Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen
October 4th, 2013
Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van mitogeen-geactiveerde eiwitten op enkelcelniveau te kwantificeren. Om dit te bereiken, werd een giststam gegenereerd die de fluorescente expressiereporter quadruple Venus draagt, gecontroleerd door de STL een-promotor en specifiek voor de activering van de hog een-map-kinase. Fluorescerende eiwitexpressie kan worden gekwantificeerd door middel van een levende celmicroscopietest waarin de cellen direct op de microscoop worden belast om de real-time verschijning van de fluorescentie te vergemakkelijken of door middel van flowcytometrie, in welk geval de cellen worden belast in een microbuis en de eiwitsynthese wordt geblokkeerd op een bepaald tijdstip.
Door de toevoeging van cyclo heide, kunnen slechts een paar cellen tegelijk worden geanalyseerd met levende celmicroscopie, maar het lot van de individuele cellen kan direct worden waargenomen en gecorreleerd met andere cellulaire eigenschappen. Flowcytometrie daarentegen, maakt ook de beoordeling mogelijk van mitogeen-geactiveerde eiwitexpressie op grote aantallen cellen tegelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van signalering, zoals welke eiwitten betrokken zijn bij de regulatie van genexpressie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de gistroute, kan deze ook worden toegepast op andere signaalcascade afhankelijk van de beschikbaarheid van de juiste expressiereporter.
Om de cellen voor levende celmicroscopie voor te bereiden, begin met het inoculeren van vijf milliliter synthetisch medium met gist en laat de cellen vervolgens een nacht groeien bij 30 graden Celsius. De volgende ochtend meet u de OD 600 van de overnachtelijke cultuur en verdunt u vervolgens de overnachtelijke cultuur in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,05. Laat de verdunde cultuur nog minstens vier uur groeien bij 30 graden Celsius.
Filter vervolgens ongeveer 200 microliter vers bereide connavalente a-oplossing in de puttenplaat. Verwijder na 30 minuten de con a-oplossing en voeg 150 microliter water toe aan de put. Verwijder nu het water en laat de put drogen terwijl de cellen worden voorbereid.
Meet de OD 600 van de celcultuur opnieuw en verdun vervolgens de cellen om 300 microliter celcultuur te verkrijgen met een OD 600 van 0,02 en een 1,5 milliliter microbuis. Soniceer de cellen in een waterbad gedurende 45 seconden. Vortex de microbuizen kort en soniceer en vortex vervolgens de cellen opnieuw.
Voeg nu 200 microliter van de cellen toe aan de puttenplaat en laat de cel zich ongeveer 30 minuten op de bodem van de put nestelen. Plaats vervolgens de plaat op de microscoop. Selecteer vervolgens de verlichtingsinstellingen voor hun fluorescentiekanaal dat moet worden geregistreerd en voor twee heldere veldbeelden, waarbij een van de heldere veldinstellingen ongeveer drie micrometer onder het brandvlak wordt aangepast om een goede celafscheiding mogelijk te maken. Stel vervolgens de tijdsintervallen in voor de time-lapse metingen en selecteer de beeldvelden voor beeldvorming.
Start nu de acquisitie voor een paar frames en pauzeer vervolgens de acquisitie om 100 microliter vers bereide 0,6 molar natriumchloridemedium toe te voegen en hervat de beeldvorming om de cellen voor meting door flowcytometrie voor te bereiden. Begin met het inoculeren van de gist in vijf milliliter synthetisch medium en laat de cellen een nacht groeien bij 30 graden Celsius. De volgende ochtend meet u de OD 600 van de overnachtelijke cultuur en verdunt u vervolgens de celsuspensie in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,1.
Laat de cultuur minimaal vier uur groeien bij 30 graden Celsius om een OD 600 van 0,2 tot 0,4 te bereiken. Voeg vervolgens 100 microliter vers bereid 0,6 molar natriumchloride toe aan een 1,5 milliliter microbuis voor elk tijdstip dat op tijd nul wordt gemeten. Voeg 200 microliter cellen toe aan elke microbuis en incubeer de culturen met schudden bij 30 graden Celsius.
Voeg vervolgens op elk van de experimentele tijdstippen 30 microliter vers bereid cyclo heide toe aan een van de microbuizen. Terwijl de microbuizen incuberen, voegt u 400 microliter PBS toe aan een corresponderende faxbuis voor elke microbuis. Na de incubatie, vortex de microbuizen kort en soniceer vervolgens de cellen en voeg een waterbad toe gedurende één minuut zoals zojuist is aangetoond.
Voeg vervolgens 100 microliter celcultuur van elke microbuis toe aan zijn corresponderende faxbuis bij de flow van de cytometer. Laad de juiste excitatie- en detectie-instellingen en test de niet-expresserende en volledig expresserende monsters om te verifiëren dat ze binnen het gevoeligheidsbereik van de detector vallen. Ten slotte meet u 10.000 cellen voor elk monster in deze afbeeldingen, gistcellen die de expressiereporter quadruple veneuze proteïne dragen onder de controle van de TL een-promotor en bevestigd aan de bodem van een puttenplaat, werden gestimuleerd door directe editie van stressmedium.
Zoals zojuist is aangetoond, werden de cellen gedurende ongeveer twee uur met tussenpozen van 10 minuten gemonitord en werden afbeeldingen zowel vóór als na de editie van de stimulus verkregen. Let op de fluorescente expressie van het rapport tijdens de geactiveerde cellen. Om de kwantitatieve informatie in deze afbeeldingen te extraheren, moet hier een complex beeldanalyseproces worden uitgevoerd.
Het resultaat verkregen met het gist-kwant-analyseplatform wordt getoond. Elke rode lijn vertegenwoordigt de temporele evolutie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een enkele cel. De blauwe lijn illustreert de mediaan van meer dan 500 cellen die zijn gesegmenteerd en gevolgd gedurende 20 frames van vijf time-lapse films verkregen vanuit vijf verschillende beeldvelden van dezelfde put. Het lichtblauwe gebied vertegenwoordigt de 25e en 75e percentiel van alle intensiteiten gemeten op een bepaald tijdstip om de dynamiek van de expressie van dezelfde reporter door flowcytometrie te bestuderen. Cycloheximide werd in verschillende tijdstippen toegevoegd aan de gistcelculturen met tussenpozen van vijf tot 10 minuten.
Het medicijn blokkeert de synthese van nieuwe eiwitten, maar de rijping van het reeds tot expressie gebrachte fluorescerende eiwit
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert twee complementaire methoden voor het kwantificeren van genexpressiedynamiek op het niveau van een enkele cel in gist, met specifiek aandacht voor de activering van de MAPK-route. De gebruikte technieken omvatten live celmicroscopie en flowcytometrie, elk met unieke voordelen voor het observeren van eiwitexpressie.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Signaaltransductie
- Genexpressie
Achtergrond
- Mitogeen-geactiveerde proteïnekinasen (MAPK's) spelen een cruciale rol in cellulaire signalering.
- Begrip van genexpressieregulatie is essentieel voor inzichten in verschillende biologische processen.
- Gist dient als modelorganisme voor het bestuderen van MAPK-routes.
- Fluorescente reporter kunnen worden gebruikt om genexpressieveranderingen in real-time te visualiseren.
Doel van het onderzoek
- Om MAPK-expressie op het niveau van een enkele cel in gist te kwantificeren.
- Om de effectiviteit van live celmicroscopie en flowcytometrie te vergelijken bij het meten van genexpressie.
- Om de regulatorische eiwitten te onderzoeken die betrokken zijn bij genexpressiemodulatie.
Gebruikte methoden
- Generatie van een giststam met een fluorescente expressiereporter.
- Live celmicroscopie om real-time fluorescentie in gestreste cellen te observeren.
- Flowcytometrie voor het analyseren van grote populaties cellen.
- Gebruik van cycloheximide om eiwitsynthese op specifieke tijdstippen te blokkeren.
Belangrijkste resultaten
- Beide methoden hebben met succes genexpressiedynamiek gekwantificeerd.
- Live celmicroscopie heeft gedetailleerde inzichten geboden in het gedrag van individuele cellen.
- Flowcytometrie heeft de analyse van grote celpopulaties mogelijk gemaakt.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van de signaalroutes in gist en mogelijk andere organismen.
Conclusies
- De studie demonstreert de nuttigheid van het combineren van microscopie en flowcytometrie voor genexpressieanalyse.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar MAPK-signaalroutes informeren.
- Deze methoden kunnen worden aangepast voor andere signaalcascades met geschikte reporter.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying gene expression dynamics at single-cell resolution enables mechanistic de-risking of signaling pathway targets by revealing heterogeneity masked in bulk assays. This approach supports target validation and assay development in early discovery by providing quantitative, time-resolved readouts of pathway activation. The combination of microscopy and flow cytometry offers complementary scalability and phenotypic depth for predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking MAPK activation to single-cell reporter dynamics.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct correlation of stimulus timing with protein expression kinetics.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing transient vs. sustained pathway activation across cell populations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Flow cytometry provides standardized, high-throughput quantification of expression dynamics across 10,000+ cells.
- Reproducibility: Cycloheximide-based pulse-chase design enables isolation of synthesis-dependent signals, reducing confounding from reporter maturation.
- Multiplex Potential: Microscopy supports spatial and temporal co-detection of multiple reporters for pathway crosstalk analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Yeast MAPK pathway conservation allows mechanistic insights transferable to mammalian stress-response signaling.
- Translational Continuity: Single-cell resolution aids in identifying subpopulation responses relevant to fractional drug effects.
- Preclinical Modeling: Enables de-risking of targets by quantifying expression noise and response thresholds in isogenic systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis screening to lead optimization, where dynamic pathway modulation informs structure-activity relationships.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how genetic or pharmacological perturbations alter MAPK-driven expression timing and amplitude.
- Screening: Enables assay standardization through flow cytometry’s ability to generate population-level dynamics with single-cell sensitivity.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables (fluorescence intensity over time) that support statistical comparison of conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a disease-relevant system for studying conserved signaling nodes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating kinase modulator effects across signaling cascades with appropriate reporters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving cell-to-cell variability in pathway activation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable readouts compatible with automation-friendly workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing activation thresholds and response heterogeneity early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, dynamic target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, fluorescent reporter design, and microfluidic or microscopy-based stress delivery.
- Dependent on access to live-cell imaging systems and flow cytometers with compatible excitation/detection settings for Venus-derived reporters.
- Necessitates standardized protocols for stress induction (e.g., osmolarity shift) and translational arrest (e.g., cycloheximide) to ensure temporal precision.
- Adaptation to mammalian systems requires validation of promoter-reporter orthogonality and stress-response conservation.
- Practical limitations include reporter maturation kinetics affecting real-time accuracy in microscopy, mitigated by flow cytometry pulse-chase designs.
