Name: Een methode voor het kweken van embryonale C. elegans Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro. Deze methode maakt celtype-specifieke differentiatie en genexpressie-analyse mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sterretjes (*) geven aan nieuwe of gewijzigde stappen opzichte Christensen et al. 1. 1. Material Setup <ol><li> De celkweek procedure vereist grote hoeveelheden eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen. Groeien C. elegans 8P op agarplaten geënt met NA22 (beschikbaar via het C. elegans Genetische Consortium - CGC) bacteriën grote hoeveelheden eieren isoleren. In deze platen de hoeveelheid pepton gebruikte 8 keer de hoeveelheid die gewoonlijk wordt gebruikt voor NGM platen. Hoe hoger pepton concentratie ondersteunt de groei van NA22 bacteriën efficiënter, die in strijd zijn OP50-, groeien in dikke lagen. </li></ol> 8P platen recept: Los 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 25 g agar in 1 liter steriel gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 30 minuten. Laat het medium afkoelen bij 55 ° C en voeg vervolgens steriel gefiltreerd 1 ml van cholesterol (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 ml MgSO4 en 25 ml KP buffer (voorraad van 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Giet vloeibaar agar medium in 10 cm petrischalen (25 ml / plaat). <ol start="2"><li> De volgende dag verspreid het gehele oppervlak van elke verrijkt pepton agar plaat met 1 ml van NA22 E. coli nacht gekweekt in 2XYT medium (16 g trypton, 10 g gistextract, 5 g NaCl in 1 liter steriel water, pH 7,0) bij 37 ° C. Deze bacteriën vormen een rijke bron van voedsel met een dikke laag ondersteunen van de groei van grote hoeveelheden zwangere volwassenen vormen. Voeg gezaaide plaatjes gedurende een nacht bij kamertemperatuur om de groei van de bacteriën mogelijk. Het proces kan worden versneld door incubatie bij 37 ° C gedurende 4-5 uur. </li><li> Transfer uitgehongerde dieren gezaaid 8P platen. Wassen dieren uit een uitgehongerde NGM plaat met behulp van 5-6 ml M9 buffer of water en voeg 1-2 ml van deze suspensie aan elk 8P plaat. </li><li> Laat de groei en vermenigvuldiging van de dieren until de platen worden bevolkt bij samenloop door zwangere volwassenen. </li><li> Isoleer het nodig is voor de voorbereiding van C. eieren elegans embryonale cellen, uit zwangere volwassenen met 5-6 ml lysis-oplossing. </li></ol> Lysis-recept 5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH en 18,5 ml van de steriele H 2 O. Dit mengsel moet vers voor elk gebruik worden bereid. <ol start="6"><li> Was de eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen met behulp van ei-buffer: </li></ol> Ei buffer recept 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolariteit 340 mOsm. <ol start="7"><li> Verwijder de eierschaal dat de eieren omgeeft door behandeling met chitinase. Chitinase is een enzym met de hoogste activiteit bij zure pH 25. Los chitinase (Sigma, catalogusnummer. C6137) in ei-buffer pH 6,5 tot een eindconcentratie van 2 mg / ml. Bewaar de chitinase voorraadoplossing bij -20 ° C in 1 ml porties in steriele 15 ml conische buizen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot enkele maanden. </li><li> Groeien C. elegans gekweekte cellen op geautoclaveerd dekglaasjes (12 mm diameter), bedekt met pinda lectine. Los pinda lectine in steriel water (0,5 mg / ml). Peanut lectine oplossing mag niet worden gefilterd of geautoclaveerd. Het hoeft ook niet te worden behandeld met UV-licht. WINKEL 2 ml porties bij -20 ° C maximaal 6 maanden. </li><li> Volledige celkweekmedium (500 ml) bevat 500 ml L-15 kweekmedium Gibco, 50 ml foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd), 7,7 g sucrose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (2%). De compleet medium wordt vervolgens gefilterd met behulp van een 0,20 um porie filter. </li></ol> Merk op dat het ei buffer en het kweekmedium hebben osmolariteit van 340 en 345 mOsm respectievelijk. In tegenstelling tot zoogdiercellen C. elegans cellen een relatief hoge osmolariteitdie moet in telling worden gehouden bij het bereiden van oplossingen die in direct contact met het plasmamembraan van de cellen komt. De recepten van deze reagentia werden aangepast om de gewenste osmolariteit, die werd gemeten met een osmometer 1 bereikt. Het is niet noodzakelijk een osmometer gebruiken als deze recepten precies worden gevolgd en zorg wordt gebruikt bij het bereiden van deze reagentia. Echter, men moet een Osmoter gebruiken als andere oplossingen moeten worden voorbereid, waarvan de recepten zijn hier niet vermeld of in een van de publicaties die C. gebruiken elegans gekweekte cellen. 2. Ei Isolatie <ol><li> Het wordt aanbevolen om te beginnen met minstens vier 8P platen voldoende eieren te verzamelen voor 12 putjes van gekweekte cellen (in 24-well platen). </li><li> Voordat u begint met de procedure ontdooien een buis van pinda lectine voorraad oplossing. Plaats geautoclaveerd dekglaasjes onder aan de putten in een 24-wells plaat en voeg 200 ul pinda lectine op de dekglaasjes. Incubeer gedurende 1 uur of Until de cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Verwijder volledig de pinda lectine en was de putten eenmaal met 1 ml steriel geautoclaveerd water. Volledige verwijdering van de pinda lectine van de dekglaasjes essentieel voor het vermijden cel klonteren. </li><li> Was de zwangere volwassenen uit de agar platen met behulp van steriele geautoclaveerd water. Verzamel de schorsing in twee steriele conische 50 ml tube. Laat de buizen op ijs gedurende 5 minuten tot precipitatie van de wormen mogelijk onderaan de buizen (*). Verwijder het water met een transfer plastic pipet en vervang het met vers steriel geautoclaveerd water. Pellet wormen door tafelblad centrifugatie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten (*). Herhaal deze laatste stap tenminste 3. </li><li> Breng wormen in een steriele 15 ml conische buis en pellet ze op 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 min (*). Gebruik hogere centrifugeersnelheid niet om de bacteriën te voorkomen verzamelen op de bodem van de buis ook. Soms na centrifugeren de wormen niet volledig afgedraaid. After elk wassen en vóór verwijdering van de bovenstaande vloeistof, plaats de buizen gedurende 5 minuten op ijs. In gekoeld water precipiteren wormen naar de bodem van de buis. </li><li> Verwijder het water en voeg 5-6 ml lysisoplossing (zie Material ingesteld). Rock de schorsing zachtjes gedurende 5-10 minuten en dan beginnen de controle worm lysis onder de stereomicroscoop om de 2-3 minuten. Een daling van de schorsing kan ook op een dekglaasje worden geplaatst voor een makkelijker inspectie. De incubatietijd varieert afhankelijk van de versheid van het bleekmiddel, koop kleine flesjes van bleekwater en open een nieuwe fles elke maand. </li><li> Wanneer ~ 70-80% van de wormen worden gelyseerd (10 min vanaf het begin van de incubatie), stop de lysis reactie door toevoeging van 9 ml ei buffer pH 7,3 (zie Material ingesteld). Centrifugeer de suspensie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Vanaf dit punt een Bunsen brander, op de bank om nieuwe verontreiniging van de eieren (*) voorkomen. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een steriele plastic overdracht pipet en was het pellet 3-4x met ei buffergeheugen totdat de oplossing helder is. Zorg ervoor dat u de pellet goed te mengen in het ei buffer tijdens elke wasbeurt. </li><li> Eieren worden gescheiden van de kadavers met 30% sucrose oplossing. Resuspendeer de pellet in 2 ml steriele ei buffer en voeg 2 ml 60% sucrose-oplossing (voorraad in steriele ei buffer). Meng goed en centrifugeer 20 min bij 200 xg (~ 1200 rpm) (*). </li><li> Verwijder voorzichtig de buizen uit de centrifuge. De eieren zweven boven de oplossing. Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, de overdracht van alle eieren in een nieuwe steriele 15 ml conische buis. </li><li> Voeg 10 ml steriel ei buffer aan de buis en centrifugeer bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Herhaal het wassen 3 x. Zorg ervoor dat de eieren worden volledig opnieuw gesuspendeerd in het ei buffer tijdens elke wasbeurt. </li></ol> 3. Embryonale cellen Dissociatie Gaan met de volgende stappen van de procedure onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire stroming kap. Hoewel dierentoga bacteriën op platen, wast en de behandeling met lysis oplossing die bleekmiddel meeste onschadelijk maken indien niet alle bacteriën. Aldus gebruik van een laminaire kap op dit punt van de procedure verhindert nieuwe verontreiniging van het ei suspensie. <ol><li> Resuspendeer afgedraaid eieren in 1 ml 2 mg / ml chitinase (voorraad in ei-buffer pH 6,5 (*)) en overbrengen naar een nieuwe steriele 15 ml conische buis. Rock de buis gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. De exacte incubatietijd verandert al naar gelang de versheid van het enzym en de temperatuur van de kamer en moet daarom worden bepaald voor elke bereiding. Het wordt aanbevolen om te beginnen bewaken de eieren onder een omgekeerde microscoop celcultuur na 10 minuten incubatie. Opmerking: in onze ervaring, lage pH verhoogt de chitinase enzymatische activiteit. Daarom gebruiken we ei buffer bij pH 6,5 tot chitinase (recept hierboven vermeld, waarbij de pH wordt ingesteld op 6,5 met NaOH) opgelost. </li><li> Bij ~ 80% van de eierschalen worden verteerd door dechitinase behandeling (Figuren 1 AB), pellet de eieren door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 3 ml L-15-medium (*). </li><li> Breng de eieren in een 6 cm diameter plaat en zachtjes distantiëren de cellen met behulp van een 10 ml steriele spuit met een 18 G naald. Controleer de dissociatiegraad door een druppel van suspensie in een nieuwe plastic petrischaal en het bekijken onder de microscoop. Geen lucht aan te zuigen in de spuit tijdens deze procedure om schade aan de cellen te voorkomen. Verdere dissociatie tot ~ 80% van de cellen gedissocieerd. </li><li> Filter de schorsing met een steriele 5 micrometer Millipore filter. Celsuspensies worden gefilterd om celklonten, onverteerd eitjes en larven te verwijderen. Filter additionele 4-5 ml vers L-15 medium door het filter naar alle cellen herstellen. Niet te veel kracht te gebruiken tijdens de filtratie stap om da te voorkomenmaging het filter en / of de cellen. </li></ol> 4. Kweken Cellen <ol><li> Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips verwijder zorgvuldig alle supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in volledige L-15-medium en plaat 1 ml / putje. De hoeveelheid toegevoegde medium afhankelijk van het aantal gebruikte platen 8P, de samenvloeiing van de wormen op de platen en het soort experimenten die worden uitgevoerd op de cellen. De celdichtheid worden bepaald met een hemocytometer. Voor patch-clamp opnames plating dichtheid van ~ 230.000 cellen / cm 2 is optimaal. </li><li> Houd de 24 wells plaat in een plastic Tupperware container met natte papieren handdoeken om verdamping van kweekmedium te voorkomen. Bewaar de container in een bevochtigde incubator bij 20 ° C en lucht. </li><li> De cellen zijn meestal klaar voor de experimenten binnen 24 uur wanneer de morfologische differentiatie en uitdrukkelijkeion van GFP markers compleet. Cellen kunnen in kweek worden gehouden binnen 2 weken, maar ze zijn meestal meest gezonde tot 7-9 dagen na uitplaten. Het medium moet eenmaal daags worden vervangen om gezonde cellen te behouden. </li></ol>

C. elegans is een krachtige modelorganisme voor het ontcijferen van de genetische wegen betrokken bij de ontwikkeling, het gedrag en veroudering. Het gemak is voornamelijk het gevolg van het gemak waarmee het genetisch gemanipuleerd kan worden en uit zijn korte levenscyclus. Ondanks het gemak, C. elegans heeft zijn beperkingen. C. elegans cellen zijn klein en ingesloten in een onder druk cuticula dat de toepassing van methoden die directe toegang tot de cellen, zoals elektrofysiologische en fa...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire basis van cellulaire functie, differentiatie, en gedrag. Terwijl het genoom, metabolische en biosynthetische routes lijken op gewervelde dieren, de genetische en moleculaire volgzaamheid veel groter 2. Onder de voordelen zijn de grootte en simpele anatomie, de snelle levenscyclus (3 dagen bij 25 ° C), korte levensduur (2 weken) en een groot aantal nakomelingen (&gt; 200). Door zijn tweeslachtig karakter en de korte levenscyclus, moleculaire en genetische manipulaties zijn eenvoudig in C. elegans, inclusief de ontwikkeling van transgene dieren 3,4 en de toepassing van gen knock-down technieken zoals RNA interferentie 5. C. elegans lichaam en eierschaal transparant. Daarom cellen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in zowel de volwassenen en het embryo met standaard microscopie. In de afgelopen 40 jaar, de C. elegans </em&gt; gemeenschap is van onschatbare waarde middelen gecreëerd voor C. elegans onderzoek met inbegrip van een grote verzameling van mutanten, knockouts en transgenics, een gedetailleerde beschrijving van de anatomie en ontwikkeling 6,7, inclusief de volledige reconstructie van het zenuwstelsel 8, en een volledig gesequenced genoom die goed geannoteerd en ter beschikking van de hele gemeenschap ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Ondanks de vele voordelen, hebben sommige experimentele benaderingen uitdagend in C. elegans. Deze omvatten degenen die toegang vereisen het plasmamembraan van de cellen en isolatie van weefsels of celtypen. Inderdaad C. elegans weefsels worden beperkt binnen haar onder druk hydrostatisch skelet, die niet gemakkelijk wordt verteerd door enzymatische behandeling of detergenten. Aan het einde van de jaren 1990 Miriam Goodman en Janet Richmond pionier methoden voor elektrofysiologische opnames van C. elegansneuronen en spiercellen in situ 9,10. Hoewel deze methoden gaf ons belangrijke inzichten in neuronale en spierfunctie in vivo, ze zijn uitdagend en lage doorvoersnelheid. Alternatieve methoden voor celfunctie studeren in vivo waren ontwikkeld, vooral met name in vivo calcium beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerd calcium sensoren zoals GCamP en cameleon 11-13. Deze methoden echter niet het gebruik van farmacologische hulpmiddelen staan ​​omdat ze worden toegepast op intacte levende dieren. De eerste poging tot het kweken van C. elegans cellen in vitro op grote schaal werd gemaakt door Laird Bloom tijdens de voorbereiding van zijn proefschrift 14. Helaas, moeilijkheden met slechte hechting van de cellen aan het substraat, slechte celdifferentiatie en overleving verhinderde de invoering van deze vroege protocol als een robuust celkweekwerkwijze. In 1995 Edgar en collega&#39;s een procedure gepubliceerdtot celdeling en morfogenese onderzoeken door isolatie en de cultuur van een enkele C. elegans embryo 15. Embryonale cellen verkregen door digestie van de eierschalen met een combinatie van enzymatische behandeling en handmatige dissociatie, bleven prolifereren, produceren tot ~ 500 cellen 15. Vervolgens Leung en collega&#39;s gekweekt een kleine aantallen blastomeres intestinale morfogenese bestuderen. Zij toonden aan dat een in vitro geïsoleerde E blastomeer geproduceerd gepolariseerde darmcellen die een structuur analoog aan de darmlumen door interactie met elkaar via apicale contactplaatsen 16. Buechner en collega&#39;s rapporteerden ook een soortgelijke methode voor het kweken C. elegans embryonale cellen in vitro 17. Op basis van dit vroege werk, Christensen en collega&#39;s ontwikkelden een robuust protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro 1. Zetoonde aan dat geïsoleerde C. elegans cellen kunnen differentiëren in verschillende celtypes en de functies die zij bezitten in vivo en het uiten van celspecifieke markers handhaven. Verschillende technieken die uitdagend in vivo kan worden toegepast op geïsoleerde C. elegans embryonale cellen. Deze omvatten elektrofysiologische 1,18 19, weergave en immunochemische technieken 20,21, en ​​isolatie van specifieke celtypes TL-Activated Cell Sorting (FACS) voor de bouw van cel-specifieke cDNA-bibliotheken 22,23. Gene knockdown technieken zoals RNA interferentie (RNAi) kan worden aangebracht op gekweekte C. elegans cellen 1 en een nieuwe metabolische labeling met gebruik Azido-suiker als een instrument voor glycoproteïne ontdekking recent ontwikkeld in vitro gekweekte C. elegans cellen 24. Tenslotte breidt de celkweek methode matrix of technieken die kunnen worden toegepast op de C. elegans model in een poging om genfunctie ontcijferen in de context van een levend organisme. We beschrijven hier het protocol voor het kweken van C. elegans embryonale cellen in vitro, die grotendeels is gebaseerd op het protocol eerst beschreven door Christiansen en collega 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Granulated</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN</td><td></td></tr><tr><td>NA22 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peanut Lectin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glucose</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis (2-amin&#8211;thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclaved distilled H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Portable Pipet Aid, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube </td><td>USA Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 18 gauge Needles</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 ml Syringes</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td><td>VWR International Inc.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- Fine Forceps </td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope with x10 objective</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambient air humidified Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; c. elegans</em&gt; cellen

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is een krachtig modelsysteem, waarin de genetische en moleculaire technieken zijn eenvoudig toepasbaar. Tot voor kort echter technieken die directe toegang tot cellen en isolatie van specifieke celtypen vereisen, kunnen niet worden toegepast in C. elegans. Deze beperking is te wijten aan het feit dat de weefsels worden ingesloten in een onder druk cuticula die niet gemakkelijk verteerd door behandeling met enzymen en / of reinigingsmiddelen. Gebaseerd op vroege pionierswerk door Laird Bloom, Christensen en collega&#39;s 1 ontwikkelde een robuuste methode voor het kweken van C. elegans embryonale cellen op grote schaal. Eieren worden geïsoleerd van zwangere volwassenen door behandeling met bleekwater / NaOH en vervolgens behandeld met chitinase om de eierschalen te verwijderen. Embryonale cellen worden vervolgens gedissocieerd door handmatig pipetteren en uitgeplaat op substraat bedekt glas in serum verrijkte media. Binnen 24 uur van isolatie cellen beginnen te differentiëren door het veranderen van de morfologie en expressie celspecifieke Markers. C. elegans cellen gekweekt met deze methode overleven gedurende 2 weken in vitro en zijn gebruikt voor elektrofysiologische, immunochemische, en imaging analyses als ze zijn gesorteerd en gebruikt voor microarray profilering.

C. elegans gekweekte cellen differentiëren en uitdrukkelijke cel specifieke markers Christensen en collega&#39;s met behulp van trypan blauw kleuring toonde aan dat&gt; 99% van de embryonale C. elegans cellen overleven de isolatie procedure. Op dag 9 en 22 na plateren, 85% en 65%, respectievelijk nog in leven 1. Geïsoleerde embryonale C. elegans cellen moeten hechten aan een substraat om te differentiëren. Cellen die niet aan de vorm klonten houden en het i...

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Een methode voor het kweken van embryonale<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Het algemene doel van deze procedure is om embryonale cellen van de zeepok elegant te dissociëren en in vitro te kweken. Dit wordt bereikt door eerst grote hoeveelheden volwassen dieren te kweken. Vervolgens worden de eitjes uit de volwassenen geïsoleerd.Vervolgens worden de eieren behandeld met chitinase om het eierschild op te lossen. Ten slotte worden de cellen handmatig gedissocieerd en uitgeplaat voor kweek. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de expressie van celspecifieke markers aantonen via immunofluorescentie, microscopie, elektrofysiologie en calcium-imagingtechnieken.De procedure wordt gedemonstreerd door een postdoc in het laboratorium. Nadat er ten minste vier platen met sea elegance zijn gekweekt tot het GR-volwassen stadium en de media en oplossingen zijn bereid volgens het tekstprotocol, wordt gestart met de isolatie van eieren door eerst een buisje met eerder bereide pinda-lectine-stamoplossing klaar te zetten.Plaats geautoclaveerde dekglasjes in de wells van een 24-wells plaat en voeg 200 µL pinda-lectine toe aan elk dekglasje; incubeer dit gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens de oplossing en gebruik steriel water

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hele embryo cultuur techniek stelt ons in staat om de cultuur muis en rat...

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

De overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd bij synapsen grote invloed op synaptische sterkte. Deze methode kwantificeert fluorescent gelabelde neurotransmitter receptoren in drie dimensies met single-synaps resolutie...

Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em&gt; C. elegans</em

Deze video introduceert een methode om embryonale C. eleganscellen in vitro te isoleren en steriel te gekweekt.

Enzymatische spijsvertering en handmatige dissociatie: een methode om C. elegans-embryo's voor celcultuur te bereiden

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

C. elegans is meestal gekweekt op vaste agar platen of in vloeibare culturen bezaaid met E. coli. Om te voorkomen dat bacteriële bijproducten van verstorende toxicologische en nutritionele studies, hebben we gebruik gemaakt van een axenische vloeibaar medium, CeHR, te groeien en te synchroniseren een groot aantal wormen voor een reeks afgeleide toepassingen.

Kweken Caenorhabditis elegans In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Leer een geoptimaliseerd protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro. Deze methode maakt celtype-specifieke differentiatie en genexpressie-analyse mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Een methode voor het kweken van embryonale

Meer video's verkennen