Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de expressie van mitogeen-geactiveerde proteïnen op single-cell niveau te kwantificeren. Om dit te bereiken, is er een giststam gegenereerd die de fluorescente expressiereporter quadruple Venus draagt, gestuurd door de STL1-promotor en specifiek voor de activatie van de Hog1 MAP-kinase. De expressie van het fluorescente eiwit kan worden gekwantificeerd via een live-cell microscopie-assay, waarbij de cellen direct op de microscoop worden gestrest om de fluorescentie in real-time waarneembaar te maken, of via flowcytometrie, waarbij de cellen in een microbuis worden gestrest en de eiwitsynthese op een bepaald tijdstip wordt geblokkeerd.

Door de toevoeging van cycloheximide kunnen met live-cell microscopie slechts enkele cellen tegelijk worden geanalyseerd, maar het lot van de individuele cellen kan direct worden waargenomen en gecorreleerd met andere cellulaire eigenschappen. Flowcytometrie maakt daarentegen ook de bepaling van mitogeen-geactiveerde eiwitexpressie in grote aantallen cellen tegelijk mogelijk. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van signaaltransductie, zoals welke eiwitten betrokken zijn bij de regulatie van genexpressie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de gist-signaalroute, kan zij ook worden toegepast op andere signaalcascades, afhankelijk van de beschikbaarheid van de juiste expressiereporter.

Om de cellen voorbij te bereiden voor live-cell microscopie, begint u met het inoculeren van vijf milliliter synthetisch medium met gist, waarna de cellen gedurende de nacht worden gekweekt bij 30 °C. Meet de volgende ochtend de OD 600 van de overnight-cultuur en verdun deze vervolgens in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,05. Kweek de verdunde cultuur nog ten minste vier uur bij 30 °C.

Filter vervolgens ongeveer 200 µL van een vers bereide con canon a-oplossing in de well-slide. Verwijder na 30 minuten de con a-oplossing en voeg 150 µL water toe aan de well. Verwijder nu het water en laat de well drogen terwijl de cellen worden voorbereid.

Meet de OD 600 van de celcultuur opnieuw en verdun de cellen vervolgens om 300 µL celcultuur met een OD 600 van 0,02 in een 1,5 ml microcentrifugebuis te verkrijgen. Sonicate de cellen in een waterbad gedurende 45 seconden. Vortex de microcentrifugebuizen kort en sonicate en vortex de cellen vervolgens opnieuw.

Voeg nu 200 µL van de cellen toe aan de well slide en plaats de slide na ongeveer 30 minuten, wanneer de cellen naar de bodem van de well zijn gezakt, op de microscoop. Selecteer vervolgens de verlichtingsinstellingen voor het te registreren fluorescentiekanaal en voor twee bright-field beelden, waarbij één van de bright-field instellingen ongeveer 3 µm onder het brandvlak wordt ingesteld om een correcte celsegmentatie mogelijk te maken. Stel vervolgens de tijdsintervallen in voor de time-lapse metingen en selecteer de gezichtsvelden voor de beeldvorming.

Start nu de acquisitie voor enkele frames en pauzeer deze vervolgens om 100 µL vers bereid 0,6 M natriumchloride-medium toe te voegen, waarna de beeldvorming wordt hervat om de cellen voor te bereiden op meting via flowcytometrie. Begin met het inoculeren van de gist in vijf milliliter synthetisch medium en kweek de cellen gedurende de nacht bij 30 °C. Meet de volgende ochtend de OD 600 van de nachtcultuur en verdun de celsuspensie vervolgens in vijf milliliter synthetisch medium tot een OD 600 van 0,1.

Kweek de cultuur gedurende ten minste vier uur bij 30 °C tot een OD 600 van 0,2 tot 0,4 is bereikt. Voeg vervolgens 100 µL vers bereide 0,6 M natriumchloride toe aan een 1,5 ml microcentrifugebuis voor elk tijdstip dat op tijdstip nul gemeten moet worden. Voeg 200 µL cellen toe aan elke microcentrifugebuis en incubeer de culturen onder schudomstandigheden bij 30 °C.

Voeg vervolgens op elk experimenteel tijdstip 30 µL vers bereide cycloheximide toe aan een van de microbuisjes. Terwijl de microbuisjes incuberen, voegt u 400 µL PBS toe aan een overeenkomstige FACS-buis voor elk microbuisje. Vortex de microbuisjes na de incubatie kort en soniceer vervolgens de cellen in een waterbad gedurende één minuut, zoals zojuist gedemonstreerd.

Voeg vervolgens 100 µL celcultuur uit elke microbuis toe aan de overeenkomstige buis bij de flowcytometer. Laad de juiste excitatie- en detectie-instellingen en test de niet-expresserende en volledig expresserende monsters om te verifiëren dat deze binnen het gevoeligheidsbereik van de detector vallen. Meet tot slot 10.000 cellen voor elk monster in deze beelden, waarbij gistcellen die het expressiereporter-eiwit quadruple venous protein dragen onder controle van de TL1-promotor en aan de bodem van een well-slide zijn gehecht, werden gestimuleerd door directe toevoeging van stressmedium.

Zoals zojuist gedemonstreerd, werden de cellen gedurende ongeveer twee uur met intervallen van 10 minuten gemonitord, waarbij beelden werden vastgelegd zowel vóór als na toevoeging van de stimulus. Let op de fluorescerende expressie van de reporter tijdens de activatie van de cellen. Om de kwantitatieve informatie in deze beelden te extraheren, moet hier een complex proces van beeldanalyse worden uitgevoerd.

De resultaten verkregen met het yeast quant analyseplatform worden getoond. Elke rode lijn vertegenwoordigt de temporele evolutie van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van één enkele cel. De blauwe lijn illustreert de mediaan van meer dan 500 cellen die gesegmenteerd en gevolgd zijn gedurende 20 frames van vijf time-lapse video's, opgenomen vanuit vijf verschillende gezichtsvelden van dezelfde well; het lichtblauwe gebied vertegenwoordigt het 25ste en 75ste percentiel van alle intensiteiten die op een bepaald tijdstip zijn gemeten. Om de dynamiek van de expressie van dezelfde reporter via flowcytometrie te bestuderen, werd Cycloheximide op verschillende tijdstippen met intervallen van 5 tot 10 minuten toegevoegd aan de gistcelculturen.

Het geneesmiddel blokkeert de synthese van nieuwe eiwitten, maar de rijping van het reeds tot expressie gekomen fluorescerende eiwit wordt niet verstoord. Daarom kan de eiwitexpressie, gevisualiseerd door de verschuiving van het histogram naar rechts, worden gekwantificeerd op het moment van Cycl H-toevoeging, waardoor de problemen die gepaard gaan met de rijping van fluorescerende eiwitten worden omzeild. In deze grafiek worden de dynamieken van de expressierapporteur, gemeten via microscopie of flowcytometrie, vergeleken; terwijl het fluorescerende signaal volgens de microscopie pas 30 tot 40 minuten na toevoeging van het stressmedium stijgt, geven de flowcytometrie-metingen duidelijk aan dat de eiwitten al tussen 10 en 15 minuten na de stimulus zijn geproduceerd, wat de langzame rijping van de fluorescerende eiwitten aantoont.

Beide technieken maken toegang tot informatie op enkelcelniveau mogelijk voor deze eenvoudige experimenten; de variabiliteit tussen drie biologische replica's is klein in vergelijking met de grote variabiliteit die wordt waargenomen in de enkelcelresponsen via microscopie of flowcytometrie. Na deze procedures kunnen andere methoden, zoals deze responsmetingen, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de drempelwaarde is voor genexpressie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u eiwitexpressie op enkelcelniveau kunt meten met een microscoop of flowcytometrie.