Een methode voor het kweken van embryonale

Het algemene doel van deze procedure is om embryonale cellen van de zeepok elegant te dissociëren en in vitro te kweken. Dit wordt bereikt door eerst grote hoeveelheden volwassen dieren te kweken. Vervolgens worden de eitjes uit de volwassenen geïsoleerd.

Vervolgens worden de eieren behandeld met chitinase om het eierschild op te lossen. Ten slotte worden de cellen handmatig gedissocieerd en uitgeplaat voor kweek. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de expressie van celspecifieke markers aantonen via immunofluorescentie, microscopie, elektrofysiologie en calcium-imagingtechnieken.

De procedure wordt gedemonstreerd door een postdoc in het laboratorium. Nadat er ten minste vier platen met sea elegance zijn gekweekt tot het GR-volwassen stadium en de media en oplossingen zijn bereid volgens het tekstprotocol, wordt gestart met de isolatie van eieren door eerst een buisje met eerder bereide pinda-lectine-stamoplossing klaar te zetten.

Plaats geautoclaveerde dekglasjes in de wells van een 24-wells plaat en voeg 200 µL pinda-lectine toe aan elk dekglasje; incubeer dit gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Aspireer vervolgens de oplossing en gebruik steriel water om de wells te wassen, zodat alle sporen van pinda-lectine worden verwijderd om celklontering te voorkomen.

Was vervolgens met steriel autoclaafwater de volwassen GR van de agarplaten af en verzamel de suspensie in twee steriele conische buizen van 50 milliliter. Plaats de buizen tot vijf minuten op ijs zodat de wormen naar de bodem kunnen zakken. Verwijder met een transferpipet het water en vervang dit door vers, steriel autoclaafwater. Centrifugeer de wormen bij 200 G gedurende 10 minuten.

Na de laatste wasbeurt worden de wormen geresuspendeerd in vers steriel water en overgebracht naar een steriele conische buis van 15 milliliter, waarna ze opnieuw 10 minuten worden gecentrifugeerd bij 200 G. Als de wormen niet volledig zijn gepellet, wordt de buis vijf minuten op ijs geplaatst. Zodra de wormen volledig zijn bezonken, wordt het water verwijderd en worden vijf tot zes milliliter lyssolvectie toegevoegd.

Schud de suspensie vervolgens voorzichtig gedurende vijf tot 10 minuten en breng elke twee tot drie minuten een druppel van de suspensie aan op een dekglas om de lyse onder een stereomicroscoop te controleren. Wanneer 72 80% van de wormen gelyseerd is, wordt de lysereactie gestopt door negen milliliter ei-buffer toe te voegen. Steek vanaf dit punt een bunsenbrander aan en laat deze branden om hercontaminatie van de eieren te voorkomen. Verwijder voorzichtig het supernatant en gebruik ei-buffer om de pellet drie tot vier keer grondig te wassen totdat de oplossing helder is. Resuspendeer vervolgens de pellet, nadat het laatste supernatant is verwijderd om de eieren van de dierlijke karkassen te scheiden, in twee milliliter steriele ei-buffer en voeg twee milliliter 60% sucrose in ei-buffer toe.

Meng de eieren goed in de oplossing voordat u deze 20 minuten centrifugeert. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge bij 200 G. De eieren zullen bovenaan de oplossing drijven.

Gebruik daarom een pipetteerder en steriele tips van één milliliter om de eieren over te brengen naar een nieuwe steriele conische buis van 15 milliliter. Gebruik steriele eibuffer om de eieren drie keer te wassen terwijl u onder een laminaire flowkast werkt. Om bacteriële contaminatie te voorkomen, resuspendeert u de gepelletteerde eieren in één milliliter kinase van twee milligram per milliliter en brengt u deze over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.

Schud de buis 10 tot 30 minuten bij kamertemperatuur, afhankelijk van de versheid van het enzym, totdat ongeveer 80% van de eierschalen is verteerd. Centrifugeer de eieren bij 900 G gedurende drie minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg drie milliliters L 15-medium toe. Draag de eieren over naar een plaat met een diameter van zes centimeter en begin de handmatige dissociatie met een steriele spuit van 10 milliliter met een 18 gauge naald.

Om de graad van dissociatie te bewaken, plaatst u een druppel van de suspensie in een schone Petrischaal en bekijkt u deze onder een microscoop. Ga hiermee door totdat ongeveer 80% van de cellen is gedissocieerd. Om celklonten, onverteerde eitjes en uitgekomen larven te verwijderen, filtert u de suspensie voorzichtig door een vijf micron filter en laat u nog eens vier tot vijf milliliter L 15 medium door het filter lopen om de cellen terug te winnen voor de celkweek.

Na het centrifugeren van het filtraat bij 900 G gedurende drie minuten, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in compleet L 15-medium, waarbij één milliliter per well wordt toegevoegd. Bewaar de platen in een vochtige, afgesloten kamer bij 20 °C in omgevingslucht. Om te differentiëren moeten geïsoleerde embryonale elegan-cellen aan een substraat hechten. Het differentiatieproces begint ongeveer twee tot drie uur na het uitplaten en gaat gedurende ongeveer 24 uur door.

De morfologische kenmerken in vitro zijn opmerkelijk vergelijkbaar met die in vivo. Zo is hier te zien dat LM- en PLM-touchneuronen slechts twee neuronale uitlopers ontwikkelen, waarbij de ene langer is dan de andere, net zoals in vivo. Dit suggereert dat ten minste enkele van de moleculaire mechanismen die de differentiatie in elegan-cellen aansturen celautonoom zijn en dus gereproduceerd kunnen worden.

In vitro eiwitmarkers en post-translationele modificaties die celspecifiek zijn, kunnen ook in vitro worden waargenomen. Alpha-tubuline is bijvoorbeeld specifiek voor aanrakingsneuronen in de zeepoepworm, zoals hier wordt getoond; in vitro uitlopers van aanrakingsneuronen kleuren met een antilichaam dat is opgewekt tegen acetylated alpha-tubuline. Daarnaast, zoals te zien is in dit paneel, brengen gecultiveerde aanrakingsneuronen het toxische mutantkanaal MEC-4 D tot expressie, wat in vivo inderdaad leidt tot de dood van aanrakingsneuronen.

GFP-expresserende neuronen, geprepareerd uit een MEC four DPE 4G FP-stam, zijn aanvankelijk aanwezig in de cultuur, maar degenereren vervolgens. Echter, net als in vivo, kunnen de cellen worden gered van de dood door behandeling met een IDE en dantrolene, zoals hier wordt getoond. Patchclamp-technieken worden gebruikt om kalium-ionenkanalen, niet-selectieve kanalen en dopamine-transporter-afhankelijke kanalen in gecultiveerde cellen van de zee-egel te bestuderen.

Vanwege de geringe omvang van de cel moeten glazen pipetten een kleine tip hebben en vervolgens een brede kegelvorm om de verhoogde ingangsweerstand te compenseren. Bovendien wordt een groter succes behaald door een hoogspanningsimpuls toe te passen op het stukje membraan onder de tip van de pipet, in plaats van hele-cel-toegang te verkrijgen via zuiging, wat de cel kan beschadigen. In deze figuur wordt, om de rol van spanningsafhankelijke calciumkanalen te bestuderen, ION four gebruikt om het membraan te permeabiliseren en om touch-neuronen die chameleon YC 2.12 tot expressie brengen te kalibreren voor calcium-imaging in afwezigheid of aanwezigheid van calcium.

Daarnaast werd vastgesteld dat de gemiddelde vrije calciumconcentratie in touch-neuronen 200 nanomolar bedraagt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u embryonale cellen van C. elegans in vitro kunt isoleren en kweken.