammen en selectie van dual resistente recombinant nageslacht, die werd geopenbaard aan genetische bijdragen van beide stammen (12, 13) hebben. Aldus genetische uitwisseling tussen wild type en mutante stammen in een co-infectie instelling maakt scheiding van chemisch-geïnduceerde mutaties op te sporen het aangetaste gen dat leidt tot de waargenomen fenotype. Hier beschrijven we een werkwijze voor genetische analyse Chlamydia basis van chemische mutagenese, WGS en een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen (14) (fig. 1) uitvoeren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Cellgro</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl methanesulfonaat (EMS) </td><td>Sigma</td><td>M0880</td><td></td></tr><tr><td>Cyclohexamide</td><td>Sigma</td><td>C4859-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine </td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing met 0,493 mM MgCl2 en 0,901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td><td>Life Technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x SPG buffer (1,25 M sucrose, 50 mM natriumfosfaat, 25 mM glutaminezuur)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPG buffer (0,25 M sucrose, 10 mM natriumfosfaat, 5 mM glutaminezuur)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water (steriele, weefselkweekkwaliteit)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x DMEM (bereid uit poeder, gebufferd met 7,4 g/L natriumbicarbonaat)</td><td>Sigma</td><td>D7777</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren (NEAA) </td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1,2% GTG agarose, geautoclaveerd</td><td>Lonzo</td><td>50070</td><td></td></tr><tr><td>Genoom DNA zuiveringskits</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Life Technologies</td><td>10503-027</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (moleculaire biologie kwaliteit)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mM NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 weefselkweekkolven (T25 kolven)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well weefselkweekplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-well weefselkweekplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well weefselkweekplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemische veiligheidskast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>>Centrifuge en adapters voor het draaien van weefselplaten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer (Qubit)</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

forward genetische technieken in<em&gt; chlamydia trachomatis</em

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, het etiologische agens van seksueel overdraagbare ziekten en oculaire infecties, blijft weinig gekarakteriseerd door zijn ontoegevendheid experimentele transformatie met recombinant DNA. We ontwikkelden een aanpak om genetische analyses uit te voeren in C. trachomatis ondanks het gebrek aan moleculair genetische hulpmiddelen. Onze methode bestaat uit: i) chemische mutagenese om snel genereren van uitgebreide bibliotheken van genetisch gedefinieerde mutanten met verschillende fenotypes; ii) hele genoom sequencing (WGS) naar de onderliggende genetische letsels in kaart en associaties tussen gemuteerde gen (s) te vinden en.. een gemeenschappelijk fenotype;. iii) genereren van recombinante stammen door co-infectie van zoogdiercellen met mutant en wild type bacterie. Dienovereenkomstig, waren we in staat om causale verbanden tussen genotypes en fenotypes vestigen. De koppeling van chemisch-geïnduceerde gen variatie en WGS aan correlatieve genotype-fenotype associaties vast Should in grote lijnen van toepassing zijn op de grote lijst van medisch en ecologisch belangrijke micro-organismen momenteel hardnekkige naar genetische analyse.

Blootstelling aan mutageen tot insluitsels die zonder bacteriën, waarschijnlijk als gevolg van bacteriële celdood verschijnen. Kenmerkend zal serovar LGV-L2 volledig lyseren geïnfecteerde cellen binnen 48 uur na infectie, maar behandeling met mutagene kan deze cyclus uitbreiden tot&gt; 90 h. Ongeveer 10% van de insluitingen verwachting herstellen. In onze experimenten geïnfecteerde Vero cellen behandeld met 20 mg / ml EMS tot een afname 99% in de terugwinning van infectueuze nageslacht vergeleken met onbehandelde contro...

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Het algemene doel van deze procedure is om genetische analyse uit te voeren op chlamydia tritus door middel van chemische mutagenese en het bepalen van genotype-fenotype-associaties. Dit wordt bereikt door eerst chlamydia tracom-mutante stammen te genereren met behulp van chemische mutagenese. Vervolgens worden alle chemisch gegenereerde mutaties geïdentificeerd via whole genome sequencing, gevolgd door referentiegestuurde genoomassemblage.Vervolgens worden de associaties tussen fenotype en genotype in de mutante stammen geïdentificeerd. Ten slotte worden deze associaties bevestigd door recombinante stammen te genereren en te analyseren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat een mutatie in een specifiek chlamydia-gen leidt tot een fenotype van belang, door middel van een combinatie van klassieke chemische mutagenese-benaderingen en next-generation sequencing.Er zijn momenteel geen methoden beschikbaar voor genvervanging in chlamydia en moleculair-genetische instrumenten voor de studie hiervan staan nog in de kinderschoenen. Deze methode vereist geen transformatie met recombinant DNA of de ontwikkeling van moleculair-genetische instrumenten, maar bereikt t

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een Menselijke eileider Model voor Onderzoek van<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infecties

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Hier presenteren we een protocol om sequencing van het hele genoom van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen uit klinische monsters mogelijk te maken met behulp van doelverrijking. Deze nieuwe, syndromale panelgebaseerde methode overwint de uitdagingen van overvloedig menselijk DNA en lage bacteriële belasting, waardoor genomische surveillance voor Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum en Mycoplasma genitalium wordt vergemakkelijkt.

Genereren van hele bacteriële genomen uit klinische monsters met behulp van een workflow voor doelverrijking

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Amoebal coculture is een celcultuur systeem met aanhangend amoeben om selectief te groeien intracellulaire pathogenen kunnen fagocytcellen zoals amoeben en macrofagen weerstaan. Het vormt dus een belangrijk instrument om nieuwe infectieuze agentia te ontdekken. Amoebal verrijking laat ontdekking van nieuwe amoebal soorten en hun specifieke intracellulaire bacteriën.

Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Leer genetische analyse van Chlamydia trachomatis via chemische mutagenese en whole genome sequencing. Deze methode identificeert genotype-fenotype associaties en ontwikkelt een DNA-uitwisselingssysteem voor genetische mapping.

Forward Genetische technieken in

Meer video's verkennen