Name: Hoge resolutie Hele Mount In Situ Hybridisatie in zebravis embryos om genexpressie en functie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-19T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Leer hoge-resolutie whole mount in situ hybridisatie in zebravis embryo's voor genexpressieanalyse met verbeterde detectie van laag abundante transcripten. Deze methode minimaliseert achtergrondsignalen en ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Wolman, M., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetics+in+larval+zebrafish%3A+learning+from+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young.</a> Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+embryonic+expression+of+zebrafish+PCSK5+co-orthologues%3A+functional+assessment+during+lateral+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development.</a> Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).</li>
<li>Liao, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCL%2FTal-1+transcription+factor+acts+downstream+of+cloche+to+specify+hematopoietic+and+vascular+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish.</a> Genes Dev. 12, 621-626 (1998).</li>
<li>Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloche%2C+an+early+acting+zebrafish+gene%2C+is+required+by+both+the+endothelial+and+hematopoietic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages.</a> Development. 121, 3141-3150 (1995).</li>
<li>Detrich, H. W. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraembryonic+hematopoietic+cell+migration+during+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+gene+cloche+acts+upstream+of+a+flk-1+homologue+to+regulate+endothelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation.</a> Development. , 124-381 (1997).</li>
<li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li>
<li>Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+expression+of+three+zebrafish+genes+related+to+distal-less%3A+part+of+a+homeobox+gene+code+for+the+head%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head.</a> J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).</li>
<li>Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((casanova+plays+an+early+and+essential+role+in+endoderm+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish.</a> Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).</li>
<li>Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+PDX-1+structure%2C+function%2C+and+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish.</a> Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).</li>
<li>Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+trout+insulin+promoter%3A+implications+for+fish+as+a+favorable+model+of+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development.</a> FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).</li>
<li>Biemar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+in+zebrafish%3A+early+dispersed+appearance+of+endocrine+hormone+expressing+cells+and+their+convergence+to+form+the+definitive+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet.</a> Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+zebrafish+snail1+gene+and+its+expression+in+wild-type%2C+spadetail+and+no+tail+mutant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos.</a> Development. 119, 1203-1215 (1993).</li>
<li>Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+progranulin+gene+family+and+antisense+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts.</a> BMC Genomics. 6, 156(2005).</li>
<li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+and+knockdown+technology+to+define+proprotein+convertase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity.</a> Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We hebben betere methoden ontwikkeld om RNA te visualiseren met een hoge resolutie. De in situ hybridisatie procedures worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige maat gemaakte manden met poreuze bodems (Figuur 1). Embryo&#39;s worden verwerkt met RNase-vrije oplossing in 6-well platen bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden. Om scheiden embryo manden zijn gemaakt van verschillende gekleurde Eppendorf tubes. Manden met of zonder velg worden gebruikt voor ...

De zebravis (Danio rerio) heeft zich ontpopt als een krachtige diermodel voor de studie van gewervelde ontwikkeling, ziekte, gedrag, en in-drug screening 1-3. Zebravis embryo&#39;s worden verkregen in grote aantallen uit een kruising. Bevruchting en ontwikkeling plaatsvindt ex utero en het optisch heldere embryo&#39;s ontwikkelen zich snel. Kritische ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen zich voordoen tijdens de eerste 48 uur na de bevruchting (HPF). Dit omvat het voorkomen van orgaan primordia en de start van cytodifferentiation. Knockdown of over-expressie van eiwitten kan worden bereikt door micro-injectie van embryo&#39;s met antisense morfolino (MO) oligonucleotiden of mRNA respectievelijk de cel stadium een ​​of twee (0.75 HPF). De wens van zebravis embryo&#39;s vergemakkelijkt de studie van de spatio-temporele expressie van specifieke genen van belang. Toepassing van de WISH techniek na micro-injectie van embryo&#39;s met mRNA of MO tot over-express of knockdown specifiek eiwit niveaus onthult differentiële regulatie van andere genen. Veranderingen in genexpressie patronen kunnen worden gecorreleerd met fenotypische veranderingen en onthullen de functie van doelwitgenen tijdens vroege organogenese. Aangezien probes kunnen worden bereid en van tevoren, kan de ISH techniek toegepast op genexpressiepatronen onthullen ten minste 20 genen tegelijk met zes putjes en op maat gemaakte manden.

<table><tbody><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342053</td><td></td></tr><tr><td>TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO</td><td>Invitrogen</td><td>K4650-01</td><td></td></tr><tr><td>HQ Mini Plasmid Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roche</td><td>11 685 660 001</td><td></td></tr><tr><td>Not1 and HindIII Restriction Enzymes</td><td>Invitrogen</td><td>15441-025, 15207-012</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Saturated Phenol, ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15513039</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C. Irriterend voor ogen, huid en luchtwegen en vermoedelijke carcinogeen. Wees voorzichtig bij gebruik.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>C607-1</td><td>Toxisch en vermoedelijke carcinogeen. Werk onder afzuigkap.</td></tr><tr><td>RNase-free DNAse I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Maak kleine aliquoten en bewaar bij -20&deg;C.</td></tr><tr><td>DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7355</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Commerciële alcoholen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma</td><td>40718-25ML</td><td>DEPC is een irriterend voor ogen, huid en luchtwegen. Vermijd contact met huid en ogen. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en masker.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M (pH 8.0)</td><td>Fisher</td><td>50-751-7404</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher</td><td>FL-03-0900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>Bereid en bewaar bij -20&deg;C als 40 ml aliquoten voor later gebruik. PFA is giftig. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en stofmasker.</td></tr><tr><td>Phenylthiocarbomide (PTC)</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTC is zeer giftig. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en stofmasker.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A947-4</td><td></td></tr><tr><td>Dumont (klokkenmaker&rsquo;s) Forceps patroon nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Six-well Cell Culture Cluster</td><td>Sarstedt</td><td>83.1839</td><td></td></tr><tr><td>Mandjes zijn gemaakt van nylon gaas en Eppendorf buisjes</td><td>In-house voorbereiding</td><td></td><td>Om de mandjes te maken, snijdt u Eppendorf buisjes (1,5 ml) met of zonder rand om het kegelvormige uiteinde te verwijderen. Snijd nylon gaas in kleine stukken die overeenkomen met de grootte van&nbsp;de gesneden uiteinden van de Eppendorf buisjes. Plaats buisjes met het nylon gaas dat het gesneden uiteinde bedekt op een elektrische&nbsp;hot plate totdat zowel het buisje als het nylon gaas aan elkaar plakken (uitvoeren in afzuigkap). Snijd het overtollige gaas van de mandjes af en bewaar ze in 100% methanol tot gebruik.</td></tr><tr><td>Polyoxyethyleensorbitaan Monolauuraat (Tween 20)</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Azetyl Anhydride</td><td>Sigma</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine</td><td>Sigma</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, hoge zuiverheidsgraad</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>AG501-X8 Resin</td><td>Bio Rad</td><td>142-6424</td><td></td></tr><tr><td>Citrate monohydraat</td><td>Sigma</td><td>C0706-500G</td><td></td></tr><tr><td>Heparine Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Saline-natrium Citraat Buffer (SSC)</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>tRNA uit bakkersgist type X</td><td>Sigma</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher</td><td>S25403</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td>Irritante, giftige, brandbare en vermoedelijke teratogeen. Gebruik met de juiste veiligheidsuitrusting inclusief handschoenen en veiligheidsbril.</td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat (BCIP)</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td>Bescherm deze oplossing tegen licht.</td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium (NBT)</td><td>Sigma</td><td>840W</td><td>Bescherm deze oplossing tegen licht.</td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum, gezuiverde fractie V (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Schapen Anti-digoxigenine-AP Fab Fragmenten</td><td>Roche</td><td>1093274910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well cell culture platen</td><td>Sarstedt</td><td>83.1835</td><td></td></tr><tr><td>Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2</td><td>ZIRC</td><td>Tg(mnx1:GFP)ml2</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Aquarium Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge resolutie hele mount<em&gt; in situ</em&gt; hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Dit artikel richt zich op de hele-mount in situ hybridisatie (WISH) van zebravis embryo&#39;s. De WISH-technologie vergemakkelijkt de beoordeling van genexpressie, zowel in termen van weefsel distributie en het ontwikkelingsstadium. Protocollen worden beschreven voor het gebruik van WISH van zebravis embryo&#39;s met behulp van antisense-RNA-probes gelabeld met digoxigenine. Probes worden gegenereerd door het opnemen van digoxigenine gekoppelde nucleotiden door in vitro transcriptie van genen sjablonen die gekloond zijn en gelineariseerd. De chorions van geoogst op bepaalde ontwikkelingsstadia embryo&#39;s worden vóór incubatie met specifieke probes verwijderd. Na een wassen procedure om de overmaat probe te verwijderen, worden embryo geïncubeerd met anti-digoxigenine antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase. Door toepassing van een chromogeen substraat voor alkalische fosfatase, kan genexpressie worden bepaald. Afhankelijk van het niveau van genexpressie de gehele procedure kan worden voltooid binnen 2-3 dagen.

Met behulp van het protocol met 50 embryo&#39;s per mand (per gen / per experimentele conditie) het expressiepatroon van dat gen kan in een experiment worden bereikt. Bijna alle embryo&#39;s vertonen gelijkaardige expressiepatronen van een bepaald gen. Representatieve voorbeelden van de in situ hybridisatie kleuring wordt getoond in figuren 3-6. Zowel de sense en anti-sense riboprobes werden gesynthetiseerd uit het cDNA dat overeenkomt met PC5.1, PC5.2 6,...

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden bepaald<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie. Onze verbeterde protocol maakt de detectie van lage overvloedige transcripten met lage niet-specifieke achtergrondsignaal.

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Het algemene doel van deze procedure is om de ruimtelijk-temporele expressie van specifieke gen van belang binnen gestage zebravis-embryo's te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst CD NA-sondes te genereren door digo zuurstof in gekoppeld nucleotiden te integreren met behulp van in vitro transcriptie. Vervolgens worden de embryo's geoogst in gedefinieerde ontwikkelingsstadia.De corium worden verwijderd en de embryo's worden opgeslagen in methanol bij min 20 graden Celsius. Na digestie en post-fixatie worden de embryo's gehybridiseerd met de geschikte sondes. Ten slotte worden de embryo's gekleurd met antide gen en antilichamen en wordt het signaal ontwikkeld met substraten voor alkalische fosfatase.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de weefseldistributie van genexpressie tonen in een bepaalde ontwikkelingsfase door middel van gehele montage in situ hybridisatie en beeldvorming. Hoewel deze methode grotere inzichten kan geven in de normale expressie van doelgen, kan deze ook worden toegepast op andere omstandigheden, zoals doelgenexpressie in een ziektemodel, en wanneer andere genen over- of onderexpressie vertonen. Met behulp van micro-injectietechnologie Gebruik CDNA voor een gen van belang, zet een RNA-labelingsreactie op om digo zuurstof In te labelen RNA-sonde in een RNAs-vrije reactiebuis door één tot vijf microgram gezuiverd sjabloon-DNA toe te voegen aan steriele RNAs-vrije dey-behandelde twee keer gedestilleerd water tot een volume van 13 microliters.Koel de reactie op ijs en voeg de volgende reagentia toe na voorzichtig mengen centrifugeren 2000 RPM gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur voordat u de reactie gedurende twee uur bij 37 graden Celsius incubeert na de incubatie, verwijdert u het sjabloon-DNA door twee microliter RNAs-vrij toe te voegen. DNAs een incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en stopt de reactie door twee microliter 0,2 molaire EDTA toe te voegen, precipiteer de reactieproducten door 2,5 microliter vier molair lithiumchloride en 75 microliter 100%ethanol toe te voegen. Meng de oplossing en incubeer gedurende 45 minuten of een nacht bij min 20 graden Celsius.Centrifugeer de suspensie gedurende 30 minuten bij 13.000 RPM en vier graden Celsius. Was vervolgens de pellet met ijskoud 70% ethanol na het draaien gedurende 10 minuten. Droog de pellet gedurende twee minuten voordat u deze opneemt, schorsen in 50 microliter nuclease-vrij dubbel gedestilleerd water.Bekijk het vervolgens gedurende 30 minuten. Bij 37 graden Celsius, draai een tot twee microliters van de sonde op een 1% aros-gel gedurende ongeveer 30 minuten om de kwaliteit en integriteit te verifiëren. Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de sonde te kwantificeren om eerder gefixeerde en bevroren embryo's te rehydrateren.Begin met het maken van manden door de conische uiteinden van 1,5 milliliter microbuisjes af te snijden. Verwijder vervolgens de bovenranden van de helft ervan. Snijd kleine stukjes nylon gaas om de uiteinden te bedekken en verwarm vervolgens in een paar kapjes de buisuiteinden op een elektrische hotplate en druk ze in het gaas nadat ze zijn afgekoeld.Verwijder het overtollige nylon gaas en bewaar de manden in 100% methanol bij kamertemperatuur. Na het bereiden van opeenvolgende verdunning van methanol in PBS, volgens het tekstprotocol en het toevoegen van vier milliliter van elk in de putjes van een zes-putjesschaal, plaats embryo's in individuele manden voor elke sonde en incubeer ze in de methanol-PBS-serie gedurende vijf minuten per putje, eindigend met drie wasbeurten in PBST. Perme de embryo's met proteinase K bij kamertemperatuur, met behulp van de volgende incubatietijden per ontwikkelingsstadium.Fixeer vervolgens de embryo's in 4% paraform aldehyde in PBS gedurende 20 minuten en was ze in PBST drie keer gedurende vijf minuten elk. Bereid vervolgens het acetyleringsmengsel volgens het tekstprotocol voor en incubeer de embryo's twee keer gedurende 10 minuten elk. Was vervolgens de embryo's en PBST twee keer gedurende 10 minuten elk.Breng de embryo's over in steriele microbuisjes en incubeer met 200 microliter hybridisatiemengsel of HM, in een 70 graden Celsius waterbad gedurende twee tot vier uur. Voeg 100 tot 200 nanogram sonde toe aan de oplossing en incubeer overnacht bij 70 graden Celsius in een waterbad. Vervang de sondeoplossing door voorverwarmde HM en incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 70 graden Celsius.Nadat de monsters door een H-M-S-S-C-serie zijn gegaan en de embryo's volgens het tekstprotocol zijn geblokkeerd, incubeer de embryo's in een een op vijfduizend verdunning van anti-D AP-antilichaam in blokkeringsbuffer overnacht bij vier graden Celsius met zachte agitatie de volgende dag. Was de embryo's zes keer gedurende 15 minuten elk. Na het kleuren van de embryo's, incubeer ze in BCIP en NBT.Voeg kamertemperatuur in het donker toe gedurende 30 minuten. Gebruik een stereomicroscoop om de kleurreactie elke 30 minuten te bewaken om de reactie te stoppen. Breng de manden met embryo's twee keer gedurende 10 minuten elk over naar putjes met stopoplossing met zachte agitatie.Na het post-fixeren van de embryo's met 4% para formaldehyde in PBS gedurende 20 minuten. Monteer de embryo's door ze over te brengen in zo min mogelijk PBS naar zes-putjesplaten met 100% glycerol. Schud de embryo's voorzichtig in het donker bij kamertemperatuur, overnacht beeldvorming in 100% glycerol onder een stereomicroscoop.Representatieve voorbeelden van situ-hybridisatiekleuring worden hier getoond. Paarse kleuring waargenomen na hybridisatie met ribo-sonde van belang vertegenwoordigt zowel de overvloed als de sites van expressie van een bepaald gen. Bijvoorbeeld, PC 5.1 toont zeer discrete expressie binnen het voorste en achterste deel van otisch blaasje en laterale lijnprimordial bij 24 uur na bevruchting en is sterk gelokaliseerd binnen de voorste en achterste laterale lijn neuro masts bij 7

high-resolution-whole-mount-situ-hybridization-within-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo&#39;s

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Leer hoge-resolutie whole mount in situ hybridisatie in zebravis embryo's voor genexpressieanalyse met verbeterde detectie van laag abundante transcripten. Deze methode minimaliseert achtergrondsignalen en ondersteunt onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.

Hoge resolutie Hele Mount

Meer video's verkennen