Name: Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Leer hoe je MAPK-geïnduceerde genexpressie in enkele gistcellen kwantificeert met behulp van levende-celmicroscopie en flowcytometrie. Deze methoden bieden unieke inzichten in signaaltransductieprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Matthias Peter en zijn groep aan het Instituut voor Biochemie aan de ETH in Zürich, waar deze methoden zijn ontwikkeld. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation.

1. Microscopie Metingen <ol><li> Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist. </li><li> Groeien cellen bij 30 ° C gedurende de nacht. </li><li> Meet de OD 600 van de overnacht cultuur de volgende ochtend. </li><li> Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium om OD600 0,05. </li><li> Groeien de verdunde cultuur bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur. </li><li> Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium. </li><li> Bereid een 1 mg / ml oplossing van Concanavaline A (ConA) in PBS. </li><li> Het filtraat -200 pl ConA oplossing in de put dia. </li><li> Laat staan ​​voor 30 minuten. </li><li> Verwijder ConA oplossing. </li><li> Voeg 150 ul H2O aan de put. </li><li> Verwijder H2O </li><li> Meet OD 600 van celkweek. </li><li> Bereid 300 ul van celkweek bij OD 600 = 0,02 in een 1,5 ml microbuis. </li><li> Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 45 sec. </li><li> Vortex kort de microtube. </li><li> Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 45 sec. </li><li> Vortex kort de microbuis. </li><li> Voeg 200 ul van celkweek aan de put. </li><li> Wacht 30 minuten te laten de cellen naar de bodem van de put. </li><li> Plaats de goed dia op de microscoop. </li><li> Selecteer de belichtingsinstellingen voor de fluorescerende kanaal op te nemen. </li><li> Selecteer de belichtingsinstellingen voor twee heldere veld beelden (een enigszins onscherp: 3 micrometer onder de focal plane te zorgen voor een goede segmentatie van de cellen). </li><li> Selecteer de tijdsintervallen voor de time-lapse-meting </li><li> Selecteer de velden die gezien op de foto. </li><li> Start de verwerving van een paar frames. </li><li> Pauzeer de overname van de 100 pi van 0,6 M NaCl medium toe te voegen. </li><li> Resume beeldvorming. </li></ol> 2. Flowcytometrie Metingen <ol><li> Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist. </li><li> Groeien bij 30 ° C gedurende de nacht. </li><li> Maatregelde OD 600 van de overnacht cultuur de volgende ochtend. </li><li> Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium OD 600 0.1. </li><li> Groeien bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur tot een OD600 van 0,2-0,4 bereikt. </li><li> Bereid cycloheximide oplossing 1 mg / ml in H2O </li><li> Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium. </li><li> Bereid een 1,5 ml microbuisjes met 100 ul van 0,6 M NaCl medium voor elk tijdstip te meten. </li><li> Op tijdstip 0, voeg 200 ul celkweek aan elke microbuis. </li><li> Incubeer onder schudden bij 30 ° C. </li><li> Op tijdstip T, voeg 30 pl cycloheximide een microbuis. </li><li> Herhaal stap 2.11 voor alle gewenste tijdstippen. </li><li> Incubeer alle microbuisjes gedurende tenminste 45 minuten en tot 3 uur bij 30 ° C onder schudden. </li><li> Bereid FACS buizen met 400 ul PBS. </li><li> Ultrasone trillingen de cellen in een waterbad gedurende 1 minuut. </li><li> Vortex kort de microtubes. </li><li> Zooncaat op de cellen in een waterbad gedurende 1 minuut. </li><li> Vortex kort de microtubes. </li><li> Voeg 100 ul celkweek uit elke microbuisje naar de bijbehorende FACS buis. </li><li> Selecteer de 488 nm laser excitatie en 530/30 nm banddoorlaatfilter voor detectie. </li><li> Test niet tot expressie en volledig uitdrukken steekproef om te controleren of ze vallen in de gevoeligheid detector bereik. </li><li> Meet 10.000 cellen voor elk verworven monster. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Microscopie De behandeling van het goed met ConA is een essentiële stap voor een goede beeldvorming van de cellen te waarborgen. Omdat ConA is slecht oplosbaar in PBS (5 mg / ml), het filtratieproces kan de verwijdering van grote aggregaten die in de ongefilterde oplossing zijn en storen de beeldvorming. Cellen hechten relatief sterk aan het behandelde oppervlak en de toevoeging van de inducerende oplossing niet de lokalisatie van de cellen te verstoren, waardoor een continu volgen voor en na d...

Signalering via transductie cascades vaak culmineert in de expressie van eiwitten. De karakterisering van deze expressieprofiel is een belangrijk element in het begrijpen van de functie van biologische wegen. De identificatie van het spectrum van up-gereguleerde eiwitten en de dynamiek van hun activering kan worden bereikt door verschillende technieken, zoals micro-arrays, Northern blots en Western-blots 1-3. Echter, deze technieken gemiddelde van de respons van een gehele celpopulatie. De fijne regeling van de expressie van eiwitten te begrijpen, is het wenselijk om metingen te verzamelen op enkele cel. Idealiter zouden deze metingen ook kwantitatieve gegevens vatbaar voor wiskundige modellen van de onderliggende route ontwikkelen. Microscopie en flowcytometrie zijn twee technieken die ideaal zijn voor dergelijke kwantitatieve cel metingen leveren. De endogene labelen van proteïnen met een fluorescerend eiwit kan be gebruikt om hun expressie niveau 4 te kwantificeren. Aangezien de toevoeging van een grote fluorescente groep aan het uiteinde van het eiwit niet meer werkt kan weergeven, is het vaak wenselijk om specifieke expressie reporters basis van een promotor die de expressie van een fluorescente construct te genereren. Deze verslaggever eiwit is exogeen aan het cellulaire systeem en dus niet de signalering evenementen die plaatsvinden in de cel beïnvloeden. Zowel microscopie en flowcytometrie zijn op grote schaal gebruikt in de signaleringsveld gist. Als voorbeelden, Colman-Lerner en collega gecorreleerd, in enkele cellen, de expressie van specifieke paring en constitutief tot expressie reporters door microscopie om de ruis in gist paring signaaltransductiecascade 5 kwantificeren Acar en collega&#39;s flowcytometrie om de regelgevingsnetwerk bestuderen die de expressie van GAL genen 6. In een eerdere studie 7, hebben we een combinati gebruiktop van deze twee technieken om de uitdrukking uitgang bestuderen van de hoge osmolariteit glycerol (HOG) route in gist. Dit mitogeen geactiveerd proteïne kinase (MAPK) route wordt geactiveerd door hyper-osmotische stress. Het resulteert in de activatie van de MAPK Hog1, die naar de kern van de cel om transcriptie programma resulteert in de expressie van ongeveer 300 genen induceren. Om dit te bestuderen, hebben we een uitdrukking reporter gebaseerd op STL1 promoter (een gen dat specifiek geïnduceerd in respons op Hog1 activiteit 8) de expressie van een viervoudige Venus fluorescerend eiwit (p STL1-qV) ontworpen. Flowcytometrie metingen ontdekt de aanwezigheid van twee populaties van cellen op intermediair spanningsniveau (0,1 M NaCl) met slechts een fractie van de populatie de expressie fluorescerende reporter. We gebruikten microscopie om dit gedrag verder te onderzoeken en ontdekte dat dit geluid in eiwit expressie werd bestuurd door intrinsieke factoren 9. We could verder zien dat cellen met een vergelijkbaar niveau van Hog1 activiteit opvallend verschillende uitkomsten uitdrukking konden geven. De combinatie van deze twee technieken konden we aantonen hoe de langzame verbouwing van stress respons genen van invloed op de expressie uitkomst op de enkele cel niveau 7. In dit document gebruiken we de expressie van het p-STL1 qV reporter geïnduceerd door hyper-osmotische shock als voorbeeld van de kwantificering van eiwitexpressie door microscopie en flowcytometrie. Dezelfde stam blootgesteld aan 0,2 M NaCl spanning werd onderzocht met beide technieken. Dit zal ons toelaten om een ​​aantal belangrijke verschillen in deze twee zeer complementaire technieken te markeren.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>CSM amino-acid mix</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus</td></tr><tr><td colspan="4">Materiaal</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>Incubatiekamer</td><td>LIS</td><td>The Box</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie lichtbron</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD</td><td>FACS calibur</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator bad</td><td>Telesonic</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8-well-slide </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Matrical bioscience</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

temporele kwantificering van mapk geïnduceerde expressie in single gistcellen

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

De kwantificering van genexpressie op het eencellige niveau onthult nieuwe regulerende mechanismen verduisterd in de metingen uitgevoerd op populatieniveau. Twee methoden op basis van microscopie en flowcytometrie worden aangetoond hoe dergelijke gegevens kunnen worden verkregen. De expressie van een fluorescerende reporter geïnduceerd na activering van de hoge osmolariteit glycerol MAPK route in gist wordt gebruikt als een voorbeeld. De specifieke voordelen van elke methode worden gemarkeerd. Flowcytometrie meet een groot aantal cellen (10.000) en een directe maat voor de dynamiek van eiwitexpressie onafhankelijk van de langzame rijping kinetiek van het fluorescerende eiwit. Beeldvorming van levende cellen door microscopie is daarentegen beperkt tot het meten van de gerijpte vorm van de reporter in minder cellen. Echter, de datasets gegenereerd door deze techniek zeer rijk dankzij de combinatie van meerdere reporters en de ruimtelijke en temporele informatieverkregen van individuele cellen. De combinatie van deze twee meetmethoden kunnen nieuwe inzichten in de regulatie van eiwitexpressie leveren door signaalwegen.

Microscopie Gist cellen die de expressie reporter p STL1-qV (ySP9 7) zijn bevestigd aan de bodem van de put-glijbaan en onder de microscoop geplaatst. De cellen werden gestimuleerd door toevoeging van stress medium direct in de put tijdens de opnamesessie. Dit stelt ons in staat om een ​​paar beelden van de cellen te verwerven voor pathway inductie en volg hun lot na de stimulatie. In het onderhavige geval werden de cellen gevolgd ~ 2 uur met een tijdsinterval van 10 minuten...

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van mitogeen-geactiveerde proteïnen op single-cell niveau te kwantificeren. Om dit te bereiken, is er een giststam gegenereerd die de fluorescente expressiereporter quadruple Venus draagt, gestuurd door de STL1-promotor en specifiek voor de activatie van de Hog1 MAP-kinase. De expressie van het fluorescente eiwit kan worden gekwantificeerd via een live-cell microscopie-assay, waarbij de cellen direct op de microscoop worden gestrest om de fluorescentie in real-time waarneembaar te maken, of via flowcytometrie, waarbij de cellen in een microbuis worden gestrest en de eiwitsynthese op een bepaald tijdstip wordt geblokkeerd.Door de toevoeging van cycloheximide kunnen met live-cell microscopie slechts enkele cellen tegelijk worden geanalyseerd, maar het lot van de individuele cellen kan direct worden waargenomen en gecorreleerd met andere cellulaire eigenschappen. Flowcytometrie maakt daarentegen ook de bepaling van mitogeen-geactiveerde eiwitexpressie in grote aantallen cellen tegelijk mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van signaaltransductie, zoals welke eiwitten betrokken zijn bij de regulatie van genexpressie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de gist-signaalroute, kan zij ook worden toegepast op andere signaalcascades, afhankelijk van de beschikbaarheid van de juiste expressiereporter.Om de cellen voorbij te bereiden voor live-cell microscopie, begint u met het inoculeren van vijf milliliter synthetisch medium met gist, waarna de cellen gedurende de nacht worden gekweekt bij 30 °C. Meet de volgende ochtend de OD 600 van de overnight-cultuur en verdun deze vervolgens in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,05. Kweek de verdunde cultuur nog ten minste vier uur bij 30 °C.Filter vervolgens ongeveer 200 µL van een vers bereide con canon a-oplossing in de well-slide. Verwijder na 30 minuten de con a-oplossing en voeg 150 µL water toe aan de well. Verwijder nu het water en laat de well drogen terwijl de cellen worden voorbereid.Meet de OD 600 van de celcultuur opnieuw en verdun de cellen vervolgens om 300 µL celcultuur met een OD 600 van 0,02 in een 1,5 ml microcentrifugebuis te verkrijgen. Sonicate de cellen in een waterbad gedurende 45 seconden. Vortex de microcentrifugebuizen kort en sonicate en vortex de cellen vervolgens opnieuw.Voeg nu 200 µL van de cellen toe aan de well slide en plaats de slide na ongeveer 30 minuten, wanneer de cellen naar de bodem van de well zijn gezakt, op de microscoop. Selecteer vervolgens de verlichtingsinstellingen voor het te registreren fluorescentiekanaal en voor twee bright-field beelden, waarbij één van de bright-field instellingen ongeveer 3 µm onder het brandvlak wordt ingesteld om een correcte celsegmentatie mogelijk te maken. Stel vervolgens de tijdsintervallen in voor de time-lapse metingen en selecteer de gezichtsvelden voor de beeldvorming.Start nu de acquisitie voor enkele frames en pauzeer deze vervolgens om 100 µL vers bereid 0,6 M natriumchloride-medium toe te voegen, waarna de beeldvorming wordt hervat om de cellen voor te bereiden op meting via flowcytometrie. Begin met het inoculeren van de gist in vijf milliliter synthetisch medium en kweek de cellen gedurende de nacht bij 30 °C. Meet de volgende ochtend de OD 600 van de nachtcultuur en verdun de celsuspensie vervolgens in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,1.Kweek de cultuur gedurende ten minste vier uur bij 30 °C tot een OD 600 van 0,2 tot 0,4 is bereikt. Voeg vervolgens 100 µL vers bereide 0,6 M natriumchloride toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis voor elk tijdstip dat op tijdstip nul gemeten moet worden. Voeg 200 µL cellen toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer de culturen onder schudomstandigheden bij 30 °C.Voeg vervolgens op elk experimenteel tijdstip 30 µL vers bereide cycloheximide toe aan een van de microbuisjes. Terwijl de microbuisjes incuberen, voegt u 400 µL PBS toe aan een overeenkomstige FACS-buis voor elk microbuisje. Vortex de microbuisjes na de incubatie kort en soniceer vervolgens de cellen in een waterbad gedurende één minuut, zoals zojuist gedemonstreerd.Voeg vervolgens 100 µL celcultuur uit elke microbuis toe aan de overeenkomstige buis bij de flowcytometer. Laad de juiste excitatie- en detectie-instellingen en test de niet-expresserende en volledig expresserende monsters om te verifiëren dat deze binnen het gevoeligheidsbereik van de detector vallen. Meet tot slot 10.000 cellen voor elk monster in deze beelden, waarbij gistcellen die het expressiereporter-eiwit quadruple venous protein dragen onder controle van de TL1-promotor en aan de bodem van een well-slide zijn gehecht, werden gestimuleerd door directe toevoeging van stressmedium.Zoals zojuist gedemonstreerd, werden de cellen gedurende ongeveer twee uur met intervallen van 10 minuten gemonitord, waarbij beelden werden vastgelegd zowel vóór als na toevoeging van de stimulus. Let op de fluorescerende expressie van de reporter tijdens de activatie van de cellen. Om de kwantitatieve informatie in deze beelden te extraheren, moet hier een complex proces van beeldanalyse worden uitgevoerd.De resultaten verkregen met het yeast quant analyseplatform worden getoond. Elke rode lijn vertegenwoordigt de temporele evolutie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van één enkele cel. De blauwe lijn illustreert de mediaan van meer dan 500 cellen die gesegmenteerd en gevolgd zijn gedurende 20 frames van vijf time-lapse video's, opgenomen vanuit vijf verschillende gezichtsvelden van dezelfde well; het lichtblauwe gebied vertegenwoordigt het 25ste en 75ste percentiel van alle intensiteiten die op een bepaald tijdstip zijn gemeten. Om de dynamiek van de expressie van dezelfde reporter via flowcytometrie te bestuderen, werd Cycloheximide op verschillende tijdstippen met intervallen van 5 tot 10 minuten toegevoegd aan de gistcelculturen.Het geneesmiddel blokkeert de synthese van nieuwe eiwitten, maar de rijping van het reeds tot expressie gekomen fluorescerende eiwit wordt niet verstoord. Daarom kan de eiwitexpressie, gevisualiseerd door de verschuiving van het histogram naar rechts, worden gekwantificeerd op het moment van Cycl H-toevoeging, waardoor de problemen die gepaard gaan met de rijping van fluorescerende eiwitten worden omzeild. In deze grafiek worden de dynamieken van de expressierapporteur, gemeten via microscopie of flowcytometrie, vergeleken; terwijl het fluorescerende signaal volgens de microscopie pas 30 tot 40 minuten na toevoeging van het stressmedium stijgt, geven de flowcytometrie-metingen duidelijk aan dat de eiwitten al tussen 10 en 15 minuten na de stimulus zijn geproduceerd, wat de langzame rijping van de fluorescerende eiwitten aantoont.Beide technieken maken toegang tot informatie op enkelcelniveau mogelijk voor deze eenvoudige experimenten; de variabiliteit tussen drie biologische replica's is klein in vergelijking met de grote variabiliteit die wordt waargenomen in de enkelcelresponsen via microscopie of flowcytometrie. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals deze responsmetingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de drempelwaarde is voor genexpressie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u eiwitexpressie op enkelcelniveau kunt meten met een microscoop of flowcytometrie.

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle techniek voor de visualisatie van de groeiende geïmmobiliseerde gistcellen, hier toegepast op de TL-verslaggevers bij de stille paring loci HML en...

Een snelle techniek voor de visualisatie van Live Geïmmobiliseerd gistcellen

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We presenteren een eenvoudig protocol voor fluorescentie microscopie films van groeiende gistcellen, en een GUI-gebaseerde software pakket om eencellige tijdreeks gegevens te extraheren verkrijgen. De analyse omvat geautomatiseerde afstamming en verdeeldheid tijd opdracht geïntegreerd met visuele inspectie en handmatige curatie van bijgehouden gegevens.

Het verwerven Fluorescentie Time-lapse films van Budding gist en analyseren van Single-cell Dynamics behulp enten

De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer hoe je MAPK-geïnduceerde genexpressie in enkele gistcellen kwantificeert met behulp van levende-celmicroscopie en flowcytometrie. Deze methoden bieden unieke inzichten in signaaltransductieprocessen.

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Meer video's verkennen