Name: Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer meerdere viabiliteitstests voor cellen in cultuur met ATP-metingen, immunokleuring en infraroodbeeldvorming. Deze methode biedt een objectieve, uitgebreide beoordeling van zowel structurele als functionele aspecten van celgezondheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Juliann Jaumotte voor het idee van besparing op de volumes van reagentia in de ATP-test. Wij zijn zeer dankbaar voor de uitstekende administratieve ondersteuning van Maria Caruso, Deb Willson, en Jackie Farrer en de Mylan School of Pharmacy voor het verstrekken van financiële steun voor deze studies. Dank ook aan de Hunkele gevreesde ziekten Foundation en de Parkinson en Movement Disorders Foundation voor hun financiële ondersteuning van de primaire neuronale studies.

Geen van de auteurs hebben eventuele conflicten te onthullen.

Wij hebben gevonden dat signaalsterkte in alle drie levensvatbaarheid assays lineair en gecorreleerd met plating dichtheid. Echter, niet alle testen zijn even gevoelig voor 2-voudige en 1,5-voudige veranderingen in uitplaatdichtheid. Voor N2a cellen, de infrarood testen zijn minder gevoelig dan de ATP-bepaling, met name bij lagere dichtheden plating. Hoewel de infrarood testen zijn minder gevoelig dan ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays en de α-tubuline assays zijn goed overeen doordat zij onthullen de zeer beschermend effe...

De meest voorkomende levensvatbaarheid assay in de biologische wetenschappen impliceert cel-tellingen. Dit blijkt uit een analyse van de top (meest recente) 200 publicaties die verschenen in PubMed met een van de zoekwoorden &quot;in vitro&quot; of &quot;cultuur&quot; op 2013/04/29 en 2013/04/30. Van deze publicaties, gebruikt 23,5% celgetal assays, waaronder handmatige aantal cellen telt, geautomatiseerde aantal cellen telt met beeldbewerkingssoftware, en trypanblauwexclusie. De Live / Dead test werd in 1% van deze publicaties. Het aantal publicaties met de MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay voor metabole levensvatbaarheid was 11%. Dit overzicht van de literatuur blijkt ook dat het aantal publicaties met behulp van testen zoals MTT in combinatie met celgetal assays was slechts 3,5%. Ondanks lijkt de trend om een ​​levensvatbaarheid test op zichzelf gebruiken, het beoordelen van cellulaire functie in combinatie met het aantal cellen de beste keuze voor de beoordeling van cellulaire integrity. Celtellingen op zich niet voldoende omdat de resterende cellen niet functioneel of gezond, hoewel zij in de put 1,2 zijn mogelijk. Omgekeerd kan functionele maatregelen zoals ATP verhogen of verlagen in afwezigheid van parallelle veranderingen in het aantal cellen. De ontkoppeling van metabole uitlezingen van aantal cellen suggereert dat ATP en MTT-tests nooit worden gebruikt als enige levensvatbaarheid assay. In dit rapport worden drie levensvatbaarheid testen die zowel cellulaire structuren en metabolische functie enquête beschreven, voor een meer uitgebreid overzicht van cellulaire integriteit dan een test op zich kan veroorloven. Twee van onze analyses vereisen een infrarood imager die fluorescentie meet in de 700 en 800 nm kanalen. Lage ruis in het infrarode golflengten, wat leidt tot hogere signaal-tot-ruisverhoudingen 3. De Odyssey imager die we gebruiken heeft een 4,5 log dynamisch bereik en een bit-diepte van 16, Translating tot 2 16 of 65.536 tinten van infrarood. Dit in tegenstelling tot 8-bit kleuren weergave, die alleen biedt 2 8 of 256 tinten voor elke golflengte. Zo, 16-bits beeldvorming heeft fijnere resolutie. Opgemerkt zij dat de oorspronkelijke infraroodbeelden vaak pseudocolored groen (800 nm) en rood (700 nm) in gepubliceerde rapporten voor presentatie. Odyssey imagers worden vaak gebruikt voor zowel Western blotting en In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns op formaldehyde gefixeerde cellen gebruiken primaire antilichamen tegen een eiwit van interesse en label ze op zijn beurt met infrarood fluorescerende secundaire antilichamen. Deze techniek wordt vooral nuttig voor fosforylering eindpunten 6 zijn. In onze In-Cell Westerns, vlekken wij vaste cellen voor cytoskeleteiwitten α-tubuline of de neuronale microtubuli geassocieerde proteïne 2 (MAP2) in de 800 nm kanaal. Deze eiwitten zijn overvloedig hebben een hoge signaal-ruisverhoudingen leveren. We hebben ook vlekken op ons bord in de 700nm kanaal voor kernen met de DRAQ5 vlek en voor het cytoplasma met de Sapphire vlek. Zowel de cytoskeleteiwitten en de DRAQ5 + Sapphire vlekken weerspiegelen dus cellulaire structuren. De derde levensvatbaarheid-assay meet metabolische functie en heet &quot;Cell Titer Glo.&quot; In deze luciferase gebaseerde test, luminescentie waarden in directe verhouding tot ATP. ATP assays worden vaak gebruikt om levensvatbare cellen te kwantificeren 8-12. Echter, zoals het woord &quot;titer&quot; in de naam van de assay is iets van een verkeerde benaming omdat ATP productie per cel kan veranderen als functie van toxine behandelingen en daarom niet altijd in verhouding tot het aantal cellen 8. ATP niveaus kunnen ook worden beïnvloed door circadiaanse ritmes 13 en door celdeling 14 en celdifferentiatie 15. Niettemin, de ATP-bepaling hier is eenvoudig uit te voeren en nuttig omdat ATP is een robuuste maat voor metabolelevensvatbaarheid 16-21, zo niet het aantal cellen per se. gebruik van deze test om de infrarood te vullen In-Cell levert Westerns daarom een vollediger beeld van de cellulaire integriteit dan iemand test alleen.

<table><tbody><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Koop in hoeveelheden van 100 ml en verdeel in aliquoten, in plaats van de duurdere hoeveelheid van 10 ml te kopen. Gereconstitueerde, ongebruikte reagentia kunnen opnieuw worden ingevroren bij -20 &deg;C gedurende minimaal 21 weken</td></tr><tr><td>18% Formalin</td><td>Thermo-Shandon</td><td>9990244</td><td>Door dit fixeermiddel te kopen, vermijdt u het afwegen van formaldehydepoeders en het koken van de oplossing; de blootstelling aan dampen wordt hierdoor geminimaliseerd</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Het is niet essentieel om dit toe te voegen aan formaldehydeoplossingen, maar het verbetert het uiterlijk van de gefixeerde cellen</td></tr><tr><td>Odyssey Block</td><td>LI-COR</td><td>927-40003</td><td>Dit visserum kan in bulk worden gekocht en bevroren bij -20 &deg;C voor langdurig gebruik</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21568</td><td>We bewaren een voorraadoplossing van 10% Triton-X 100 in steriel water bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat Monobasisch</td><td>Fisher</td><td>S468</td><td>Men kan ook PBS-tabletten of 10x PBS-oplossingen kopen, maar deze zijn duurder</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat Dibasisch</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td>Zie hierboven</td></tr><tr><td>Natriumazid (250x)</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>7144.8-16</td><td>Koop het poeder niet omdat natriumazid zeer giftig is. We bewaren al onze gebruikte antilichamen in 1x natriumazid bij 4 &deg;C totdat ze besmet raken met puin</td></tr><tr><td>Muis anti-&alpha;-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td>Dit antilichaam is duur maar kan sterk worden verdund en is zeer specifiek</td></tr><tr><td>Muis anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942</td><td>Dit antilichaam is duur maar is zeer specifiek (een voorwaarde voor In-Cell Westerns)</td></tr><tr><td>800 nm Geit anti-muis IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>Andere bedrijven verkopen ook infrarode secundaire antilichamen. Zorg ervoor dat u de sterk geadsorbeerde antilichamen koopt en houd er rekening mee dat concentraties van IgG's kunnen variëren met de bron</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td>Deze verbinding werd vroeger door LI-COR verkocht bij 1 mM</td></tr><tr><td>Sapphire</td><td>LI-COR</td><td>928-40022</td><td></td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>PerkinElmer</td><td>VICTOR3 1420 multilabelteller</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Imager</td><td>LI-COR</td><td>9201-01</td><td></td></tr><tr><td>Schakelaar/Mixer</td><td>Research Products International</td><td>248555</td><td></td></tr></tbody></table>

levensvatbaarheid testen voor cellen in cultuur

Viability Assays for Cells in Culture

Handmatige celtellingen op een microscoop een gevoelige manier is om de cellulaire levensvatbaarheid maar tijdrovend en dus duur. Geautomatiseerde levensvatbaarheid testen zijn duur in termen van apparatuur, maar kan sneller en objectiever dan handmatige cel tellingen zijn. Het voorliggende rapport beschrijft het gebruik van drie van dergelijke levensvatbaarheid assays. Twee van deze testen zijn infrarood en men luminescerende. Beide infrarood assays rekenen op een 16 bit Odyssey Imager. Een infrarood-test gebruikt de DRAQ5 vlek voor kernen in combinatie met de Sapphire vlek voor cytosol en wordt gevisualiseerd in de 700 nm kanaal. De andere infrarood-test, een In-Cell westerse, gebruikt antilichamen tegen cytoskeleteiwitten (α-tubuline of microtubuli geassocieerde proteïne 2) en noemt ze in de 800 nm kanaal. De derde levensvatbaarheid assay is een veel gebruikte luminescerende test voor ATP, maar we gebruiken een kwart van de aanbevolen hoeveelheid te besparen op kosten. Deze metingen zijn lineair en correleert met het aantal cells plated, maar verschillen in gevoeligheid. Alle drie de tests te omzeilen tijdrovende microscopie en proeven van de gehele goed, waardoor sampling error verminderen. Tenslotte alle assays gemakkelijk worden voltooid binnen een dag na afloop van het experiment, waardoor grotere aantallen proeven op korte tijdsbestek worden uitgevoerd. Echter, ze ervan uitgaan dat celaantallen evenredig blijven met de signaalsterkte na behandeling, een veronderstelling dat soms niet is voldaan, met name voor cellulaire ATP. Ook als de cellen stijgen of dalen in omvang na behandeling, kan dit signaalsterkte beïnvloeden zonder dat celaantal. We concluderen dat alle levensvatbaarheid assays, waaronder handmatige tellingen, lijdt aan een aantal kanttekeningen, maar dat geautomatiseerde levensvatbaarheid assays zijn goed de initiële investering waard. Met behulp van alle drie de testen levert samen een uitgebreid overzicht van de cellulaire structuur en functie.

Het snelheidsbeperkende factor in deze experimenten is de infrarood kleuring, de ATP test relatief korte duur. Voor de infrarood assays, verwachten we dat acht 96-well platen kan worden gekleurd en gescand binnen een dag door maar liefst twee partijen van vier borden elk (zie figuur 1). Deze schatting gaat uit 20 min van fixatie, 30 min. van het wassen, 30 min van het blokkeren, 2 hr primaire antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 1 uur secundair antilichaam incubatie gevolgd door 30 min ...

Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van meerdere levensvatbaarheidstests die een uitgebreider beeld van de cellulaire conditie geven dan één enkele test afzonderlijk kan bieden. Dit wordt bereikt door eerst de ATP-niveaus van geplaatste cellen te meten om de metabole functie te beoordelen. De tweede stap is het immunostainen van cytoskeletproteïnen, zoals alpha-tubuline of microtubule-associated protein two, met behulp van infraroodantilichamen met golflengten van 800 nanometers.Vervolgens worden de cellen gelabeld met infrared drac five en sapphire om de nucleus en het cytoplasma te kleuren bij 700 nanometers. De laatste stap is het afbeelden van de alpha tubulin of map two en de drac five plus sapphire bij zowel de 700 als de 800 nanometer golflengten op een infrarood-imager. Uiteindelijk bieden deze luminescente en infrarode assays informatie over zowel anatomische structuren als fysiologische functies.Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden, zoals de MTT-viabiliteitsassay, is de snelle en gevoelige meting van meerdere aspecten van de cellulaire integriteit. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen en farmacologie, zoals de vraag of therapeutische verbindingen anatomische structuren en de metabole functie kunnen beschermen. Om te beginnen met het oogsten en heropvullen van cellen in 100 of 200 µL medium bij verschillende celdichtheden in een 96-wells plaat zoals beschreven in het bijbehorende protocol, vul de omliggende wells dan met 200 µL steriel water om randverdampingseffecten te verminderen.Laat de cellen gedurende de nacht hechten bij 37 °C in een CO2-gebufferde incubator. Verwijder de volgende dag 50 van de 100 µL medium of 150 van de 200 µL medium, zodat er in elke well 50 µL medium achterblijft. Voeg vervolgens 25 µL van het cell titer glow-reagens toe aan elk van de binnenste wells in kolommen twee tot en met zes.Om een verdunning van één op twee te verkrijgen in kolommen zeven tot en met 11, rijen B tot en met D, voeg dan 50 µL van het CellTiter-Glo-reagens toe om een verdunning van één op één te verkrijgen in de resterende wells. Kolommen zeven tot en met 11, rijen E tot en met G. Verwijder geen medium, maar voeg in plaats daarvan 100 µL CellTiter-Glo-reagens toe om een verdunning van één op één te verkrijgen in een totaalvolume van 200 µL. Plaats de plaat onmiddellijk 10 minuten op een schudplaat of orbitale shaker om de monsters te mengen terwijl ze incuberen.Breng vervolgens 60 µL uit elke put over naar een witwandige 96-wellplaat. De luminescentiewaarden zijn in witte platen hoger dan in heldere of zwarte platen, omdat zij het licht naar boven reflecteren richting de detector. Indien er tijdens de overdracht bellen ontstaan, verwijder deze dan met behulp van een luchtstroom uit een plastic transferpipetbulb.Plaats de plaat vervolgens binnen 12 minuten na toevoeging van de reagentia op een luminometer en lees de luminescentiewaarden af. Bereken het gemiddelde van de luminescentiewaarden van de drie of zes wells in elke groep en zet deze uit als functie van het aantal cellen; ga verder met de hoogste verdunning van reagentia die nog steeds lineaire en proportionele resultaten geeft, zoals gedefinieerd in de bijbehorende tekst. Dit bespaart kosten voor de infraroodassays; oogst de cellen en resuspendeer ze bij verschillende dichtheden zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Vul de omliggende putjes met 200 µL steriel water om het effect van temperatuurgradiënten en verdamping langs de randen te verminderen. Laat de cellen gedurende de nacht hechten bij 37 °C in een CO2-gebufferde incubator en fixeer de cellen vervolgens door 100 µL van een fixatief toe te voegen, zoals 4% formaldehyde en 4% sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer. Incubeer de plaat 20 minuten bij kamertemperatuur, verwijder daarna het fixatief en was de cellen drie keer met 200 µL PBS.Verdun vervolgens de blokkeeroplossing één-op-één in PBS en voeg 0,3% Triton X 100 toe als celpermeabilisator. Voeg daarna 35 µL van de blokkeeroplossing toe aan elke well, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen bellen in de wells ontstaan. Incubeer de plaat met de blokkeeroplossing gedurende 30 tot 60 minuten bij kamertemperatuur.Verdun tijdens deze incubatie de primaire antilichamen voor de eiwitten van belang. Verdun bijvoorbeeld het primaire Antifa-tubuline-antilichaam 1:10.000 in een mengsel van één deel blokkeringsbuffer en één deel PBS met 0,3% TRITTON X 100, terwijl de procedure wordt geoptimaliseerd. Andere antilichaamverdunningen zijn hier: het primaire Antifa-tubuline-antilichaam wordt ook 1:5.000 verdund in een mengsel van één deel blokkeringsbuffer en één deel PBS met 0,3% Triton X 100.Voeg vervolgens de antilichamen in de hier weergegeven concentraties toe aan de op de plaat gefixeerde cellen. Zorg ervoor dat de negatieve controle-wells in kolom twee in de blokkeringsoplossing blijven, aangezien deze alleen worden blootgesteld aan secundaire antilichamen. Incubeer de cellen in de primaire antilichamen gedurende één tot twee uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius.Bereid vervolgens de 800 nanometer anti-muis IgG secundaire antilichamen voor door deze na de incubatie met het primaire antilichaam één op 1000 of één op 2000 te verdunnen in een mengsel van één op één blokkeringsbuffer en PBS met 0,3% Triton X 100. Was de wells drie keer gedurende 10 minuten per keer met 200 microliters PBS per well. Voeg daarna 35 microliters secundaire antilichamen toe aan de wells.Voeg de 1:1000 verdunning toe aan de bovenste helft van de plaat en de 1:2000 verdunning aan de onderste helft. Incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in de secundaire antilichamen, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Was vervolgens de ongebonden secundaire antilichamen weg met drie wasbeurten van 10 minuten met PBS, waarbij telkens 200 µL per putje wordt gebruikt.Verdun vervolgens de DRAC five-stamoplossing 1:10.000 voor een eindconcentratie van 0,5 µM en de sapphire-stamoplossing 1:1.000 in PBS met 0,3% Triton X 100. Voeg 35 µL van dit mengsel toe aan de linkerhelft van de plaat, maar voeg niets toe aan de putjes voor de negatieve controle in kolom twee. Voeg aan de rechterhelft van de plaat 35 µL toe van DRAC five verdund 1:20.000 en sapphire verdund 1:2.000.Incubeer in deze oplossingen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en buiten het licht. Was de plaat vervolgens drie keer met 200 µL PBS per put gedurende telkens 10 minuten. Begin met het scannen van de platen op de infraroodimager bij een intensiteit van vijf en een resolutie van 169 µm.Instellingen van gemiddelde of lage kwaliteit zijn voldoende. Scan vervolgens bij verschillende focus-offsets van 2,5 millimeter, 3,0 millimeter, 3,5 millimeter en 4,0 millimeter om te bepalen waarbij de hoogste signaal-ruisverhouding en het scherpste signaal worden behaald. Zodra de focus-offset is geoptimaliseerd, gebruikt u de incel western-functie in de software om een raster van de juiste grootte op de afbeelding van de plaat te plaatsen en exporteert u de gegevens naar Microsoft Excel.Trek het gemiddelde van de geïntegreerde intensiteiten in de negatieve controleputjes af van elk overeenkomstig datapunt in de kanalen van 700 en 800 nanometer. Bereken vervolgens het gemiddelde van de geïntegreerde signaalintensiteiten voor elke groep putjes en zet de gegevens uit na optimalisatie in een scatterplot tegenover de celdichtheid. De signaalsterkte in alle drie de assays was significant gecorreleerd met het aantal cellen per putje; hoewel alle drie de assays zeer lineair waren, waren ze niet gelijkwaardig in gevoeligheid.De A TP-assay vertoonde de hoogste sensitiviteit van de drie, gedefinieerd als de meest proportionele verandering van de luminescentie-output bij afnemende celaantallen in primaire neuronale cellen van ratten. De optimale reagensconcentraties waren verschillend en de assays vertoonden minder lineariteit over het gehele assay-bereik. De assays waren echter beide lineair en sensitief bij plating-dichtheden onder de hier getoonde 100 000 cellen.Onze dosis-respons-curves van neuroblastoomcellen behandeld met MG 1 32, een proteasoomremmer; MG 1 32 werd toegepast in de aanwezigheid of afwezigheid van de glutathione-precursor N-acetylcysteïne. N-acetylcysteïne verschuift alle drie de curves naar rechts. Bijvoorbeeld, de IC 50 gemeten met DRAC five plus sapphire was 1,64 micromolar MG 1 32 zonder N-acetylcysteïne en 4,64 micromolar MG 1 32 in de aanwezigheid van N-acetylcysteïne. Dit was vergelijkbaar met de waarden gevonden in de alfa-tubuline-assay van respectievelijk 1,96 micromolar en 6,35 micromolar MG 1 32.Echter, de ATP-niveaus stegen bij lage concentraties MG 1 32, een fenomeen dat hormese wordt genoemd. Deze gegevens onthullen dat de ATP-niveaus na behandeling niet noodzakelijkerwijs in proportie staan tot de celconcentratie, en dat N-acetylcysteïne ook de metabole functie kan beschermen. Zodra de luminescente ATP-assay onder de knie is, kan deze binnen 30 minuten worden voltooid, en de infrarode kleuring kan eenvoudig binnen acht uur worden afgerond.Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om te onthouden dat ze het aantal cellen niet op dezelfde manier meten als een microscoop met hoge resolutie. Een kanttekening is bijvoorbeeld dat de eiwitniveaus van alpha tubulin of de TP-niveaus door de behandelingen kunnen veranderen zonder dat er parallelle veranderingen in het aantal cellen optreden.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bepalen van het aantal cellen in cultuur is belangrijk in standaardisatie van kweekomstandigheden en in het uitvoeren van nauwkeurige kwantificatie experimenten. In deze video laten we zien hoe cellen worden geteld met behulp van een hemacytometer.

Tellen en bepalen van de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen

De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.

Monogene Assay: hechtende cellen

Een aangepaste 3-D in vitro systeem wordt gepresenteerd waarin de groei-eigenschappen van verschillende tumor cellijnen in gereconstitueerde basaalmembraan correleren met de slapende of proliferatieve het gedrag van de tumorcellen in een gemetastaseerd tweede...

Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

We beschrijven een eenvoudige celgebaseerde bioassay voor het detecteren, kwantificeren en volgen van de activiteit van leden van de vasculaire endotheliale groeifactor familie van liganden. De test maakt gebruik van chimère receptoren tot expressie gebracht in een factor-afhankelijke cellijn die een semi-kwantitatieve of kwantitatieve beoordeling van receptorbinding en verknoping verschaffen door het ligand.

Een eenvoudige bioassays voor de beoordeling van de vasculaire endotheliale groeifactoren

Het is vaak noodzakelijk om te beoordelen van de potentiële cytotoxiciteit van een reeks van verbindingen op gekweekte cellen. Hier beschrijven we een strategie om betrouwbaar op te schermen voor giftige stoffen in een 96-well formaat.

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.

Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen en de dood in 3D sferoïde culturen van kankercellen

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Dit protocol presenteert veelgebruikte cytotoxiciteitstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red en MTT-assays) aangepast voor de beoordeling van cytotoxiciteit in zebravisembryo's (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen.

Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Hier presenteren we een protocol om de overleving na stress in gistmonsters te kwantificeren. De test maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen, SYTO 9 en propidiumjodide (PI), om de integriteit van het plasmamembraan te kwantificeren. Het maakt gebruik van flowcytometrie om kwantitatieve en reproduceerbare schattingen te geven van de levende, dode en beschadigde celfracties voor monsters na oxidatieve stress.

Een geoptimaliseerde LIVE/DEAD-test in combinatie met flowcytometrie voor het kwantificeren van overleving na stress in gistcellen

Leer meerdere viabiliteitstests voor cellen in cultuur met ATP-metingen, immunokleuring en infraroodbeeldvorming. Deze methode biedt een objectieve, uitgebreide beoordeling van zowel structurele als functionele aspecten van celgezondheid.

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

Meer video's verkennen