Een Decellularisatie Methode voor de productie van een natuurlijke Acellular Intestinale Matrix
7 oktober 2013
Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.
Het algemene doel van deze procedure is om een natuurlijk acellulair schaalmodel te creëren voor weefselengineering van het darmweefsel. Dit wordt bereikt door eerst canuleringen uit te voeren op een superieure mesenteriale ader of SMA bij een rat en vervolgens de dunne darm samen met de vasculaire toegang te verwijderen. In de tweede stap wordt het intraluminale vuil weggespoeld en worden de intraluminale en vasculaire canules aangesloten op een peristaltiekpomp.
Vervolgens wordt de dunne darm gedurende 24 uur bij vier graden Celsius geperfundeerd met gedeïoniseerd water. In de laatste stap wordt de dunne darm geperfundeerd met natriumdeoxy, coate en DNA's bij kamertemperatuur. Uiteindelijk kan de volledige decellularisatie van de dunne darm, evenals de architectuur en componenten ervan, worden gevisualiseerd door middel van histologie en elektronenmicroscopie.
We worden momenteel geconfronteerd met het klinische probleem van intestinale insufficiëntie, een verwoestende aandoening die zowel kinderen als volwassenen treft. Parenterale voeding en conventionele transplantatie bieden geen volledige genezing. De productie van een driedimensionaal gevasculariseerd darmweefsel schaalmodel, zoals aangetoond in de volgende video, biedt een nieuwe aanpak voor de behandeling van intestinale insufficiëntie.
Wat opmerkelijk is aan deze techniek is dat het gebruik van zachte digitaliseringschemie de darmmicro-architectuur behoudt, zoals blijkt uit de resultaten van de elektronenmicroscoop. Bovendien maakt het behoud van het hiërarchische vasculaire netwerk na de civilisatie het mogelijk om een structuur te zaaien die opnieuw kan worden aangesloten op de gastheer. Bloedtoevoer Begin met het plaatsen van een peristaltiekpomp met twee buizen, voer vervolgens 70% ethanol door de buizen van de peristaltiekpomp gedurende 15 minuten op maximale snelheid, gevolgd door vers bereid PBS AA gedurende nog eens 15 minuten.
Na het spoelen van de pomp, spuit en veeg het buikgedeelte van een geëuthanaseerd 250 tot 350 gram sprandolly-rat met 70% ethanol. Gebruik vervolgens gesteriliseerde chirurgische instrumenten, voer een XO-pubische laparotomie-incisie uit op de buik om een duidelijk chirurgisch veld te garanderen, verwijder de dunne darm naar de rechterkant van het dier op een papieren handdoek besprenkeld met 70% ethanol. Zorg ervoor om de darm continu nat te houden met P-B-S-A-A om uitdroging van het weefsel en denaturatie van de extracellulaire matrix te voorkomen.
Loceer vervolgens de SMA, die onder een hoek van 90 graden van de aorta naar de darm loopt. Plaats een hechtdraad rond de SMA en maak een knoop. Gebruik een 27 gauge canule om de SMA vanuit de aorta te betreden en trek vervolgens snel de naald terug om scheurvorming van de vaatwand te voorkomen.
Breng nu de plastic buis van de canule in de SMA, bevestig de buis met Vicryl vijf-oh hechtdraad en injecteer vervolgens 10 milliliter P-B-S-A-A om de canuleringen te bevestigen. Gebruik vervolgens een schaar om de aorta proximaal en distaal van de SMA in te snijden om de canule los te maken om lek van uitwerpselen te voorkomen bij het uitnemen van de dikke darm, plaats een zijden vijf-oh hechtdraadknoop op het proximale uiteinde van de ileocecale junctie en een op het distale uiteinde van de sigmoïde colon. Snijd vervolgens het terminale ileum en de colon tussen de twee knopen en verwijder de dikke darm.
Snijd nu de dunne darm bij de Juno-duodenale junctie en bevrijd de darm van eventuele bindweefselverbindingen met de buik. Breng de dunne darm over in een petrischaal met PBS aa. Gebruik vervolgens een plastic achterste pipet om het proximale deel van de darm te canuleren en zet het op zijn plaats met hechtingen.
Snijd ten slotte de pipet af zodat deze past in de lure lock van een 60 milliliter spuit en spoel vervolgens het darmlumen met twee spoelingen van 60 milliliter P-B-S-A-A om eventuele uitwerpselen en vuil te verwijderen. Voordat u begint met het decellularisatieproces, moet u ervoor zorgen dat er geen luchtbelletjes aanwezig zijn in het darmlumen en de vasculaire canules. Vervolgens verbindt u een drieweg stopkraan met de vasculaire canule en plaatst u de petrischaal in een container om eventuele overstromende oplossing op te vangen. Start vervolgens met het doorlaten van gedeïoniseerd water door de Master Flex LS variabele snelheidsrolpomp bij 0,6 milliliter per uur.
Ga voorzichtig om met het weefsel om ervoor te zorgen dat de luchtbelletjes uit het distale uiteinde komen. Zodra alle luchtbelletjes uit de canules zijn verwijderd, brengt u het apparaat over naar de koude kamer. Start vervolgens het decellularisatieproces door zowel het darmlumen als het vasculaire netwerk te perfunderen met stromend gedeïoniseerd water gedurende 24 uur bij 0,6 milliliter per uur gedurende de eerste uur.
Controleer het apparaat regelmatig om ervoor te zorgen dat alle verbindingen stevig zitten. De lekkage is minimaal en er zijn geen luchtbelletjes in de darm aanwezig. Na 24 uur brengt u het decellularisatieapparaat terug naar kamertemperatuur.
De kleur van de darm zou moeten zijn veranderd in een lichtroze onder een zuigkap. Weeg voldoende natriumdeoxy coate om een 4%oplossing te maken in 300 milliliter gedeïoniseerd water. Gebruik een vortex om de oplossing te mengen totdat deze helder is.
Vervang nu de gedeïoniseerde oplossing met natriumdeoxycollaat. Controleer de verbindingen. Verwijder eventuele luchtbelletjes en perfundeer de dunne darm gedurende vier uur bij 0,6 milliliter per uur.
Na de natriumdeoxycollaat stap wordt het weefsel transparant. Het behoud van het vasculaire netwerk wordt ook duidelijk na het toevoegen van PBS AA aan de pomp. Spoel de darm 30 minuten met PBS AA om eventuele interacties tussen het natriumdeoxy, coate en DNA een te voorkomen.
Perfundeer vervolgens het weefsel met vers bereid DNA's, een bij kamertemperatuur en een snelheid van 0,6 milliliter per uur. Na drie uur brengt u het scha
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het creëren van een acellulaire matrix uit rattendarmen, wat essentieel is voor toepassingen in tissue engineering en geneesmiddelentesten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Tissue engineering
- Stamcelbiologie
- Medicijnonderzoek
Achtergrond
- Darmfalen is een kritieke aandoening die zowel kinderen als volwassenen treft.
- Conventionele behandelingen zoals parenterale voeding en transplantatie schieten vaak tekort.
- De ontwikkeling van een driedimensionale gevasculariseerde darmsteunstructuur zou nieuwe therapeutische opties kunnen bieden.
- Het behoud van de intestinale microarchitectuur is essentieel voor de functionaliteit van de steunstructuur.
Doel van de studie
- Om een natuurlijk acellulair steunstructuur (scaffold) te ontwikkelen voor darmweefselengineering.
- Om het decellularisatieproces en de architectuur van de steunstructuur te visualiseren.
- Om een oplossing te bieden voor het klinische probleem van darmfalen.
Gebruikte methoden
- Cannulatie van de arteria mesenterica superior van de rat voor het oogsten van de dunne darm.
- Perfusie van de darm met gedeïoniseerd water en natriumdeoxycholaat.
- Histologische en elektronenmicroscopische analyse om de decellularisatie te beoordelen.
- Behoud van het vasculaire netwerk tijdens het decellularisatieproces.
Belangrijkste resultaten
- Het decellularisatieproces heeft de architectuur van de darm succesvol behouden.
- Het vasculaire netwerk bleef intact, wat potentiële revascularisatie mogelijk maakt.
- Histologische analyse bevestigde de volledige verwijdering van cellulaire componenten.
- Het scaffold vertoonde een macroscopisch uiterlijk dat vergelijkbaar was met dat van de natuurlijke darm.
Conclusies
- De ontwikkelde methodologie biedt een veelbelovende aanpak voor het creëren van intestinale scaffolds.
- Deze techniek kan toekomstige therapieën voor darmfalen verbeteren.
- Verder onderzoek is nodig om de functionele integratie van deze scaffolds in vivo te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het creëren van een gevasculariseerd acellulair darmscaffold vult een kritisch gat in het modelleren van darminfarcering en het evalueren van regeneratieve therapieën. Deze decellularisatiemethode behoudt de villus-crypt-as en de architectuur van de extracellulaire matrix, waardoor meer voorspellende preklinische beoordelingen van de integratie en functie van het scaffold mogelijk zijn. Door een open vasculair netwerk te behouden, ondersteunt deze benadering potentiële revascularisatiestrategieën, wat de mechanistische ambiguïteit in vroegstadiumprogramma's voor intestinal tissue engineering vermindert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar interacties tussen gastheer en steunstructuur en signalering van de extracellulaire matrix mogelijk in een fysiologisch relevante intestinale micro-omgeving.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar, gedecellulariseerd weefselmodel voor het beoordelen van de compatibiliteit van biomaterialen en cellulaire infiltratie zonder storende immuunvariabelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd steigerwerk met behouden microarchitectuur voor het evalueren van de efficiëntie van celzaaien, migratie en differentiatie onder gecontroleerde perfusiecondities.
- Operationele waarde: Ondersteunt de schaalbaarheid van assays door consistente productie van steigerwerken via vasculaire canulatie en perfusie, wat high-content screening van therapeutische kandidaten faciliteert.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt ziekterelevante structurele aanwijzingen (villus-crypt-as, collageen, elastine, glycosaminoglycanen) die voorspellende modellering van scaffold-remodellering en integratie in vivo ondersteunen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beoordeling van vasculaire doorgankelijkheid en stabiliteit van de extracellulaire matrix mogelijk, wat cruciaal is voor het verminderen van risico's bij beslissingen over verdere voortgang in programma's voor regeneratieve geneeskunde van de darm.
Pipeline- & Workflowintegratie
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door een gekarakteriseerde acellulaire steunstructuur te bieden die hypothesetoetsing in intestinale weefseltechnologie ondersteunt, de gereedheid van assays voor studies naar cellulair gedrag bevordert en translationele continuïteit waarborgt door behoud van de architectuur en het vasculaire netwerk.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetests van extracellulaire matrix-afhankelijke routes en cellulaire responsen in een darmmicro-omgeving die vergelijkbaar is met de natuurlijke situatie.
- Screening: Levert assay-klare scaffolds met een reproduceerbare microstructuur en vasculaire perfusiecapaciteit voor gestandaardiseerde cellulaire evaluatie.
- Analytiek: Maakt kwantitatieve beoordeling van de decellularisatie-efficiëntie mogelijk via DNA-kwantificering, histologie en elektronenmicroscopie om de zuiverheid en structurele integriteit van de scaffold te bevestigen.
- Translationeel onderzoek: Behoudt darm-specifieke componenten van de extracellulaire matrix en de vasculaire architectuur, wat de preklinische validatie van scaffold-integratie en remodeling door de gastheer ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een schaalbaar, op perfusie gebaseerd decellularisatieplatform dat toepasbaar is op meerdere weefseltypes, waardoor de inspanning voor herontwikkeling in orgaan-specifieke scaffoldprogramma's wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid door de intestinale microarchitectuur en de samenstelling van de extracellulaire matrix te behouden, waardoor fout-negatieven in preklinische beoordelingen van de effectiviteit worden verminderd.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde perfusieparameters en concentraties van decellularisatie-reagentia, waardoor variabiliteit tussen batches wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door het leveren van gevasculariseerde scaffolds die de in vivo integratie en functionele uitkomsten beter voorspellen.
- Portfolio-impact: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor intestinale regeneratie mogelijk via gevalideerde scaffoldmodellen die biologisch attritie in een laat stadium verminderen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microsurgische vasculaire canulatie en de inrichting van perfusiesystemen om de integriteit van het scaffold tijdens de decellularisatie te behouden.
- Afhankelijk van toegang tot peristaltische pompen, steriele slangen en gecontroleerde temperatuuromgevingen (4°C en kamertemperatuur) voor de opeenvolgende perfusiestappen.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor de bereiding van reagentia (bijv. 4% natriumdeoxycholaat, DNAse) en kwaliteitscontrole om een volledige verwijdering van cellen te garanderen zonder schade aan de matrix.
- Vereist aanpassing van de perfusiedruk en timing bij opschaling naar grotere darmsegmenten of verschillende soorten, waarbij de villus-crypt architectuur behouden moet blijven.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor nauwkeurige verwijdering van luchtbellen tijdens de perfusie om vasculaire schade te voorkomen en een uniforme decellularisatie in het gehele scaffold te waarborgen.
