Name: Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Leer hoe fibrinematrices met groeifactoren de overleving en differentiatie van neurale stamcellen verbeteren bij ernstige ruggenmergletsels in ratten. Deze methode ondersteunt axonale regeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de Rat Resource and Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, voor het verstrekken van GFP ratten; Neuralstem Inc verschaffen van humane neurale stamcellen. Dit werk werd ondersteund door de Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadese Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen Foundation en de Bernard en Anne Spitzer Charitable Trust.

Alle dierlijke protocollen worden goedgekeurd door VA-San Diego Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). NIH richtlijnen voor proefdier zorg en veiligheid worden strikt opgevolgd. Dieren hebben vrije toegang tot voedsel en water gedurende de studie en adequaat worden behandeld voor het minimaliseren van pijn en ongemak. 1. Voorbereiding van fibrine onderdelen die Growth Factor Cocktails <ol><li> Los 25 mg rat fibrinogeen in 0,5 ml PBS tot 50 mg / ml 2x voorraad oplossing te verkrijgen (zie ook Materiaal tabel). Fibrinogeen is moeilijk op te lossen en in een 37 ° C incubator of waterbad geplaatst en geschud elke 5-10 min gedurende 1-2 uur. </li><li> Los 100 VN trombine rat in 2 ml steriel 10 mM CaCl2 tot 50 U / ml 2x stock oplossing. </li><li> Los groeifactoren in PBS bij de volgende concentraties tot 100 pl voorraadoplossing te vinden: 1 mg / ml: BDNF; NT-3 (hoog voorraad concentratie als intrathecale infusie in vivo <sup&gt; 19); 200 ug / ml: GDNF; IGF; bFGF; EGF; PDGF; aFGF; HGF (ongeveer 1000 x hoger dan die voor celkweek). </li><li> Los 25 mg MDL28170 (calpaïneremmer) in 1,3 ml DMSO tot 50 mM DMSO voorraad oplossing te verkrijgen, en verdun vervolgens 50x in PBS tot 1 mM voorraad oplossing te verkrijgen. </li><li> Meng 100 pi van elke groeifactor component en 100 ui MDL28170 (1 mM voorraadoplossing) tot 1.000 III groeifactor cocktail oplossing (figuur 1) te produceren. </li><li> Meng 500 pi fibrinogeen 2x voorraadoplossing met 500 ul groeifactor cocktail tot 25 mg / ml fibrinogeen werkoplossing vinden die groeifactoren en aliquot in 10 of 20 ul voor opslag bij -70 ° C. De oplossing is stabiel tot 12 maanden bij -70 ° C. </li><li> Evenzo, meng 500 ul trombine 2x stockoplossing met 500 ul groeifactor cocktail tot 25 U / ml trombine werkende oplossing te verkrijgen met groeifactoren en aliquot in soortgelijke 10 of 20 ul volumes voor opslag eent -70 ° C gedurende maximaal 12 maanden. </li><li> Op de dag van enting plaats fibrinogeen-en-trombine bevattend groeifactor cocktails op ijs tot gemengd met cellen. </li></ol> 2. T3 Spinal Cord doorsnijding <ol><li> Verdoven volwassen vrouwelijke Fischer 344 ratten of athymische naakt ratten met behulp van aanvaardbare methoden. Onderwerpen zijn diep onder narcose, wanneer respons op staart en poot knijpen zijn volledig afwezig. Opmerking: Wij gebruiken meestal 150-200 g Fischer-ratten of 180-220 g athymische ratten en een anesthesie cocktail (2 ml / kg) van ketamine (25 mg / ml), xylazine (1,3 mg / ml) en acepromazine (0,25 mg / ml). </li><li> Solliciteer oogzalf tot droog of letsel van de ogen te voorkomen, terwijl de dieren onder narcose. </li><li> Scheren de bovenste thoracale gebied en reinig de huid met Betadine. </li><li> Snijd de huid en spieren met behulp van # 15 blade, T3 wervel bloot met behulp van een chirurgische retractor, en het uitvoeren van een laminectomie op T3 wervel tot T3 / 4 ruggenmerg bloot met een rongeur. </li><li> Maak een longitudinal middellijn incisie in de dura van ongeveer 2 mm lengte met behulp van een # 11 blad. </li><li> Plaats iridectomiescharen onder de dura rechts laterale gehele ruggemerg snijden. Maak nog een snede aan dezelfde kant 1,5 mm meer cadually. </li><li> Aspireren ruggenmerg weefsel tussen de twee gesneden segmenten met een stompe 23 G naald aangesloten op matige intensiteit vacuüm. Gebruik visuele verificatie om volledige doorsnijding ventraal en lateraal zorgen. Dit zal een laterale hemisectie voltooien. </li><li> Om de laesie uit te breiden tot een volledige breedte ruggenmerg doorsnijding, plaatst spiegel insnijdingen in de linker hemicord. Poging om de dura intact laten, anders dan de eerste snede, om de firma graft / fibrine matrix behouden in de laesie site wanneer geënt twee weken later. </li><li> Hecht de spier, antibioticum poeder en nieten de skin. </li><li> Injecteren lactaatbevattende Ringer (3 ml), Bannamine (2.5-5 mg / kg) en ampicilline (80-100 mg / kg) (zie ook Materiaal tabel) direct na de operatie en maintain ratten in een warme couveuse tot thermoregulatie wordt hersteld. </li><li> Leeg de blaas en injecteer de Ringer-oplossing en ampicilline twee keer per dag voor ongeveer twee weken tot de oprichting van reflex blaas legen (Figuur 1B). </li></ol> 3. Voorbereiding van de net losgemaakte Embryonale Dag 14 Spinal Cord neurale stamcellen <ol><li> Verkrijgen inteelt transgene GFP F344 ratten (F344-Tg (UBC-EGFP) F455Rrrc) van Rat Resource and Research Center, University of Missouri. </li><li> Injecteer 40 ug des-Gly 10, [D-Ala 6]-Leuteinizing Hormone Releasing Hormone ethylamide (LHRH) verdund in PBS bij een concentratie van 200 ug / ml intraperitoneaal (IP) per volwassen vrouwelijke ratten (8 weken of ouder) na 2 -3 uur licht inductie voor de synchronisatie van het embryo. </li><li> Mate met een volwassen GFP homozygote of heterozygote mannelijke ratten &#39;s nachts 4 dagen na de injectie. </li><li> Verzamel embryo&#39;s in dagen 13,5-14,5 postcoitus(Pc) in koud HBSS buffer, onderzoeken GFP expressie onder een &quot;NightSea&quot; zaklamp en filter glazen (BLS1 - BlueStar zaklamp en Model VG1 barrière filter) of een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Ontleden ruggenmerg aseptisch uit elk GFP-positieve foetus en verwijder bovenliggende hersenvliezen en de bijgevoegde spinale ganglia met iridectomiescharen en fijne juweliers tang. </li><li> Verzamel de ontleed ruggenmerg in 2 ml koud HBSS buffer in een 15 ml Cornical buis en blijf op ijs. </li><li> Volg referentie # 20 naar ontleed ruggenmerg distantiëren: <ol><li> In het kort, 2 ml van 0,25% trypsine-EDTA op de buis met ontleed ruggenmerg (meerdere koorden samen worden gedigereerd, 1 snoer kan genoeg te genereren voor het kweken van een onderwerp) en verteren bij 37 ° C gedurende 10-12 minuten. </li><li> Stop de reactie door toevoeging van trypsine 10 ml DMEM dat 10% FBS aan de buis en centrifugeer het weefsel bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. </li><li> Resuspendeer weefsel in 2 ml Neurobasal medium containing 2% B27, en vermaal het ruggenmerg weefsel met behulp van steeds kleinere brand gepolijst Pasteur pipetten. </li><li> Centrifugeer cellen bij 2500 rpm gedurende 2 minuten, resuspendeer in 2 ml Neurobasal medium met B27 en filter cellen met een 40 um cel filterkorf. </li></ol></li><li> Tel de cellen met een hemocytometer en verdelen de cellen gelijkmatig in twee Eppendorf buizen. </li><li> Centrifugeer de cellen en supernatant volledig te verwijderen (1-2 minuten zijn nodig om alle bovenstaande trekken met een laag vacuüm tip) dus de groeifactor cocktails zullen niet worden verdund door de resterende supernatant na cel re-suspensie. </li><li> Resuspendeer elke helft van de cellen in de fibrinogeen of trombine werkoplossing die groeifactoren, respectievelijk, in een concentratie van 250.000 cellen / ul (celpellet telt voor ongeveer ⅓ eindvolume) en plaats ze op ijs vóór transplantatie (Figuur 1A). Merk op dat fibrinogeen kan spontaan gel wanneer gemengd met cels voor combinatie met trombine op de laesie / graftlocatie; om voortijdige gelering vermijden, meng cellen in fibrinogeen onmiddellijk vóór cel enten in vivo. </li></ol> 4. Transplantatie <ol><li> Reexpose de laesie T3 / 4 ruggenmerg twee weken na ruggenmerg doorsnijding. </li><li> 5 pi fibrinogeen-cellen en 5 ul trombine-cellen kunnen direct worden geïnjecteerd in negen punten van de laesie site via verzegeld littekenweefsel en intacte dura zonder heropening van de laesie. </li><li> Gebruik een 27 G naald 9 gaten op het oppervlak van het littekenweefsel en intacte dura 1-2 weken na lesie maken: 3 in het centrum (een middelpunt en twee in laterals en afstand van 0,5 mm van elkaar) en 3 zowel rostraal en 3 caudale interface (ongeveer 0,5 mm rostraal en caudaal van het midden van de laesie). </li><li> Injecteren dan helft van het volume van fibrinogeen cel oplossing in drie centrale punten van de laesie en een kwart volume in 3 punten van de rostrale interface en aquarter volume in 3 punten van de staartvin interface. </li><li> Vervolgens onmiddellijk injecteren throbmbin cellen in dezelfde plekken. Het mengsel van fibrinogeen en trombine cellen cellen in de laesie zal fibrine gel cellen houden in laesie vormen en groeifactor cocktails de overleving van cellen te ondersteunen. Cellen worden geïnjecteerd met getrokken glazen pipetten verbonden met een PicoSpritzer (General Valve, Inc). </li><li> Transplant gekweekte menselijke NSCs 21 in de bovenstaande procedure en gebruik fibrine en groeifactor cocktails van menselijke reagentia. </li></ol>

<ol><li>Ramon y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Degeneration+and+regeneration+of+the+nerve+system%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In Degeneration and regeneration of the nerve system.</a> , New York: Hafner. (1991).</li>
<li>Jakeman, L. B., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+projections+between+fetal+spinal+cord+transplants+and+the+adult+rat+spinal+cord%3A+a+neuroanatomical+tracing+study+of+local+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions.</a> J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).</li>
<li>Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+spinal+cord+tissue+in+mini-guidance+channels+promotes+longitudinal+axonal+growth+after+grafting+into+hemisected+adult+rat+spinal+cords%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords.</a> Neural Plast. 6, 103-121 (1999).</li>
<li>Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+growth+and+fate+of+fetal+spinal+iso-+and+allografts+in+the+adult+rat+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord.</a> Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).</li>
<li>Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+fetal+spinal+cord+grafts+in+the+adult+rat+spinal+cord%3A+influences+of+lesion+and+grafting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions.</a> Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).</li>
<li>Wictorin, K., Björklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+outgrowth+from+grafts+of+human+embryonic+spinal+cord+in+the+lesioned+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord.</a> Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).</li>
<li>Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+progenitor+cell+grafts+survive+after+acute+spinal+cord+injury+and+integrate+along+axonal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways.</a> Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).</li>
<li>Blits, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector-mediated+transduction+of+neural+progenitor+cells+before+implantation+into+injured+spinal+cord+and+brain+to+detect+their+migration%2C+deliver+neurotrophic+factors+and+repair+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Restor+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue.</a> Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).</li>
<li>Lepore, A. C., Fischer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-restricted+neural+precursors+survive%2C+migrate%2C+and+differentiate+following+transplantation+into+the+injured+adult+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord.</a> Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).</li>
<li>Gaillard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reestablishment+of+damaged+adult+motor+pathways+by+grafted+embryonic+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons.</a> Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lines+of+GFP+transgenic+rats+relevant+for+regenerative+medicine+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy.</a> Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).</li>
<li>Cao, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+engrafted+into+the+normal+or+lesioned+adult+rat+spinal+cord+are+restricted+to+a+glial+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage.</a> Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).</li>
<li>Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+spinal+cord+stem%2Fprogenitor+cells+transplanted+as+neurospheres+preferentially+differentiate+into+oligodendrocytes+in+the+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord.</a> Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).</li>
<li>Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+detection+and+identification+of+multiple+chromosomal+integration+sites+in+transgenic+animals+created+with+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus.</a> Biotechniques. 41, 715-719 (2006).</li>
<li>Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+soluble+growth+factors+on+embryonic+stem+cell+differentiation+inside+of+fibrin+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds.</a> Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).</li>
<li>Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+improve+motoneuron+survival+and+function+of+muscle+reinnervated+by+embryonic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).</li>
<li>Kadoya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+intrinsic+and+extrinsic+neuronal+mechanisms+facilitate+bridging+axonal+regeneration+one+year+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury.</a> Neuron. 64, 165-172 (2009).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+growth+and+connectivity+of+neural+stem+cells+after+severe+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury.</a> Cell. 150, 1264-1273 (2012).</li>
<li>Coumans, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+complete+spinal+cord+transection+in+rats+by+delayed+treatment+with+transplants+and+neurotrophins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins.</a> J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).</li>
<li>Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+e18+cortical+rat+neurons+for+compartmentalization+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device.</a> J Vis Exp. (305), (2007).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+neuronal+differentiation+of+human+neural+stem+cell+grafts+in+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord.</a> PLoS Med. 4 (2), e39(2007).</li>
<li>Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+bridges+for+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Building bridges for spinal cord repair.</a> Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).</li>
<li>Catelas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fibrin.</a> Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).</li>
<li>Petter-Puchner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-term+neurocompatibility+of+human+fibrin+sealant+and+equine+collagen+as+biomatrices+in+experimental+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury.</a> Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li>
<li>Deister, C., Schmidt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neurotrophic+factor+combinations+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth.</a> Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Een van de belangrijkste hindernissen voor NSC transplantatie in het ruggemerg slecht overleving in de laesie centrum. Eventuele lacunes of holten in de laesie zou kunnen verminderen of verzwakken de vorming van functionele neuronale relais tussen supraspinale axonen en gescheiden ruggenmergsegmenten onder het letsel. Bovendien kan een slechte overleving van geënte NSCs hun integratie met gastheer weefsel beïnvloeden, en dus verminderen connectiviteit van geënt neuronen met de ontvangende neuronen. Mogelijke mechanismen...

Ruggenmergletsel (SCI) vaak schade niet alleen witte stof traktaten die signalen vervoeren van en naar de hersenen, maar ook de centrale grijze stof, waardoor segmentale verlies van interneuronen en motorische neuronen. Het gevolg van SCI is het verlies van zowel motorische en sensorische functie onder de laesie. Helaas heeft het volwassen centraal zenuwstelsel (CZS) niet spontaan regenereren, waardoor permanente functionele tekorten 1. Daarom reconstructie van het ruggenmerg gewonde volwassen en verbetering van de motorische, sensorische en autonome functie is een belangrijk doel van SCI onderzoek. Neurale stamcellen (NSC), hetzij direct geïsoleerd van embryonale of volwassen CZS, zijn dwingend kandidaat cellen om verloren neuronen en gliacellen te vervangen. Bovendien zijn deze cellen de potentie om nieuwe functionele relais te vormen om axonale geleiding door een laesie 2,3 herstellen. Tot op heden is er geen gedetailleerde toelichting van de anatomische, electrophys geweestiological en gedragseffecten van neuronale relais vorming door getransplanteerde NSC na ernstige SCI. Er zijn verschillende redenen voor: ten eerste, getransplanteerde NSCs of foetale CNS weefsel overleven slecht wanneer geënt op grote laesie holtes. Eerdere studies tonen aanzienlijke vroege cel verlies, waardoor grote lege cystic laesie holten 4,5. In sommige studies zou de geënte cellen vervolgens verdelen en vullen de laesie holte van 4,5, maar dit kan later een vertraging van dagen tot weken en vervolgens laesie vulling misschien niet volledig of consistent zijn. Ten tweede, een efficiënte tracking systeem dat correcte gegevens op cellulaire overleving, differentiatie / rijping, en uitgroei van getransplanteerde NSCs biedt ontbrak. De meeste vroege studies gebruikt antegrade en retrograde etikettering axonale projecties van transplantaties 2,3 traceren. Echter, deze technieken slechts gedeeltelijk en vaak onduidelijk gelabelde axonale projecties die voortvloeien uit geënte cellen en tracer methoden zijn subjectievet artefacten veroorzaakt door kleurstof lekkage voorbij de geïmplanteerde cellen. Andere groepen gebruikt humaan specifieke neuronale markers om axonale projecties na transplantatie van menselijke foetale NSCs in gewonden knaagdier ruggenmerg 5,6 labelen. Echter, in die studies, de xenotransplantaten niet consequent goed overleven. Onlangs, virale aflevering van het GFP reportergen werd gebruikt om gekweekte NSCs 7,8 labelen. Echter, was GFP expressie vaak inconsistent en kan worden downgereguleerd 7. Onlangs is het gebruik van transgene donor muizen of ratten op stabiele wijze het reportergen GFP of de menselijke placenta alkalische fosfatase, is sterk verbeterd het volgen van getransplanteerde neurale stamcellen / voorlopercellen in vivo 9,11. Ten derde, een aantal studies blijkt dat in vitro gekweekte rat NSCs verkregen uit embryonale of volwassen CZS uitsluitend differentiëren in gliacellen geslachten wanneer getransplanteerd in het milieu van de wervelkolom cor intact of gewonde volwassend 7,12,13, hoewel deze neurale stamcellen kunnen differentiëren tot neuronen en glia zowel in vitro, wat aangeeft dat lokale omgeving het lot van stamcellen dicteren. Alternatief kan gekweekt NSCs, met name afkomstig uit volwassen CZS, defaulty intrinsieke eigenschap te differentiëren in gliale lineages in vivo 13. Vanwege de beperkingen hierboven besproken, heeft onze groep recent een nieuw protocol ontwikkeld om embryonale NSC tracking, de overleving en differentiatie / rijping in de ernstig gewonde volwassen ruggenmerg verbeteren. Samengevat, zijn we begonnen met een stabiele transgene Fischer 344 ratten inteelt lijn uitdrukken van een GFP reporter gen dat GFP expressie in stand houdt na in vivo transplantatie 14. Vervolgens gebruikten we vers geïsoleerde NSCs uit embryonale dag 14 Fischer 344 ruggenmerg, een stadium van ontwikkeling die het potentieel om zowel neuronen en gliacellen genereren behoudt. Ten slotte hebben we ingebednet losgemaakte NSCs in een fibrine matrix met groeifactoren 15-17 om de cellen te behouden en gelijkmatig te verspreiden binnen een grote laesie holte, gericht op het transplantaat overleving van de cel, differentiatie en integratie te ondersteunen. Transplantaten werden geplaatst in locaties van T3 volledige doorsnijding, twee weken na dwarslaesie. Deze geënte cellen consequent gevuld volledige doorsnijding sites en gedifferentieerd in voorkomende neuronen dat grote aantallen axonen uitgebreid naar gastheer ruggenmerg over lange afstanden 18. Soortgelijke resultaten werden verkregen met gekweekte menselijke neurale stamcel transplantaten immuno-deficiënte ratten 18.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen (rat)</td><td>Sigma</td><td>F6755-25MG</td><td>2 uur bij 37 &deg;C om op te lossen Stockconcentratie: 50 mg/ml Eindconcentratie: 25 mg/ml</td></tr><tr><td>Thrombin (rat)</td><td>Sigma</td><td>T5772-100UN</td><td>Oplossen in 10 mM CaCl2 Stockconcentratie: 50 U/ml Eindconcentratie: 25 mg/ml</td></tr><tr><td>bFGF (human)</td><td>Sigma</td><td>F0291 (25 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>EGF (murine)</td><td>Sigma</td><td>E1257 (0.1 mg)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>BDNF (human)</td><td>Peprotech</td><td>452-02 (1 mg)</td><td>Stockconcentratie: 1.000 ng/&mu;l Eindconcentratie: 50 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>NT-3 (human)</td><td>Peprotech</td><td>452-03 (1 mg)</td><td>Stockconcentratie: 1.000 ng/&mu;l Eindconcentratie: 50 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>GDNF (rat)</td><td>Sigma</td><td>G1401 (10 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>IGF-1 (muis)</td><td>Sigma</td><td>I8779 (50 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>aFGF (human)</td><td>Sigma</td><td>F5542 (25 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l </td></tr><tr><td>PDGF-AA (human)</td><td>Sigma</td><td>P3076 (10 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>HGF (human)</td><td>Sigma</td><td>H9661 (5 &#956;g)</td><td>Stockconcentratie: 200 ng/&mu;l Eindconcentratie: 10 ng/&mu;l</td></tr><tr><td>MDL28170</td><td>Sigma</td><td>M6690 (25 mg)</td><td>Stock in DMSO Stockconcentratie: 1 mM Eindconcentratie: 50 &mu;M</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td>Stockconcentratie: 1x Eindconcentratie: 1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney</td><td>26637-411-01</td><td>40-80 mg/kg Stockconcentratie: 100 mg/ml Eindconcentratie: 25 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd</td><td>0410,</td><td>2,5-8 mg/ml Stockconcentratie: 100 mg/ml Eindconcentratie: 5,8 mg/ml</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Butler</td><td>003845</td><td>0,5-4 mg/ml Stockconcentratie: 10 mg/ml Eindconcentratie: 0,25 mg/ml</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Healthpets</td><td>BET16OZ</td><td></td></tr><tr><td>Ringers</td><td>Abbott</td><td>04860-04-10</td><td>2-3 ml/inj</td></tr><tr><td>Banamine</td><td>Schering-Plough</td><td>0061-0851-03</td><td>2,5-5 mg/kg Stockconcentratie: 50 mg/ml Eindconcentratie: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sandoz</td><td>0781-3404-85</td><td>80-100 mg/kg Eindconcentratie: 50 mg/ml</td></tr><tr><td>LH-RH</td><td>Sigma</td><td>L4513</td><td>200 &mu;g/kg Eindconcentratie: 200 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-096</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Stockconcentratie: 0,25 % Eindconcentratie: 0,125 %</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Stockconcentratie: 100 % Eindconcentratie: 10 %</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Stockconcentratie: 100x Eindconcentratie: 1x</td></tr><tr><td colspan="4">Let op, gebruik humane reagentia voor grafts van menselijke NSC's</td></tr></tbody></table>

bevordering van survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor cocktails na ernstige spinal cord injury

Promotion of Survival and Differentiation of Neural Stem Cells with Fibrin and Growth Factor Cocktails after Severe Spinal Cord Injury

Neurale stamcellen (NSC) kan zichzelf vernieuwen en differentiëren tot neuronen en gliacellen. Getransplanteerd NSCs kan verloren neuronen en gliacellen na dwarslaesie (SCI) te vervangen, en kan functionele relais vormen opnieuw verbinding ruggenmergsegmenten boven en onder een laesie. Eerdere studies enten neurale stamcellen zijn beperkt door onvolledige transplantaatoverleving in het ruggenmerg laesie holte. Verder volgen van transplantaat celoverleving, differentiatie en werkwijze verlenging was niet geoptimaliseerd. Tot slot, in eerdere studies, gekweekte NSCs rat werden meestal gemeld om te differentiëren in glia wanneer geënt op de benadeelde ruggenmerg, in plaats van neuronen, tenzij het lot werd gedreven naar een specifiek celtype. Om deze problemen aan te pakken, hebben we nieuwe methoden ontwikkeld om de overleving, integratie en differentiatie van NSC naar sites van zelfs ernstige SCI verbeteren. NSCs werden vers geïsoleerd uit embryonale dag 14 ruggenmerg (E14) van een stabiele transgene Fischer 344 ratten tot expressie groene fluorescentie eiwit (GFP) en werden ingebed in een fibrine matrix met groeifactoren; deze formulering bedoeld om geënte cellen behouden de laesie holte en ondersteunen celoverleving. NSCs in de fibrine / groeifactor cocktail werden geïmplanteerd twee weken na thoracale niveau 3 (T3) volledige ruggenmerg doorsnijdingen, waardoor piekperiodes van ontsteking vermijden. Resulterende transplantaten volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in zowel neuronen, die axonen in de gastheer ruggenmerg dan opmerkelijk lange afstanden, en glia verlengd. Enten van gekweekte menselijke NSCs die GFP geleid tot gelijkaardige bevindingen. Aldus zijn werkwijzen vastgesteld voor het verbeteren neurale stamcel transplantatie, overleving en analyse van in vivo resultaten.

GFP immunohistochemisch etikettering blijkt dat NSC geënte rat opnieuw gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (bij gebrek aan een fibrine matrix en groeifactoren) overleefden slecht in de T3 doorsnijding plaats, alleen verbonden aan de laesie / gastheer marge en terwijl de meeste van de laesie leeg zonder geënte cellen (Figuur 2A). De overleving van NSCs verbeterd wanneer samen geënt met fibrine matrices alleen maar het transplantaat niet volledig vullen grote laesie holte (gegevens...

Fibrine matrices bevattende groeifactoren zijn gebruikt om geënte neurale stamcellen behouden in locaties volledig ruggenmerg doorsnijding. Geënte cellen volledig gevuld de laesie holte en gedifferentieerd in meerdere neurale celtypes, waaronder neuronen die axons verlengd gastheer ruggenmerg over lange afstanden.

Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) can self-renew and differentiate into neurons and glia. Transplanted NSCs can replace lost neurons and glia after spinal cord ...

Het algemene doel van deze procedure is om de overleving en differentiatie van neurale stamcellen die worden getransplanteerd in laesies van ernstig beschadigde wervelkoorden bij ratten te verbeteren. Dit wordt bereikt door eerst een wervelkoordlaesie aan te brengen, zoals een T drie transectie met de meeste dura intact, behalve een kleine opening om getransplanteerde cellen te houden. De tweede stap van de procedure is om vers gedissocieerde neurale stamcellen te oogsten uit een 14-dagen oude embryonale rattenfoetus.De derde stap is het opschorten van neurale stamcellen in Resus in elke component van fibrinematrices die groeifactorcocktails bevatten. De laatste stap is het transplanteren van neurale stamcellen in fibrinematrices en groeifactoren in het subacute laesiecentrum, immunofluorescentiemicroscopie van getransfecteerde en getransplanteerde wervelkoorden. Zeven weken na het transplanteren kunnen uitstekende overleving van neurale stamcellen en hun differentiatie in volwassen neuronen worden waargenomen, die opmerkelijke aantallen axonen in de gastheer uitstrekken.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de bestaande methode, zoals celtransplantatie in h

promotion-survival-differentiation-neural-stem-cells-with-fibrin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

De behandeling van cervicale spinale-koordletsel met zowel zelfassemblerende peptiden (SAP) en neurale voorlopercellen (NPC), samen met groeifactoren, is een veelbelovende aanpak om regeneratie en herstel te bevorderen. Een contusie/compressie aneurysma clip ratmodel van cervicale SCI en gecombineerde behandeling waarbij SAP injectie en NPC transplantatie is vastgesteld.

Synergetische gebruik van neurale precursoren en Zelfgeassembleerde Peptiden in Experimentele Baarmoederhalskanker Spinal Cord Injury

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Ernstige verwondingen van het ruggenmerg resulteren vaak in weefseldefekten. Er worden twee mogelijkheden beschreven om dergelijke openingen succesvol te overbruggen om weefseladaptatie, regeneratieve reacties en functionele verbetering bij ratten te bevorderen via implantatie van een mechanisch microconnector-systeem na acute verwonding en vijf weken na volledige doorknipping van het ruggenmerg.

Experimentele Strategieën om Grote Tissue Hiaten in de Gewonde Spinal Cord brug na Acute en chronische Letsel

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.

Transplantatie van Schwann cellen binnen PVDF-TrFE Conduits verbeelde Rat ruggenmerg stronken ter bevordering van de regeneratie van het Axon over de kloof overbruggen

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.

Injectie van Hydrogel Biomaterial Steigers naar de hersenen na een beroerte

In dit artikel bieden we een reproduceerbare methode om organotypische plakjes ruggenmerg te genereren en te onderhouden die zijn getransplanteerd met neurale stamcellen als een ex vivo-model voor het testen van cellulaire vervangingstherapieën.

Organotypische plakcultuur van het ruggenmerg van muizen als platform voor het valideren van celtransplantatie bij ruggenmergletsel

In deze studie werden zenuwmimetische composiet hydrogels ontwikkeld en gekarakteriseerd die kunnen worden gebruikt om het pro-regeneratieve gedrag van van vet afgeleide stamcellen voor het herstel van ruggenmergletsel te onderzoeken en te benutten.

Ontwikkeling van combinatorische therapieën voor ruggenmergletsel met behulp van stamcelafgifte

Leer hoe fibrinematrices met groeifactoren de overleving en differentiatie van neurale stamcellen verbeteren bij ernstige ruggenmergletsels in ratten. Deze methode ondersteunt axonale regeneratie.

Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury (Video) | JoVE Journal

Bevordering van Survival en differentiatie van neurale stamcellen met fibrine en groeifactor Cocktails na Ernstige Spinal Cord Injury

Meer video's verkennen