Name: Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-07T22:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer een decellularisatiemethode voor weefselengineering van de darm met behoud van vasculaire netwerken in ratten. Deze techniek creëert natuurlijke acellulaire matrices voor potentiele toepassingen bij darmfalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de Wake Forest Institute of Regeneratieve Geneeskunde voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. Wij erkennen ondersteuning door subsidies van het Great Ormond Street Hospital liefdadigheid, de Stichting Eugenio Litta (Genève, Zwitserland), de Medical Research Council, de Royal College of Surgeons of England, de Sparks Children&#39;s Medical Charity, het Britse ministerie van Buitenlandse Zaken voor de UK / VS Stem Cell Collaboration Award en het Fonds Mittal Research. We willen ook graag aan de Royal Society / Wolfson Foundation bedanken voor de tissue engineering laboratorium renovatie subsidie ​​verkregen voor de Pediatrische Chirurgie afdeling in het Institute of Child Health. PDC en SE worden ondersteund door het Great Ormond Street Hospital Children&#39;s Charity.

1. Isolatie van Rat Darm <ol><li> Bereid een 1 L oplossing van fosfaat gebufferde zoutoplossing (Sigma, UK) met 1% antibiotica / antimycotica (Sigma, UK) (PBS / AA). Breng de peristaltische pomp (Masterflex L / S variabele snelheid) met twee buizen. Voer 70% ethanol (EtOH) door de buizen van de peristaltische pomp gedurende 15 minuten bij maximale snelheid, gevolgd door PBS / AA nog 15 minuten. </li><li> Euthanaseren volwassen Sprague-Dawley ratten met een gewicht ongeveer 250-350 g Door CO 2 inademing en cervicale dislocatie in overeenstemming met de lokale dierlijke richtlijnen en goedkeuringen (in het Verenigd Koninkrijk, Home Office richtlijnen onder de dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act 1986). </li><li> Autoclaaf de chirurgische instrumenten worden gegeven. Spray en veeg de buik van het dier met behulp van 70% EtOH. </li><li> Voer een xifo-schaamhaar laparotomische insnijding op de buik om een ​​duidelijke chirurgische veld te waarborgen. </li><li> Eviscerate de dunne darm aan de rechterzijde van het dier op een papieren handdoek besproeid met 70% EtOH. Take zorg continu nat de darm met PBS / AA teneinde uitdroging van het weefsel en denaturatie van de extracellulaire matrix (ECM) voorkomen. </li><li> Zoek de a. mesenterica superior (SMA) afkomstig uit een hoek van 90 ° van de aorta naar de darm. Gebruik een 27 G canule aan de SMA komen vanuit de aorta en snel terugtrekken van de naald te voorkomen dat het scheurt de wand van het vat. Vooraf de plastic buis van de canule in de SMA en veilig gebruik van hechtingen (Vicryl 5/0). </li><li> Bevestig canule door het injecteren van 1 ml PBS / AA. Gebruik veer schaar om de aorta proximaal en distaal van de SMA incisie om de canule vrij. </li><li> Om lekkage van ontlasting vermijden wanneer ontleden van de dikke darm, plaats een (zijde 5/0) hechtdraad knoop op het proximale uiteinde van de ileocaecale knooppunt en een aan het distale einde van de dikke darm. Snij vervolgens het terminale ileum en colon tussen de twee knopen en verwijder de dikke darm. </li><li> Snijd de darm bij de jejuno-duodenale junctie eenND de darm van alle bindweefsel verbindingen zou kunnen hebben met de buik. </li><li> Breng de dunne darm in een petrischaal met PBS / AA. Canule het proximale deel van de darm met een plastic Pasteur pipet (LSL Laboratorium verbruiksartikelen) en zet deze vast met hechtingen. Snijd de pipet zodat het past de Luer-Lok van een spuit 60 ml (BD Plastipak). Spoel de darmlumen 2x met 60 ml PBS / AA naar uitwerpselen en vuil te verwijderen. </li></ol> 2. Decellularisatie Methodologie <ol><li> Sluit de vasculaire canule een driewegkraan. Dit zal verlichten handling, het minimaliseren van spanning op de vasculaire boom en laat het verwijderen van luchtbellen uit de slang. </li><li> Begint te lopen gedemineraliseerd water (weerstand 18.2 MQ / cm) door de Masterflex L / S variabele snelheid rollerpomp op 0,6 ml / uur. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen buis voorafgaand aan het verbinden met het darmlumen kraan zijn. Wat belletjes aanwezig in het lumen van stap1.9, die kan het van cellen ontdoen proces beïnvloeden. Varieert de snelheid van de pomp en behandelen van het weefsel met pincet voorzichtig naar de uitgang luchtbellen zorgt vanaf het distale uiteinde. Laat de vasculaire canule niet aan totdat dit proces is voltooid, aangezien hoge snelheden de vasculaire boom kan beschadigen. </li><li> Overdrachtsinrichting naar de koude ruimte, aangezien de volgende stap van ontcelling wordt uitgevoerd bij 4 ° C. De lage temperatuur maakt het verwijderen van cellen, terwijl het minimaliseren van weefsel afbraak. Plaats de petrischaal in een container die de overvloeiende oplossing zal verzamelen. Perfuseren zowel het darmlumen en de vasculaire boom met gedeïoniseerd water (resistiviteit 18,2 MQ / cm) gedurende 24 uur bij 0,6 ml / uur. Voor het eerste uur controleren het apparaat regelmatig of alles goed is aangesloten, lekkage minimaal is en geen luchtbellen aanwezig zijn in de darm zijn. </li><li> Na 24 uur behandeling met gedemineraliseerd water, bewegen decellularisatie apparaten buiten de koelruimte als de rest van de stappen zijnin kamertemperatuur (RT) uitgevoerd. </li><li> Weeg natriumdeoxycholaat (Sigma, UK) te bereiden 300 ml van een oplossing 4% in gedeïoniseerd water. Weeg natriumdesoxycholaat onder een afzuigkap, want het is een orale en irriterend voor de ogen. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. De oplossing kan worden gehandhaafd op 4 ° C gedurende 1 maand. </li><li> Verander de gedeïoniseerd oplossing voor natriumdesoxycholaat, controleer dan de aansluitingen, verwijder eventuele luchtbellen en perfuse op 0,6 ml / uur gedurende 4 uur. </li><li> Na de natriumdeoxycholaat stap wassen met PBS / AA gedurende 30 minuten om de interactie tussen de natriumdeoxycholaat en DNase-I voorkomen. </li><li> Weeg deoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) en voor te bereiden 250 ml van een 2000 kU oplossing in 1 M natriumchloride, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. Deze oplossing moet direct vóór gebruik voorbereid en kan niet worden opgeslagen. </li><li> Perfuseren met DNase-I gedurende 3 uur bij kamertemperatuur met een snelheid van 0,6 ml / uur. </li><li> Na de DNase-I stap, de overdracht van desteiger in een weefselkweek kap en platen en instrumenten veranderen. Er wordt voorgesteld om een ​​aseptische techniek te gebruiken. </li><li> Wassen met PBS / AA gedurende 30 minuten zodat alle restanten van de decellularisatie oplossingen worden verwijderd. Plaats de steiger in een nieuwe petrischaal en over te dragen aan een UV Crosslinker (Spectroline, VS). Lopen twee sterilisatiecycli. Opslaan in 5% PBS / AA en de oplossing te veranderen om de 3 dagen. </li></ol>

<ol><li>Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+bladders+for+patients+needing+cystoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty.</a> Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).</li>
<li>Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+autologous+urethras+for+patients+who+need+reconstruction%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study.</a> Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).</li>
<li>Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+transplantation+of+a+bioengineered+airway+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiov.+Surg%22%5BJournal%5D)">First human transplantation of a bioengineered airway tissue.</a> J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).</li>
<li>Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+a+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study.</a> Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multicellular+Approach+Forms+a+Significant+Amount+of+Tissue-Engineered+Small+Intestine+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+optimizes+the+formation+of+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine.</a> Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).</li>
<li>Chen, M. K., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+bowel+tissue+engineering+using+small+intestinal+submucosa+as+a+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold.</a> J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+small+intestinal+submucosa+as+a+small+bowel+graft+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model.</a> J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).</li>
<li>Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+evaluation+of+regenerated+small+bowel+by+small+intestinal+submucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa.</a> J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).</li>
<li>Hori, Y., Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+on+tissue+engineering+of+the+small+intestine+by+mesenchymal+stem+cell+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding.</a> J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).</li>
<li>Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue-engineered+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue-engineered small intestine.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1255-1261 (2003).</li>
<li>Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+matrices%2C+obtained+by+a+detergent-enzymatic+method%2C+support+in+vitro+the+adhesion+of+chondrocytes+and+tracheal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Int%22%5BJournal%5D)">Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells.</a> Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , 1-8 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., Price, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Lungs+for+in+Vivo+Implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation.</a> Science. 329 (5991), 538-541 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., Clippinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).</li>
<li>Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+lung+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for lung engineering.</a> J. Vis. Exp. (49), e2651(2011).</li>
<li>Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+decellularized+small+bowel+scaffold+that+preserves+villus-crypt+architecture+for+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration.</a> Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).</li>
<li>Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+and+stomach+form+from+autologous+tissue+in+a+preclinical+large+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model.</a> J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).</li>
<li>Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+porcine+small+intestinal+submucosa+in+intestinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration.</a> Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De moeilijkste stappen in het opzetten van dit experiment betrekken de infusen van de SMA en de oprichting en het onderhoud van de steriliteit. Cannulating de SMA bij knaagdieren zonder open te barsten de muur kan heel moeilijk zijn te wijten aan de grootte en de positie van het schip. Alternatief kan een hechting worden geplaatst rond het proximale aorta vóór de SMA oorsprong, gevolgd door een canule van de aorta zelf distaal leiding de plastic canule in de SMA. Tijdens decellularisatie een combinatie van slechte canule plaatsing en hoge stroomsnelheden kan resulteren in het verliezen van de vasculaire toegang. Steriliteit is een groot probleem vanwege de hoeveelheid bacteriële flora in de dunne darm. Wassen met PBS / AA volgende oogst is zeer belangrijk, en elk teken van fecale materie of vuil moet uit het lumen verwijderd. Het plaatsen van een deel van de steiger een falcon-buis met DMEM in de incubator volgende UV sterilisatie zou een indicator zijn als steriliteit is bereikt. Bijvan bacteriële kolonisatie, de media de pH veranderen met de kleur draaien van rood naar geel. Om dit, verder UV cycli goed aan het wassen met PBS dat een hoge concentratie van antibiotische / antimycotische. Een mogelijke wijziging van een steiger met zowel vasculaire en veneuze toegang zou kunnen verkrijgen tot de onderste vena cava (IVC) en de SMA canule. Cellen ontdoen van de veneuze en vasculaire zijden moeten intermitterend uitgevoerd gedurende drie oplossingen. Continue decellularisatie kan de haarvaten barsten doordat positieve druk aan beide zijden. Door de jaren heen een aantal inspanningen darm TE met andere cel-steiger combinaties in vitro en in vivo 6,9,12 zijn. Het meeste werk werd uitgevoerd gebruikmakend van buisvormige geweven 95% PGA-5% PLGA steigers bekleed met collageen type I 6,7,13,22. Na enten met intestinaleepitheliale organoïde eenheden (OU) en gedurende implantatie in het omentum van muizen, vormen ze cysten met spier aan de buitenkant en aan de binnenkant epitheel die vervolgens kunnen worden tubularized. Echter, de porositeit en eenvoud in het ontwerp van deze scaffolds niet toe voor het genereren van grote stukken kunstmatige darm in een in vitro omgeving zoals een bioreactor. Bovendien, het ontbreken van een aangeboren vasculaire netwerk dat verder kan worden aangesloten op de ontvanger beperkt het gebruik van deze matrix voor klinische toepassing. Naast de experimenten met de PGA-PLGA steigers, hebben andere groepen collageen of SIS steigers, die beide niet de complexiteit van het darmkanaal repliceren gebruikt. SIS in het bijzonder is de enige eerdere gepubliceerde methodologie van darmweefsel engineering en is gebruikt in meer dan 150 medische instellingen, op het aantonen dat gedecellulariseerde steigers mechanische stabiliteit en de celgroei te bevorderen, terwijl looding geen immunogene respons. Echter, het ontbreken van passende macro-en micro-architectuur, heeft geleid tot slechte resultaten in haar &#39;gebruik voor intestinale TE doeleinden 9-11,23. De voordelen van de decellularisatie methodiek die we hebben beschreven omvatten het behoud van microscopische kenmerken, zoals de luminale crypte-villus architectuur die een passende omgeving voor de herbevolking vertegenwoordigen door de intestinale stamcellen. In Macroscopisch gezien is de aanwezigheid van een hiërarchische vasculaire netwerk bevestiging aan de ontvanger te schakelen en levering van voedingsstoffen en zuurstof naar alle lagen van de TE-darm 21. Bovendien, het onderhoud van ECM componenten zoals collageen, elastine en glyocosaminoglycans een belangrijke rol niet alleen mechanische eigenschappen maar ook de leiding cellulaire proliferatie en differentiatie. Het belangrijkste is de mogelijkheid van de ontcellen methode worden opgeschaald tot groter weefsels behoud van dezelfde kenmerken is een belangrijke eigenschap voor klinische vertaling van TE. De ontwikkeling van een natuurlijke darm matrix met een vasculair netwerk maakt het mogelijk grotere segmenten kunstmatige darm die kunnen worden verbonden met de host.

Tissue engineering (TE) biedt een therapeutisch alternatief voor orgaantransplantatie, het omzeilen van problemen van immunosuppressie en tekort aan organen. TE heeft onlangs succesvolle toepassingen in de kliniek, met vervanging van organen zoals de blaas 1, urethra 2 luchtpijp, zowel bij volwassenen en kinderen 3,4 5. Het bouwen van een weefselmanipulatie orgaan vereist de combinatie van een steiger met de geschikte cellen. Een steiger kan worden bereid met behulp van natuurlijke afgeleide (bijvoorbeeld collageen) en synthetische (bijvoorbeeld poly-L-glycolzuur, PLGA) materialen, of worden verkregen door de cellen ontdoen van natief organen en weefsels. Stellingen die tot nu toe zijn gebruikt voor intestinale TE zijn voornamelijk ofwel cellen ontdane (dunne darm submucosa) of synthetische (poly-L-glycolzuur en poly-melkzuur) 6-13. Deze biomaterialen zijn zeer eenvoudig in zowel macro-als micro-architectuur, diemisschien niet ideaal als tissue-engineered darm is te klinisch worden vertaald. Een optimale biomateriaal voor de darm moet een aangeboren vasculaire boom die kan worden aangesloten bloedtoevoer van de gastheer, een gelaagde buisvormige wand met verschillende eigenschappen om de lagen van de darmwand weerspiegelen en villus-crypte as aan de luminale zijde steun met zijn herbevolking door epitheliale stamcellen. Decellularisatie is een nieuwe methodologie die steigers produceert door het verwijderen van cellen uit hele organen met behoud van de oorspronkelijke architectuur 14. Dit de voorkeur bestaande steigers omdat zij niet alleen repliceren de structuur van het orgaan, maar bevatten ook chemische signalen ingebed in de extracellulaire matrix (ECM) dat steun cellulaire proliferatie en differentiatie. In 2008 werd een cadaveric luchtpijp ontceld 14, bezaaid met de eigen cellen van de patiënt, en getransplanteerd naar de belangrijkste links bronchus vervangen in een jonge man <sup&gt; 3. Sindsdien is een aantal groepen hebben gemeld de productie van cellen ontdane scaffolds voor het hart 15, 16,17 lever en longen 18-20 in kleine en grote dieren. We hebben ook aangepast dezelfde methode om een dunne darm gedecellulariseerde steiger 21 te produceren. Het doel van de hierin beschreven werkwijze is intestinale cellen ontdane matrices die de macroscopische eigenschappen van het oorspronkelijke weefsel zoals de bloedtoevoer, en de microscopische structuur van het villus crypt-as in de darmlumen handhaven produceren. Wij geloven dat deze methode kan uiteindelijk voor andere organen worden genomen om de efficiëntie van decellularisatie verbeteren.

<table><tbody><tr><td>Ethanol oplossing, 70% in H20</td><td>Sigma</td><td>02877</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing tabletten</td><td>Sigma</td><td>79382</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum Antimycotisch Oplossing (100x)</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Natrium deoxycholaat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Orale en oogirritatie; gebruik bescherming</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease I uit runderpancreas</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr></tbody></table>

een decellularisatie methode voor de productie van een natuurlijke acellular intestinale matrix

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Succesvolle tissue engineering van de combinatie van steigers met geschikte cellen in vitro of in vivo. Steigers mogen synthetische, natuurlijke weg verkregen of afkomstig van weefsels / organen zijn. Deze zijn verkregen met gebruikmaking van een techniek genaamd ontcelling. Decellularisatie kan een combinatie van fysische, chemische en enzymatische methoden omvatten. Het doel van deze techniek is om cellulaire resten behoud van de macro-en micro-architectuur van het oorspronkelijke weefsel te verwijderen. Darmweefsel techniek heeft tot nu toe gebruikt relatief eenvoudige steigers die niet de complexe architectuur van de inheemse orgel niet repliceren. De focus van deze paper is om een ​​efficiënte decellularisatie techniek voor rat dunne darm te beschrijven. De isolatie van de dunne darm om de instandhouding van een vasculair verbinding te verzekeren wordt beschreven. De combinatie van chemische en enzymatische oplossingen om de cellen te verwijderen whilst behoud van de villus-crypte as in de luminale aspect van de steiger wordt ook uiteengezet. Ten slotte wordt de beoordeling van geproduceerd steigers voor passende kenmerken besproken.

Na succesvolle decellularisatie (figuur 1), dient de steiger macroscopische uiterlijk vergelijkbaar met die van de natieve darm, maar met doorzichtige wanden (Figuur 2A). Het behoud van macro-architectuur moet ook duidelijk zijn door de doorgankelijkheid van de vasculaire boom. Als kleurstof wordt geïnjecteerd door de SMA canule moet verdelen gedurende de steiger en de capillaire structuur (figuur 2B) te bereiken. De steiger moet vrij van nucleaire en cytoplasmatische materiaal, iets dat kan worden beoordeeld met behulp van een DNA-kwantificering kit en eenvoudige histologische analyse. Hematoxyline en eosinekleuring (H &amp; E) moet een afwezigheid van nucleaire en cytoplasmatische materiaal tonen met behoud van de dunne darm lagen (figuur 3A). Met name moet de handhaving van de villi en crypten aan de luminale kant blijken volgende scanning elektronenmicroscoop (Figuur 4). Eenbehoud van extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen, elastine en glycosaminoglycanen moeten worden verwacht. Bijvoorbeeld, Masson trichroomkleuring weergeven intact bindweefsel in de steiger (Figuur 3B). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. . Proefopzet Tijdlijn van decellularisatie procedure; PBS / AA: fosfaat gebufferde zoutoplossing met antibiotica-antimycotica, NaDeoxy: Natriumdeoxycholaat, RT: kamertemperatuur, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig2.jpg" width="600px" /> Figuur 2. Steiger macroscopic kenmerken. Macroscopische verschijning van de dunne darm van ratten na succesvolle ontcelling (A). Injectie van Rosso ponceau kleurstof door de SMA toont een intacte vasculaire netwerk (B); SMA: a. mesenterica superior <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig3.jpg" width="600px" /> Figuur 3. . Histologie H &amp; E (A) en MT (B) vlekken geven een afwezigheid van cellulair materiaal met behoud van het bindweefsel architectuur, H &amp; E: hematoxyline en eosine, MT: Masson trichroomkleuring. Schaalbalk:. 100 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . </p&gt; <img alt="Figuur 4" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50658/50658fig4.jpg" width="600px" /> Figuur 4. . Electron Microscopy Scanning elektronenmicroscopie geeft de bewaarde villus-crypt architectuur in het schavot lumen; Schaalbalk:. 100 pm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50658/50658fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.

Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een natuurlijk acellulair steigerwerk voor weefselkweek van de darm. Dit wordt bereikt door eerst de arteria mesenterica superior (SMA) van een rat te canuleren en de dunne darm samen met de vasculaire toegang te oogsten. In de tweede stap wordt het intraluminale debris weggespoeld en worden de intraluminale en vasculaire canules aangesloten op een peristaltische pomp.Vervolgens wordt de dunne darm gedurende 24 uur bij vier graden Celsius geperfuseerd met gedeïoniseerd water. In de laatste stap wordt de dunne darm bij kamertemperatuur geperfuseerd met natriumdeoxycoalaat en DNase. Uiteindelijk kunnen de volledige decellularisatie van de dunne darm, evenals de architectuur en componenten hiervan, respectievelijk worden gevisualiseerd via histologie en elektronenmicroscopie.We worden momenteel geconfronteerd met het klinische probleem van darmintelectie, een verwoestende aandoening die zowel kinderen als volwassenen treft. Enterale voeding en conventionele transplantatie bieden geen volledige genezing. De productie van een driedimensionale gevasculariseerde darmsteiger, zoals gedemonstreerd in de volgende video, draagt bij aan de therapie voor darmintelectie.Wat opmerkelijk is aan deze techniek, is dat het gebruik van milde chemicaliën voor digitalisering de intestinale microarchitectuur behoudt, zoals blijkt uit de resultaten van de elektronenmicroscoop. Bovendien maakt het behoud van het hiërarchische vasculaire netwerk na de decellularisatie het mogelijk om een structuur te zaaien die opnieuw kan worden aangesloten op de gastheer. Bloedtoevoer: Begin met het monteren van twee slangetjes in een peristaltische pomp, laat vervolgens gedurende 15 minuten bij maximale snelheid 70% ethanol door de slangetjes van de peristaltische pomp lopen, gevolgd door vers bereide PBS AA gedurende nogmaals 15 minuten.Nadat de pompspray is doorgespoeld, dient de buik van een geëuthanaseerde spra dolly rat van 250 tot 350 gram te worden afgeveegd met 70%ethanol. Voer vervolgens met in de autoclaaf gesteriliseerde chirurgische instrumenten een XO-pubische laparotomie-incisie uit op de buik om een schoon operatieveld te verkrijgen en eviscereer de dunne darm naar de rechterzijde van het dier op een met 70%ethanol besproeid papieren handdoekje. Zorg ervoor dat de darm continu nat wordt gehouden met P-B-S-A-A om dehydratie van het weefsel en denaturatie van de extracellulaire matrix te voorkomen.Zoek vervolgens de SMA op, die in een hoek van 90 graden vanuit de aorta richting de darm loopt. Plaats een hechtdraad rond de SMA en maak een knoop klaar. Gebruik een canule van 27 gauge om de SMA vanuit de aorta te penetreren en trek de naald vervolgens snel terug om scheuren in de wand van het vat te voorkomen.Schuif nu de plastic buis van de canule in de SMA en zet de slang vast met Vicryl 5-0 hechtingen, en injecteer vervolgens 10 milliliters PBSAA om de canulatie te bevestigen. Gebruik daarna een schaar om de aorta proximaal en distaal van de SMA in te snijden om de canule vrij te maken; dit voorkomt het lekken van feces bij het dissecteren van de dikke darm. Plaats één zijden 5-0 hechtnuut op het proximale uiteinde van de ileocecale overgang en één op het distale uiteinde van het colon sigmoideum. Snijd vervolgens het terminale ileum en het colon tussen de twee knopen door en verwijder de dikke darm.Snijd nu de dunne darm door bij de junctie van het duodenum en maak de darm vrij van eventuele bindweefselverbindingen met de buikholte. Breng de dunne darm over naar een Petrischaal met PBS aa. Gebruik vervolgens een plastic posterior pipet om het proximale deel van de darm te canuleren en zet deze op zijn plaats vast met hechtingen.Snijd tenslotte de pipet af zodat deze in de luer-lock van een spuit van 60 milliliter past, en spoel vervolgens het lumen van de darm twee keer schoon met 60 milliliters PBS-A-A om alle feces en resten te verwijderen. Controleer voor aanvang van het decellularisatieproces of er geen luchtbellen aanwezig zijn in het lumen van de darm en de vasculaire canulen. Sluit vervolgens een driewegkraan aan op de vasculaire canule en plaats de Petrischaal in een opvangbak om eventuele overloop van de oplossing op te vangen. Start daarna het pompen van gedeïoniseerd water via de masterflex LS variabele snelheidsrollerpomp bij 0,6 milliliter per uur.Hanteer het weefsel voorzichtig om ervoor te zorgen dat de luchtbellen via het distale uiteinde ontsnappen. Zodra alle luchtbellen uit de canules zijn verwijderd, wordt de opstelling naar de koelruimte overgebracht. Start vervolgens het decellularisatieproces door zowel het darmlumen als de vaatboom 24 uur lang te perfunderen met stromend gedeïoniseerd water, waarbij de stroomsnelheid tijdens het eerste uur 0,6 milliliters per uur bedraagt.Controleer de apparatuur regelmatig om er zeker van te zijn dat alle verbindingen stevig vastzitten. De lekkage is minimaal en er zijn geen bellen aanwezig in de darm. Plaats na 24 uur de decellularisatie-apparatuur terug op kamertemperatuur.De kleur van de darm zou onder een zuigkap moeten zijn veranderd in lichtroze. Weeg voldoende natriumdeoxycholaat af om een 4% oplossing te maken in 300 milliliter gedeïoniseerd water. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen tot deze helder is.Vervang nu de gedeïoniseerde oplossing door het natriumdeoxycholaat. Controleer de aansluitingen. Verwijder eventuele luchtbellen en perfuseer de dunne darm gedurende vier uur met een snelheid van 0,6 milliliters per uur.Na de stap met natriumdeoxycholaat wordt het weefsel transparant. Het behoud van het vasculaire netwerk wordt ook zichtbaar na het toevoegen van PBS AA aan de pomp. Was de darm 30 seconden met PBS AA om interacties tussen het natriumdeoxycholaat en het DNA te voorkomen.Perfuse vervolgens het weefsel met vers bereide DNAs, één op kamertemperatuur met een snelheid van 0,6 milliliters per uur. Breng het steigerwerk na drie uur over naar een weefselkweekkap en vervang, met gebruik van een aseptische techniek, de plaat. Steriliseer de slang van de peristaltische pomp opnieuw door er ethanol doorheen te laten lopen.Was de darm voor de laatste maal gedurende 30 minuten met P-B-S-A-A om er zeker van te zijn dat alle resten van de decellularisatie-oplossingen zijn verwijderd. Plaats de scaffold vervolgens in een UV-crosslinker en voer twee sterilisatiecycli uit. Bewaar de scaffold daarna in P-B-S-A-A.Vervang de oplossing elke drie dagen. Na een succesvolle decellularisatie moet het steunmateriaal een macroscopisch uiterlijk hebben dat vergelijkbaar is met dat van de natuurlijke darm, maar met doorschijnende wanden. Het behoud van de macroarchitectuur moet tevens duidelijk zijn uit de openheid van de vasculaire boom.Wanneer kleurstof via de SMA-cannule wordt geïnjecteerd, moet deze gelijkmatig door het steunstructuur verspreiden en de capillaire boom bereiken. De steunstructuur moet vrij zijn van nucleair en cytoplasmatisch materiaal, wat beoordeeld kan worden. Met behulp van een DNA-kwantificatiekit en eenvoudige histologische analyse, waarbij hematoxyline- en eosinekleuring wordt toegepast, moet de afwezigheid van nucleair en cytoplasmatisch materiaal worden aangetoond, terwijl de lagen van de dunne darm behouden blijven, zoals gedemonstreerd in deze afbeelding.In het bijzonder moet het behoud van de villi en crypten aan de luminale zijde zichtbaar zijn na scanning-elektronenmicroscopie. Verdere conservering van de componenten van de extracellulaire matrix, zoals collageen, elastine en glycosaminoglycanen, dient ook verwacht te worden, zoals hier wordt getoond. Masson-trichroomkleuring maakt bijvoorbeeld de demonstratie van het intacte bindweefsel in het scaffold mogelijk.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het natuurlijke cellulaire darmsteiger kunt creëren.

a-decellularization-methodology-for-production-natural-acellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Werkwijzen voor het bereiden een injecteerbare gel matrix van gedecellulariseerde weefsel en het injecteren van het in rat...

Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering

Het weefsel-specifieke extracellulaire matrix (ECM) is een sleutelmediator van celfunctie. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor het synthetiseren van zuiver ECM afgeleide schuimen en microdragers die stabiel in cultuur zonder de noodzaak voor chemische verknoping voor toepassingen in geavanceerde 3D in vitro celkweekmodellen of pro-regeneratieve bioscaffolds.

Fabricage van extracellulaire matrix-afgeleide schuimen en microdragers Weefsel-specifieke Cell Cultuur en Delivery Platforms

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Decellularized kraakbeen afkomstige steigers kunnen worden gebruikt als een steiger aan gids kraakbeen reparatie en als een middel om te regenereren osteochondraal weefsel. Deze paper beschrijft het proces van de decellularization in detail en biedt suggesties voor deze steigers in in vitro-instellingen.

Fabricage van Decellularized kraakbeen afkomstige Matrix steigers

Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.

Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

Het doel van dit protocol is productie van hele extracellulaire matrix vezels die voor reparatie van de wond wordt gericht die geschikt voor preklinische evaluatie als onderdeel van een regeneratieve steiger implantaat zijn. Deze vezels worden geproduceerd door de cultuur van fibroblasten op holle vezel membranen en geëxtraheerd door ontbinding van de membranen.

Productie van extracellulaire Matrix vezels via cultuur van de cel van de membraan van opofferende holle vezel

Decellularized extracellulaire matrix (dECM) kan geschikte micro-omgevings aanwijzingen bieden om de inherente functies van doelweefsels in een Engineered constructie te recapituleren. Dit artikel verheldeert de protocollen voor de decellularisatie van pancreas weefsel, evaluatie van decm bioink van de alvleesklier weefsel, en generatie van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een bioprinten techniek.

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

Dit protocol heeft tot doel het hart en de longen van muizen te decellulariseren. De resulterende extracellulaire matrix (ECM) steigers kunnen immunos gekleurd en afgebeeld worden om de locatie en topologie van hun componenten in kaart te brengen.

Decellularisatie van het Murine Cardiopulmonaal Complex

In dit werk werd een decellularisatieprotocol geoptimaliseerd om gedecellulariseerde matrices van foetale skeletspieren van muizen te verkrijgen. C2C12-myoblasten kunnen deze matrices koloniseren, prolifereren en differentiëren. Dit in vitro model kan worden gebruikt om celgedrag te bestuderen in de context van skeletspierziekten zoals spierdystrofieën.

Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek

Perfusie decellularisatie is een nieuwe techniek om hele lever scaffolds dat het orgel van de extracellulaire matrix samenstelling en microarchitectuur behoudt produceren. Hierin wordt de werkwijze voor het bereiden gehele orgel steigers met behulp van perfusie decellularisatie en de daaropvolgende herstel van de populatie met hepatocyten beschreven. Functionele en transplanteerbare lever enten kan worden gegenereerd met behulp van deze techniek.

Decellularisatie en Recellularization van Whole Levers

Leer een decellularisatiemethode voor weefselengineering van de darm met behoud van vasculaire netwerken in ratten. Deze techniek creëert natuurlijke acellulaire matrices voor potentiele toepassingen bij darmfalen.

Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix

Meer video's verkennen