Een methode voor het kweken van embryonale C. elegans Cellen
21 september 2013
We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.
Het algemene doel van deze procedure is om embryonische, elegante zeecellen te dissociëren en in vitro te kweken. Dit wordt bereikt door eerst grote hoeveelheden gravende dieren te kweken. Vervolgens worden eieren geïsoleerd uit volwassen dieren.
Vervolgens worden de eieren behandeld met chitinase om de eierschaal op te lossen. Ten slotte worden de cellen handmatig gedissocieerd en geplaatst voor cultivering. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die expressie van celspecifieke markers laten zien door middel van immunofluorescentie, microscopie, elektrofysiologie en calciumbeeldvormingstechnieken.
De procedure zal worden gedemonstreerd door rel ti, een postdoc mal laboratorium. Na het kweken van ten minste vier platen van zeeelegantie tot de GR volwassen fase en het voorbereiden van media en oplossingen volgens het tekstprotocol. Begin met eiisolatie door eerst een buis met eerder bereide pinda lectin stockoplossing te halen.
Plaats autoclave deksels in de putjes van een 24-putjesplaat en voeg 200 microliters pinda lectin toe aan elk deksel. Incubeer gedurende minimaal een uur op kamertemperatuur. Vervolgens aspireer de oplossing en gebruik steriel water om de putjes te wassen. Verwijder eenmaal alle sporen van pinda lectin om celklompvorming te voorkomen.
Vervolgens was de GR-volwassenen met steriele autoclave-water van de agarplaten en verzamel de suspensie in twee steriele conische 50 milliliter buisjes. Plaats de buisjes maximaal vijf minuten op ijs om de wormen naar de bodem te laten zakken. Verwijder met een overdrachtspijp de water en vervang het met vers, steriel autoclavewater centrifuge. De wormen bij 200 G gedurende 10 minuten.
Na de laatste wasbeurt, resus, suspendeer de wormen in vers steriel water en breng ze over in een steriele 15 milliliter conische buis voordat ze opnieuw worden gedraaid bij 200 G gedurende 10 minuten. Als de wormen niet volledig gepelleteerd zijn, plaats de buis gedurende vijf minuten op ijs. Zodra de wormen volledig zijn bezonken, verwijder het water en voeg vijf tot zes milliliter lysisoplossing toe.
Schakel vervolgens de suspensie zachtjes gedurende vijf tot 10 minuten en plaats elke twee tot drie minuten een druppel suspensie op een deksel en controleer op lysis onder een stereomicroscoop. Wanneer 72 80%van de wormen gelyseerd is, stop de lysisreactie door negen milliliter eivormingsbuffer toe te voegen voordat u vanaf dit punt verder spint, steek een bunsenbrander aan en houd deze aan om herbesmetting van de eieren te voorkomen, verwijder voorzichtig het supernatant en gebruik eivormingsbuffer om de pellet drie tot vier keer grondig te wassen totdat de oplossing helder is. Vervolgens, na het verwijderen van het laatste supernatant om de eieren van de dierenlijkjes te scheiden, resus, suspendeer de pellet in twee milliliter steriele eivormingsbuffer en voeg twee milliliter 60%sucrose in eivormingsbuffer toe.
Meng de eieren goed in oplossing voordat ze gedurende 20 minuten worden gecentrifugeerd. Bij 200 G, verwijder voorzichtig de buisjes uit de centrifuge. De eieren zullen drijven op de bovenkant van de oplossing.
Gebruik daarom een pipet en steriele 1 milliliter tips om de eieren over te brengen in een vers steriele 15 milliliter conische buis. Gebruik steriele eivormingsbuffer om de eieren drie keer te wassen terwijl u werkt onder een laminaire stromingskast. Om bacteriële besmetting te voorkomen, resus, suspendeer de gepelleteerd eieren in een milliliter van twee milligram per milliliter kinase en breng ze over in een verse 15 milliliter conische buis.
Schakel de buis gedurende 10 tot 30 minuten op kamertemperatuur, afhankelijk van de versheid van het enzym wanneer ongeveer 80%van de eierschalen worden verteerd. Centrifugeer de eieren bij 900 G gedurende drie minuten. Na het voorzichtig verwijderen van het supernatant, voegt u drie milliliter L 15-medium toe, brengt u de eieren over in een zes centimeter diameter plaat en begint u met handmatige dissociatie met behulp van een 10 milliliter steriele spuit met een 18 gauge naald.
Om de mate van dissociatie te controleren, plaatst u een druppel suspensie in een verse petrischaal en bekijkt u deze onder een microscoop. Ga door tot ongeveer 80%van de cellen zijn gedissocieerd. Om celklonten, onverteerde eieren en uitgekomen larven te verwijderen, filtert u de suspensie voorzichtig door een vijf micron filter en laat u een extra vier tot vijf milliliter L 15-medium door de filter lopen om de cellen te herstellen om de cellen te kweken.
Nadat het filtraat gedurende 900 G gedurende drie minuten is gecentrifugeerd, resus suspendeer de cellen in compleet L 15-medium geplaatst een milliliter per putje en bewaar platen in een vochtige verzegelde kamer bij 20 graden Celsius in omgevingslucht. Om geïsoleerde embryonische elegan cellen te differentiëren, moeten ze aan een substraat hechten. Het differentiatieproces begint ongeveer twee tot drie uur na het plateren en duurt ongeveer 24 uur.
De morfologische kenmerken in vitro zijn opmerkelijk vergelijkbaar met die in vivo. Zoals hier getoond, ontwikkelen een LM en PLM aanrakingsneuronen bijvoorbeeld slechts twee neuronale processen met de ene langer dan de andere zoals ze in vivo doen. Dit suggereert dat ten minste enkele van de moleculaire mechanismen die differentiatie in elegan cellen aansturen, cell-autonoom zijn en dus kunnen worden samengevat.
In vitro kunnen eiwitmarkers en post-translationele modificaties die celspecifiek zijn ook in vitro worden waargenomen. Bijvoorbeeld, alpha tubulin is een sated alleen in aanrakingsneuronen in zee elgan zoals hier in vitro processen van aanrakingsneuronen kleuren met een antilichaam opgewekt tegen een sated alpha tubulin. En bovendien, zoals te zien is op dit paneel, gecultiveerde aanrakingsneuronen drukken het toxische mutante kanaal MEC vier D uit, wat inderdaad leidt tot de dood van aanrakingsneuronen in vivo.
GFP-uitdrukkende neuronen bereid uit een MEC vier DPE 4G FP-stam zijn aanvankelijk aanwezig in cultuur, maar degenereren vervolgens. Echter, net als in vivo, kunnen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een herzien protocol voor de grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. De methode maakt de differentiatie van deze cellen in vitro mogelijk, waardoor de studie van genexpressie op celspecifieke wijze wordt geëvalueerd.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- C. elegans is een modelorganisme dat veel wordt gebruikt in biologisch onderzoek.
- Embryonale cellen kunnen inzichten bieden in ontwikkelingsprocessen.
- In vitro kweektechnieken verhogen de experimentele toegankelijkheid.
- Celspecifieke genexpressie is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire functies.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het kweken van embryonale C. elegans cellen.
- Om de studie van genexpressie in specifieke celtypen te vergemakkelijken.
- Om de toepassing van verschillende technieken op gekweekte cellen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Isoleren van eieren van volwassen C. elegans.
- Behandeling van eieren met chitinase om de eischaal op te lossen.
- Handmatige dissociatie van cellen voor kweek.
- Toepassing van immunofluorescentie-, microscopie- en elektrofysiologietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van gekweekte embryonale C. elegans cellen.
- Recapitulatie van genexpressiepatronen op celspecifieke wijze.
- Demonstratie van celspecifieke markers door middel van verschillende beeldtechnieken.
- Potentieel voor verder onderzoek met behulp van gekweekte cellen in de neurowetenschappen.
Conclusies
- Het herziene protocol is effectief voor het kweken van embryonale C. elegans cellen.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor het bestuderen van cellulaire differentiatie en genexpressie.
- Toekomstige toepassingen kunnen ons begrip van de ontwikkelingsbiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables scalable isolation and culture of embryonic C. elegans cells, providing a genetically tractable system for early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobiology and developmental pathways. By supporting long-term in vitro survival and differentiation, it facilitates reproducible phenotypic screening and biomarker discovery using electrophysiology, imaging, and molecular profiling. The approach enhances predictive confidence in target engagement studies by recapitulating in vivo-like cellular behaviors and marker expression in a controlled, high-throughput compatible format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through cell-specific marker expression and pathway analysis in a genetically defined system.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing direct access to embryonic cells for assay development and perturbation studies.
- Translational Value: Provides a disease-relevant system for studying neurodevelopmental targets with conserved molecular mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated embryonic cells suitable for preparing standardized substrates for immunofluorescence, electrophysiology, and calcium imaging assays.
- Operational Value: Enables scalable production of cells for multi-well plating, supporting assay standardization and reproducibility across screening campaigns.
- Translational Value: Yields cells that express functional channels and transporters, enabling ligand-dependent readouts for lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains phenotypic fidelity to in vivo states, allowing observation of cell-autonomous differentiation and marker expression over two weeks.
- Operational Value: Supports longitudinal studies requiring stable cultures for time-dependent drug response profiling.
- Translational Value: Bridges discovery to preclinical work by providing a platform for target de-risking prior to mammalian model translation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, enabling early biological de-risking before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing via isolation of specific embryonic cell types and monitoring of differentiation markers.
- Screening: Delivers dissociated cells amenable to manual plating and downstream application of fluorescence- and electrode-based readouts.
- Analytics: Enables quantitative measurements of electrophysiological activity, calcium flux, and immunofluorescence intensity for condition comparison.
- Translational Research: Supports continuity from embryonic cell culture to preclinical validation by preserving neurodevelopmental relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable cell preparation workflow applicable across multiple projects targeting neuronal or developmental pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through recapitulation of in vivo-like morphology and cell-specific protein expression.
- Operational Value: Delivers standardized, contamination-controlled cultures via defined dissociation and plating steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target modulation in a physiologically contextualized system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in a genetically manipulable model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, enzymatic tissue dissociation, and sterile cell culture techniques.
- Dependent on access to chitinase, serum-enriched L15 medium, substrate-coated surfaces, and centrifugation equipment.
- Necessitates standardization of dissociation timing and plating density to ensure consistent cell yield and viability.
- Involves adaptation considerations when extending to different embryonic stages or mutant strains.
- Limited by the need for manual pipetting during dissociation, which may affect throughput without automation support.
