Modellen en methoden om vervoer van Drug Delivery Systems Across Cellular Barrières Evalueer

Het algemene doel van deze procedure is het evalueren van het transport van een drug delivery-systeem of een therapeutisch agens. Dit transport vindt plaats over een cellulaire barrière, zoals een model van het gastro-intestinaal epitheel dat relevant is voor orale drug delivery. Dit wordt bereikt door eerst Caco 2-cellen te kweken op transwell-inserts om celdifferentiatie en de vorming van een cellaag mogelijk te maken.

De tweede stap is het valideren dat dit model een permeabiliteitsbarrière representeert door het meten van de transepitheliale elektrische weerstand, het immunokleuren van celverbindingen en het beoordelen van de passieve permeabiliteit van een detecteerbaar tracermolecuul. De volgende stap is het voorbereiden van het drug delivery-systeem; in dit voorbeeld worden getargete polymere nanodragers gebruikt. Dragers kunnen een medicijnlading bevatten of niet, en controles zoals niet-getargete dragers of een vrij medicijn moeten worden meegenomen.

Deze elementen zijn gelabeld met radio-isotopen om detectie mogelijk te maken. De carriers worden vervolgens na incubatie toegevoegd aan de apicale kamer boven de cellaag. Op verschillende tijdstippen worden carriers verzameld uit de apicale kamer, de basolaterale kamer en de cellaag, waarna ze worden getest op potentiële degradatie van het gelabelde component.

Vervolgens wordt het transport van nanodragers over de cellaag berekend om het transportmechanisme te onderzoeken. Vergelijkbare experimenten moeten worden uitgevoerd in aanwezigheid van farmacologische inhibitoren van transcytose door cellen of met reporters van paracellulair transport tussen cellen. De techniek die we hier beschrijven is een aanpassing van gevestigde methoden die worden gebruikt om de snelheid en het mechanisme van transport van geneesmiddelen en nanodragers voor geneesmiddelen over cellagen in kweek te evalueren, welke representatief zijn voor celbarrières in het lichaam.

Hoewel het voorbeeld waar we ons hier op hebben gericht het transport van gerichte polymere nanodeeltjes over een model van gastro-intestinaal epitheel valideert, kunnen soortgelijke methoden ook worden toegepast om de passage van verschillende systemen voor geneesmiddelentoediening over deze of andere cellagen te onderzoeken, zoals endotheelcellen die gewoonlijk een barrière vormen tussen de bloedbaan en weefsels en organen. Dit geldt bijvoorbeeld voor de bloed-hersenbarrière. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de complexiteit bij het selecteren van labels om systemen voor geneesmiddelentoediening correct te volgen in deze studies, vooral wanneer ze in kleine hoeveelheden over cellen worden getransporteerd.

Voor dit aspect zullen we radio-isotopen gebruiken om drug delivery-systemen in onze studies te labelen; een ander belangrijk aandachtspunt is het valideren van de integriteit van de modelcelbarrière en het gebruik van de juiste controles om dit gedurende de experimenten te valideren. Deze procedure wordt uitgevoerd in een steriele celkweekkap met bioveiligheidsniveau 2, en alle materialen die de kap inkomen moeten worden gesteriliseerd met ethanol. Gebruik een pincet om 0,8 µm polyethyleentereftalaat transwell-inserts in een 24-wells plaat te plaatsen voor statistisch significante resultaten.

Voor elke experimentele conditie zijn minimaal vier herhalingen vereist. Verdun menselijke epitheliale colorectale adenocarcinoom- of Caco 2-cellen in vooraf bereid celmedium. Plaats 200 tot 400 µL van de celoplossing in de bovenste of apicale kamer van de transwell.

Zaai uit bij een dichtheid van 1,5 × 10⁵ cellen per vierkante centimeter. Vul de onderste of basolaterale kamer met 700 tot 900 µL celmedium. Cultiveer de cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 16 tot 21 dagen. Vervang elke drie tot vier dagen het medium in de bovenste en onderste kamers.

Vervang het medium in de volgende volgorde om de druk boven de cellaag te behouden: aspireer het medium uit de onderste kamer en aspireer vervolgens het medium uit de bovenste kamer. Vul de bovenste kamer met 200 tot 400 µL vers medium en vul de onderste kamer met 700 tot 900 µL vers medium om de epitheliale permeabiliteitsbarrière per laag te valideren. Zet de voltmeter op de weerstandsinstelling en plaats de elektroden verticaal in een well met de transwell-insert.

De korte elektrode moet zich in de bovenste kamer bevinden en de lange elektrode in de onderste kamer, waarbij deze de bodem van de well raakt. Zodra de voltmeteruitlezing stabiliseert, wordt de weerstandswaarde in ohm voor elke well genoteerd. Herhaal de metingen elke één tot twee dagen totdat de waarden stijgen naar een maximum en stabiliseren, wat duidt op de vorming van een permeabiliteitsbarrière; dit duurt doorgaans twee tot drie weken vanaf het moment van het uitplaten van de cellen.

Om de aanwezigheid van tight junctions in celmonolagen eerst met een hoog niveau te verifiëren, moeten de cellen worden gefixeerd, het medium uit beide kamers worden geaspireerd en de cellen drie keer worden gewassen met warm DMEM, gevolgd door incubatie met koud 2% paraformaldehyde gedurende 15 minuten. Verwijder na 15 minuten het paraformaldehyde en was de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens één microgram per milliliter anti-occludine toe aan elke kamer.

Gebruik putjes met een lage doorlaatbaarheid als negatieve controle voor barrièrevorming. Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Was na 30 minuten de cellen opnieuw met PBS en voeg vervolgens 7,5 µg/mL gelabelde secundaire antilichamen toe aan elk putje; incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was tot slot de cellen met PBS en snijd voorzichtig het filtermembraan uit waarop de gefixeerde monolaag is bevestigd; monteer dit op objectglazen voor beeldvorming met behulp van epi-, fluorescentie- of confocale microscopie.

Deze procedure begint met het labelen van het target-antilichaam met jodium 125 en het berekenen van de specifieke activiteit van het gelabelde antilichaam in counts per minute per microgram met behulp van eerder gepubliceerde protocollen. In dit voorbeeld is het target-antilichaam een muis monoklonaal antilichaam tegen het menselijke intercellular adhesion molecule one, of anti-ICAM-1, om de specificiteit te controleren. Muis IgG gelabeld met jodium 125 zal worden gebruikt om niet-getargete gecoate nanodragers te bereiden om het transport van een therapeutische lading te bestuderen.

De lading is ook gelabeld met jodium 125. In dit voorbeeld is de lading alpha-galactosidase A of Alpha G, een therapeutisch enzym dat wordt gebruikt voor de behandeling van de ziekte van Fabry, een genetische lysosomale stapelingsziekte. Een van de moeilijkste aspecten van deze procedure is het waarborgen van een adequate detectie van de getransporteerde materialen.

Om succes te garanderen, moeten de nanocar-componenten worden gelabeld met een voldoende hoeveelheid isotopen bij een hoge specifieke activiteit. De volgende stap is het koppelen van het gelabelde anti-ICAM aan het oppervlak van de nanodragers. In dit geval mengen we simpelweg het iodine 1 25 gelabelde anti-ICAM met polystyreen nanokralen met een diameter van 100 nanometer als model voor de niet-specifieke controle.

Gebruik jodium-125 gelabelde IgG en gebruik voor het volgen van het transport van een lading een combinatie van anti-ICAM en jodium-125 gelabelde Alpha G. Incubeer de mengsels gedurende één uur bij kamertemperatuur om oppervlakteabsorptie mogelijk te maken; centrifugeer na één uur gedurende drie minuten bij 13.000 g en verwijder vervolgens de niet-gecoate tegenhangers in het supernatant met een aspiratiepipet om het pellet met gecoate nanodragers te suspenderen in 1% Bovine serum albumin in PBS. Sonicate vervolgens bij laag vermogen om potentiële partikelaggregaten te verbreken. Voeg jodium-125 anti-ICAM nanodragers toe aan de bovenkamer boven confluente Caco 2-monolagen met een hoge titer. Herhaal de procedure voor de aspecifieke en therapeutische tegenhangers na het meten van de titer.

Incubeer bij 37 °C gedurende één of meerdere gewenste tijdsintervallen. Meet de traan na incubatie opnieuw. De traanmetingen dienen om de effecten van nanodragers op de permeabiliteitsbarrière te beoordelen.

Verzamel het medium uit de bovenste en onderste kamers. Was de bovenste kamer met 0,5 milliliters DMEM bij 37 °C en de onderste kamer met één milliliter gedeïoniseerd water. Verzamel de wasvloeistoffen om de totale radio-isotoopinhoud te meten met een gammacounter voor de bepaling van de celfractie.

Snij het permeabele filter uit door met een scheermes langs de randen te snijden. Incubeer het filter 10 minuten in een gammatellerbuis met 1% Triton X 100 om de celinhoud vrij te maken, alvorens de celgeassocieerde totale radioactiviteit te meten om het vrijgekomen iodine 1 25 uit nanodragers tijdens transport of door potentiële degradatie te bepalen. Meng eerst 300 µL van elk monster met 700 µL 3% BSA in PBS en 200 µL trichloorazijnzuur of TCA en incubeer dit 15 minuten bij kamertemperatuur.

Meet tijdens deze incubatie van 15 minuten de totale radioactiviteit van de monsters in een gammacounter; centrifugeer de TCA-monsters bij 3000 GS gedurende vijf minuten om het intacte eiwit te scheiden van het gedegradeerde eiwit of de iodine 1 25-fractie. Kwantificeer de radioactiviteit van de vrije iodine 1 25-fractie en trek deze waarde af van de totale radioactiviteit die vóór de centrifugatie is gemeten. Dit geeft de hoeveelheid gelabeld eiwit ten opzichte van de fractie radiotracer die ervan is losgekomen. Om paracellulair transport te beoordelen met behulp van albumin paracellular leakage, worden KCO twee-monolagen op transwell-inserts gekweekt, zoals eerder gedemonstreerd; voeg aan het medium in de bovenkamer boven de cellulaire monolayer of alleen iodine 1 25-gelabeld albumine toe als negatieve controle om het basale lekniveau aan te tonen, of iodine.

Met $^{125}$I gelabeld albumine en niet radioactief gelabelde antilichamen. De gerichte nanodragers worden geïncubeerd bij 37 °C voor de gekozen tijdsintervallen, welke overeen moeten komen met de intervallen die zijn onderzocht bij het testen van nz.Transport. Meet de traan zoals eerder gedemonstreerd vóór, tijdens en na de incubatie.

Verzamel na incubatie alle fracties voor metingen van totaal jodium 1 25 en vrij jodium 1 25 als positieve controle voor het openen van intercellulaire juncties. Voeg celmedium met vijf millimolar waterstofperoxide toe aan de bovenste en onderste kamers van de transwell. Plaats deze en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.

Meet de TEER en voeg iodine 1 25 albumine toe aan de bovenkamer voor de geselecteerde tijdsintervallen. Meet de TEER op verschillende tijdstippen gedurende de incubatie om de afname van de TEER-waarde vast te stellen, veroorzaakt door de door waterstofperoxide geïnduceerde opening van de celverbindingen. Evalueer in parallelle experimenten het transcellulaire transport of de transcytose van iodine 1 25 gerichte nanodragers door confluente Caco two monolagen te incuberen met elk van deze inhibitoren.

50 µM MDC, een remmer van clathrine-gemedieerde endocytose. 1 µg/mL filipine, een remmer van caveolaire endocytose. 0,5 µM Wortmannin, een remmer van fosfatidylinositol-3-kinase, dat betrokken is bij macropinocytose, en 20 µM EIPA.

Een remmer van macropinocytose en chemisch gemedieerde endocytose werd gemeten voor, tijdens en na incubatie van cellen met remmers en radiogemarkeerde materialen als aanvullende controle voor het effect van de remmers op de permeabiliteit van de monolaag om CACO-2 monolagen te valideren als model voor trans-epitheliaal transport van gerichte nanodragers. Caco-2 cellen werden gekweekt op transwell-inserts bij 1,5 × 10⁵ cellen per vierkante centimeter en de trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) werd gemeten om de integriteit van de monolaag te beoordelen. Zoals in deze grafiek wordt getoond, bereikte de monolaag confluentie op dag 12 en bleef de integriteit van de monolaag behouden tot dag 18. Dit resultaat werd verder gevalideerd door de aanwezigheid van occludine-positieve tight junctions in monolagen met een hoge TEER van 380 Ω·cm² op dag 14, vergeleken met een zwakke labeling van tight junctions bij een lage TEER van 17 Ω·cm². Op dag 5, om het transport van anti-ICAM nanodragers over Caco-2 cellagen te beoordelen, werden confluente Caco-2 monolagen gekweekt op transwell-inserts geïncubeerd met iodine-125 anti-ICAM nanodragers die aan de apicale kamer werden toegevoegd.

Het gehalte aan Iodium 1 25 in de basolaterale kamer werd gemeten op de aangegeven tijdstippen om de hoeveelheid nanodragers getransporteerd per cel te berekenen, zoals weergegeven in het bovenste paneel. In het onderste paneel werd het percentage getransporteerde nanodragers berekend als de verhouding tussen de dragers aangetroffen in de basolaterale fractie en die in de gecombineerde basolaterale en cellulaire fracties. Deze parameters, in dit voorbeeld geschat voor Iodium 1 25 anti-ICAM nanodragers, werden ook vergeleken met die van de controle, Iodium 1 25 IgG nanodragers, om de transportefficiëntie ten opzichte van een niet-getarget tegenhangertje aan te tonen; de resultaten hiervan zijn weergegeven in het bovenste paneel.

Schijnbare permeabiliteitscoëfficiënten werden ook berekend, die de transportsnelheden van iodine 1 25 anti-ICAM nanodragers of iodine 1 25 IgG nanodragers weerspiegelen, zoals getoond in het onderste paneel wanneer het radioactieve label in de nanolading is opgenomen. De beschreven parameters weerspiegelen het transport van de lading, wat in dit voorbeeld het alpha-GA-enzym is dat wordt gebruikt voor de behandeling van een genetische lysosomale stapelingsziekte, bekend als de ziekte van Fabry. De radio-isotoopinhoud van de apicale, basolaterale en cellulaire fracties werd gemeten na drie uur en 24 uur en omgezet in diverse waarden die relevant zijn voor het transport, zoals weergegeven in deze tabel.

Naast het berekenen van het transport van nanodragers door de lading te volgen, kan de transepiteliale afgifte van dit therapeutische enzym worden geschat door dit uit te drukken als het aantal moleculen of picogrammen getransporteerde Alpha-gal per cel. Het transportmechanisme van anti-ICAM nanodragers over Caco-monolagen werd eveneens onderzocht. Het transcellulaire transport van iodine 1 25 anti-ICAM nanodragers over confluente Caco-twee monolagen werd beoordeeld na 24 uur in afwezigheid of aanwezigheid van de volgende inhibitoren: EIPA, Filipine, MDC of Wortmannine. EIPA is een inhibitor van macropinocytose en caveolae-gemedieerde endocytose. Filipine, MDC en Wortmannine zijn respectievelijk inhibitoren van clathrine-gemedieerde endocytose, clathrine-gemedieerde endocytose en macropinocytose.

Zoals aangegeven in deze grafiek, verminderde EIPA het transport van iodine 1 25 anti IAM nano-carriers over Caco-2 cellagen. Daarentegen verminderden Filipino MDC en Wirt Menin de transportniveaus niet ten opzichte van de controleconditie. Dit suggereert dat anti ICAM nano-carriers gebruikmaken van chemie-gemedieerde endocytose voor transcellulair transport, maar niet van clar, clathrine- of macropinocytose-gerelateerde transcytose.

Om het paracellulair transport te beoordelen, werd de TEER gemeten tijdens het transport van iodine 1 25 anti ICAM nanodragers door Caco-2 monoculturen. De TEER-waarden van twee monoculturen in afwezigheid van nanodragers zijn als controles weergegeven en het gestreepte interval geeft de SEM van het gemiddelde aan. Incubatie met 5 mM waterstofperoxide diende als positieve controle voor het openen van intercellulaire verbindingen, wat blijkt uit de afname van de TEER tot basale niveaus.

Daarnaast werd de paracellulaire eiwitlekken gemeten als de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt van jodium 1 25-albumine, die de cellaag passeerde in afwezigheid of aanwezigheid van vijf millimolaire waterstofperoxide, IgG-nanodragers of anti-ICAM-nanodragers. Hieruit werd berekend dat waterstofperoxide de lekken van jodium 1 25-albumine naar de basolaterale kamer aanzienlijk versterkte en diende als positieve controle, zoals weergegeven in deze grafieken. Incubatie met anti-ICAM-nanodragers veranderde de paracellulaire lekken van jodium 1 25-albumine gedurende een periode van 48 uur niet, vergelijkbaar met de controle-IgG-nanodragers die niet worden getransporteerd.

Deze resultaten sluiten paracellulair transport uit en zijn consistent met eerdere resultaten die suggereren dat anti-ICAM nanodragers gebruikmaken van CAM-gemedieerde endocytose voor transcellulair transport. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om één of meer geschikte celtypen en een permeabel filter met de juiste poriegrootte, materiaaldiameter, enzovoort voor het Transwell-model te selecteren, evenals labelingsmethoden voor een effectieve kwantificering van uw drug-delivery-systeem na deze procedure. Andere methoden, zoals fluorescentie- of transmissie-elektronenmicroscopie, kunnen worden gebruikt om de locatie van getransporteerde materialen te bepalen en daarnaast de status van getransporteerde materialen te controleren.

Western blot kan worden gebruikt om proteïnedegradatie te meten. EISA kan worden gebruikt om het targetingsvermogen van getransporteerde dragers te bepalen en de activiteit van de geneesmiddellading kan worden gemeten met spectrofotometrische assays of andere geschikte technieken.