Name: Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor het genereren van recombinant arenavirus in FDA-goedgekeurde Vero-cellen voor vaccinontwikkeling. Dit protocol omvat plasmide-transfectie en virusrescue-bevestiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken heden en verleden leden in JCT en LM-S laboratoria voor de ontwikkeling en verbetering van de arenavirus reverse genetics technieken en plasmiden. We danken ook Snezhana Dimitrova voor technische ondersteuning. Het monoklonaal antilichaam gericht om JUNV NP (SA02-BG12) werd verkregen van BEI Resources (NIAID Biodefense en opkomende infecties Research Resources Repository). BYHC werd ondersteund door Grant Number GM068411 van Institutionele Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is een Fulbright-Conicyt (BIO 2008) en een Rochester Vaccin Fellowship (2012) ontvanger. EO-R huidige ondersteuning wordt geleverd door een postdoctorale Fellowship voor Diversiteit &amp; Academic Excellence van het Bureau voor Faculty Development &amp; Diversiteit aan de Universiteit van Rochester. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidie ​​RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), enDe Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C). Onderzoek bij JCT laboratorium werd ondersteund door subsidies RO1 AI047140, RO1 AI077719 en RO1 AI079665 van NIH.

1. Arenavirus Rescue Transfection Ons rescue was gebaseerd op het gebruik van zowel polymerase II eiwit expressieplasmiden die coderen voor de nucleoproteïne (NP) en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L), de virale trans-werkende factoren nodig zijn voor RNA-replicatie en genexpressie van de arenavirus genoom 7, 19 en plasmiden staat om directe intracellulaire synthese, via het cellulair RNA-polymerase I (pol-I), van de S en L antigenoom RNA species 7. In onze studies gebruiken we de pCAGGS eiwitexpressie plasmide, dat de kip β-actine promoter en polyadenylanation (pA) signaalsequenties gebruikt en de menselijke pol I-plasmide, dat het menselijke polymerase I promotor gebruikt en murine terminatorsequenties (figuur 2) . De S en L RNA segmenten worden gekloneerd in het plasmide HPOL-I in een antigenome oriëntatie om voor het genereren van genomische RNA segmenten bij transcriptie bij HPOL-I. Voor de redding van wild-type recombinant LCMV (rLCMV) en Candid # 1 (rCandid nr. 1) de pCAGGS NP en L van elk virus gecotransfecteerd met hun respectievelijke humane pol I-S en L RNA segmenten (Figuur 3). Generatie van recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid nr. 1) was dezelfde protocol maar de S segment werd opgesplitst in twee verschillende pol-I S plasmiden, coderen elk een onderscheidende reportergen: in een, de NP open reading frame (ORF) werd vervangen door het Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gen (HPOL-I S GFP / GP) en, in de andere, de virale glycoproteïne precursor (GPC) ORF wordt vervangen Gaussia luciferase (Gluc) reportergen (HPOL-I S NP / Gluc). Een schematische weergave van het protocol is geïllustreerd in figuur 4. De volgende transfectie en infectie-protocol is vastgesteld voor 6-well-platen. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mengsel: Bereid 250 ul OptiMEM media en, afhankelijkhet virus te redden, 10-12 ug LPF2000 (1 ug / ul) per transfectie (tabel 1). Een verhouding van 2,5 ug LPF2000 per ug DNA wordt aanbevolen. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen het plasmide transfectie mengsel in een aparte microcentrifugebuis (stap 1.2). </li><li> Plasmide-DNA transfectie mengsel: Bereid de plasmide transfectie cocktail in een microcentrifugebuis met de aanbevolen hoeveelheden voor elk virus rescue (zie tabel 1). Breng het uiteindelijke volume tot 50 pi met OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel Voeg 250 ul van de OptiMEM-LPF2000 mengsel (stap 1.1) in het plasmide DNA transfectie mengsel (stap 1.2). Incubeer het mengsel gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur. Ondertussen bereiden en tel 1 x 10 6 Vero-cellen per transfectie reactie. Vero-cellen worden getransfecteerd in suspensie. </li><li> Bereiding van Vero cellen: Vero cells worden gekweekt in 100 mm gerechten. Breng alvorens te beginnen de 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media, en trypsine-EDTA mengsel tot 37 ° C. <ol><li> Was de cellen tweemaal met 5 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize cellen met 1 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen detach (ca. 5 min). Zacht tikken misschien nodig om volledig te verwijderen van de cellen van de gerechten. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1000 rpm in een centrifuge. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS en 1% PS tellen van de cellen met een hemocytometer en concentratie passen aan 1 x 10 6 cellen / ml. Er werd waargenomen dat 0,5-1 x 10 6 cellen per transfectie Vero de beste resultaten. </li></ol></li><li> Meng LPF2000/DNA en cellen: Na 20 - 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur (stap 1.3), voeg 1 ml van Vero-cellen (1 x 10 6) (stap 1.4) naarde OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Seed LPF2000/DNA-cell mengsel in 6-well-platen: Voeg de DNA-LPF2000 Vero-mengsel (stap 1.5) in de putjes van de 6-well plaat. Schud de 6-well-plaat en laat de transfectie incubeer overnacht in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Wijzig transfectiemedium: Ongeveer 16-24 uur na transfectie, verwijder de transfectie media, voeg 2 ml van de infectie media en incubeer getransfecteerde cellen voor een extra 48 uur. </li><li> Celpassage: Na 48 uur incubatie in infectie media, verwijder de weefselkweeksupernatant (TCS) en passeren de getransfecteerde cellen in een 100 mm schaal. De TCS bevat zelden besmettelijk virus, omdat de getransfecteerde cellen nodig aanvullende incubatie om virusdeeltjes te genereren. Voor de passage cel: <ol><li> Was de cellen tweemaal met 2 ml 1x PBS. </li><li> Trypsinize cellen w<html> ide 0,5 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen los. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 1,5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 5000 rpm, 4 ° C in een microcentrifuge. </li><li> Resuspendeer voorzichtig de cellen in 1 ml van infectie media en overbrengen van de cellen naar een 100 mm schaal. Breng het totale volume van de plaat, met besmettelijke media, 8 ml, voldoende volume om uitdroging te voorkomen van de cellen en voor het concentreren van het virus. </li></ol></li><li> Schud de 100 mm schaal en verder het incuberen van Vero-cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 72 uur. </li><li> Collectie van TCS: Na 72 uur incubatie, het verzamelen van de TCS in een 15 ml centrifugebuis. Verwijder celresten door centrifugeren gedurende 5 min bij 2500 rpm in een centrifuge. Infectieuze arenavirus wordt gevonden in de TCS, zodat uit de celresten pellet en opslaan TCS bij -80 ° C. </li></ol>le &quot;. Bevestiging van Recombinant arenavirus Rescue&gt; 2 Detectie van een succesvolle redding van rLCMV en rCandid # 1 geschiedt via een focus-vormende eenheid (FFU) immunofluorescentie assay (IFA). Voor wild-type virus rescue gebruiken we antilichamen specifiek voor de virale NP. De r3LCMV en r3Candid nr.1 coderen twee reportergenen (GFP en Gluc), waardoor virale detectie en titratie zonder de noodzaak van antilichamen door fluorescentiemicroscopie (GFP) en / of luminescentie (Gluc). <ol><li> Bevestig wild-type recombinante arenavirus rescue: De dag vóór titratie, wassen Vero-cellen tweemaal met PBS, trypsinize en bereiden 96-well platen tot 80 te bereiken - 90% samenvloeiing volgende dag (4 x 10 4 cellen / putje). Schud de platen met de hand om een ​​geüniformeerde verdeling van de cellen te krijgen. Cultuur van de cellen een nacht in de 37 ° C incubator met 5% CO2. Controleer de cellen onder de microscoop om een ​​monolaag te bevestigen, alvorens verder te gaan met de infectie: <ol><li> Serieel verdund (10 voudige verdunningen) de virus-bevattende TCS gewonnen uit de getransfecteerde cellen in de 100 mm schaal (stap 1.10) in OptiMEM. </li><li> Verwijder het afdrukmateriaal uit de gezaaide Vero-cellen, wassen tweemaal met 50 pi 1x PBS, en infecteren cellen met 50 ul van de serieel verdund virus (stap 2.1). Infecteren cellen gedurende 1,5 uur bij 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Na infectie, verwijder de virusinoculum, voeg 100 ul van infectie media / putje en incubeer de cellen voor 16 - 18 uur. Virale re-infectie kan optreden na 18 uur incubatie, wat kan leiden tot overschatting van de virale titers. </li><li> Bij 16 - 18 uur na infectie, verwijder de TCS van elk putje en zet de cellen met 4% formaldehyde opgelost in 1 x PBS, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Vervolgens verwijdert de fixeeroplossing en doorlaatbaar de cellen met 0,1% triton X-100 verdund in 1 x PBS, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het permeabilisatie oplossing, daarna wassen cellen 3 maal with 1x PBS. </li><li> Blokkeer de cellen met 2,5% runderserum albumine (BSA) in 1x PBS (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief kunnen de cellen worden overnacht bij 4 ° C geblokkeerd en voortgezet met antilichaam incubatie de volgende dag. </li><li> Maak ondertussen het primaire antilichaam. Verdun de LCMV-en Candid # 1-specifieke primaire antilichamen in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De monoklonale anti-LCMV NP antilichaam kloon 1.1.3 (1:30 verdunning) 16 en de monoklonale anti-JUNV NP antilichaam SA02-BG12 van BEI Resources (1:500 verdunning) kan worden gebruikt voor de detectie van rLCMV en rCandid nr.1 respectievelijk. </li><li> Na 1 uur incubatie, zuigen de blockingbuffer en voeg 50 ul van het primaire antilichaam aan de cellen en incubeer 1 uur bij 37 ° C. </li><li> Op dit moment Verdun het secundaire antilichaam in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De polyklonale konijn anti-muis IgG FITC tweede antilichaam voor de detectie van primaire monoklonale antilichamen werd gebruikt om beelden waargenomen in figuur 5 te verkrijgen. </li><li> Na 1 uur incubatie zuig het primaire antilichaam, was 3 maal met 1 x PBS en voeg het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Na 30 min incubatie, zuig het secundaire antilichaam en was 3 keer met 1x PBS. De cellen zijn nu klaar om te worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie aan beide bepalen het succes van virale redding en titratie door het tellen van de focus eenheden per ml (FFU / ml). </li></ol></li><li> r3LCMV en r3Candid # 1 viral rescue: Omdat deze virussen uiten twee reporter genen, hun reddingen kunnen worden gecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie om GFP expressie of Gluc expressie in TCS detecteren. Rescue kan ook worden bevestigd door expressie van Gluc in TCS. Om de trisegmented virussen titreren, volgen we de stappen 2.1 tot en met 2.1.4, echter cellen hoeven niet te be bevestigd aan een succesvolle virale redding door GFP-expressie te bepalen. De titratie van het virus wordt bepaald door het tellen van de FFU / ml. Om succesvolle virale redding bepalen door Gluc expressie Gluc expressie van TCS kunnen worden gemeten met een Gluc assay kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). Daartoe: <ol><li> Pipet 100 ul van TCS in een 96-well witte plaat (Platbodem microtiterplaten, Fisher Scientific). </li><li> Stel de lichtmeter (LumiCount, Packard Biosciences). </li><li> Voeg 50-100 ul Gluc Assay oplossing (zoals aanbevolen door de fabrikant) aan elk monster en meet de Gluc reportergenexpressie met de luminometer. Als negatieve controle werd Gluc expressie van de TCS van de wildtype virussen geïnfecteerde cellen gemeten. </li></ol></li></ol> 3. Passage van Tissue Culture Supematanten Virale redding is afhankelijk van transfectie efficiëntie. Vero-cellen is aangetoondtot lagere transfectie efficiëntie dan andere cellijnen 14 hebben. Als virustiters in de TCS zijn laag, infecteren verse Vero-cellen bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 (LCMV) of 0.1 (Spontaan # 1) voor 72 uur om het virus te versterken.

<ol><li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li>
<li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+a+neglected+central+nervous+system+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+an+official+publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).</li>
<li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchmeier%2C+MJ+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).</li>
<li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arenavirus+reverse+genetics%3A+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li>
<li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li>
<li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li>
<li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I%2FII-driven+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li>
<li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lassa+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+reviews+in+clinical+laboratory+sciences%22%5BJournal%5D)">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li>
<li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li>
<li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li>
<li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li>
<li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li>
<li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytic+choriomeningitis+virus%3A+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li>
<li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus%3A+its+application+for+H5N1+vaccine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li>
<li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li>
<li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li>
<li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li>
<li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li>
<li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li>
</ol>

Generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken is uitgegroeid tot een veel gebruikte aanpak voor het onderzoeken van vele verschillende facetten van arenavirus biologie. Hier documenteren we een cruciale verbetering van het huidige systeem door het uitvoeren arenavirus reddingen in Vero-cellen, waardoor de potentiële productie van FDA-goedgekeurde kandidaten vaccin tegen arenaviruses en vaccinvectoren tegen andere besmettelijke ziekten. De...

Arenaviruses zijn omhulde virussen met een bisegmented, negatieve-stranded RNA genoom 3 die behoren tot de familie Arenaviridae. De arenavirus genoom codeert vier eiwitten in een ambisense mode uit twee afzonderlijke virale segmenten 3. De grote (L) segment codeert het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L) en de kleine RING (Really Interesting New Gene) vinger eiwit (Z), dat fungeert als de belangrijkste drijvende kracht van het virus ontluikende. Het kleine (S) segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en het oppervlak glycoproteïne (GP) (figuur 1). Verscheidene leden van de familie Arenaviridae verantwoordelijk voor dodelijke hemorrhagic fever (HF) bij mensen 3. Principiële zorgen zijn Lassa virus (LASV) en Junín virus (JUNV), waarvan bekend is dat hoge mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten 8, 9 veroorzaken. Hoewel deze virussen zijn endemisch in West-Afrika en landelijke Argentinië, respectievelijk,er zijn toenemende bezorgdheid van de invoer van LASV en JUNV naar niet-endemische gebieden als gevolg van verhoogde reizen 10. Bovendien, hoewel niet gewoonlijk geassocieerd met ernstige ziekten bij de mens, is het prototype arenavirus lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV) beschouwd als een verwaarloosde pathogeen als er gevallen van dodelijke infecties zijn in immuungecompromitteerde patiënten 6, 15 en is verantwoordelijk voor aangeboren afwijkingen en spontane abortussen bij zwangere vrouwen 2, 13. Momenteel zijn er geen FDA-goedgekeurde vaccins tegen arenavirussen en behandeling is beperkt tot het nucleoside analoog ribavirine, die slechts gedeeltelijk effectief en vaak geassocieerd met significante bijwerkingen. De introductie van plasmide-gebaseerde reverse genetics 4 en generatie van recombinant arenaviruses 7, 19 zijn sterk vooruitgegaan op het gebied van arenavirus onderzoek. Momenteel worden cellen van knaagdieren (zoals BHK-21) voor de algeatie van recombinant arenavirussen door de soortspecifieke murine RNA polymerase I (pol-I) promoter de transcriptie van de eerste S en L segmenten. Echter virus rescue in BHK-21 cellen geen goedgekeurde methode voor het genereren van recombinant arenavirussen als potentieel vaccin kandidaten zaad. Hier documenteren wij het gebruik van de menselijke pol-I promotor voor doeltreffende redding van de prototypische Oude Wereld (OW) LCMV en de Nieuwe Wereld (NW) JUNV Candid # 1 stam in Vero-cellen. Met behulp van een soortgelijke methodologie, we gegenereerd recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses dat twee extra vreemde genen gecodeerd in twee verschillende S-RNA-segmenten 5 bevatten. Dit nieuwe systeem volgt niet alleen een zeer reproduceerbare en eenvoudig protocol maar kunnen onmiddellijk worden toegepast bij de vorming van recombinante arenavirussen als potentiële vaccins of vaccin vector zaden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materiaal en methoden</td></tr><tr><td colspan="4"> Cellijnen Vero E6 (nierepitheelcellen van Afrikaanse groene aap) worden bewaard in een 37 &deg;C incubator met 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cellen zijn verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC, catalogusnummer CRL-1586). Plasmiden Alle plasmiden, met uitzondering van hpol-I L, kunnen worden gekweekt bij 37 &deg;C, gedurende 16-18 uur. We raden aan dat culturen van de hpol-I L worden gekweekt bij 30 &deg;C gedurende 24 uur. Plasmiden worden bereid met behulp van een plasmide maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en worden bewaard bij -20 &deg;C. De concentratie van het gezuiverde DNA-plasmide wordt bepaald door spectrofotometrie bij 260 nm, waarbij de zuiverheid wordt geschat aan de hand van de 260:280 nm-verhouding. Bereidingen met 1,8-2,0 260:280 nm-verhoudingen worden geschikt geacht voor virusredding. Bovendien moeten de concentratie en zuiverheid van het plasmide worden bevestigd met agarosegelelektroforese. Virussen Het beschreven protocol voor het redden van rLCMV (Armstrong 53b) en rCandid#1 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) 2-omstandigheden. Besmet materiaal, inclusief TCS en cellen, moet worden gesteriliseerd voordat het wordt weggegooid. Het redden van andere arenavirussen kan hogere BSL-faciliteiten vereisen, dus de juiste veiligheids-/beveiligingsmaatregelen moeten worden gevolgd. Weefselkweekmedia en oplossingen DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's aangepast Eagle's medium (DMEM), 50 ml foetaal bovien serum (FBS) en 5 ml 100X Penicilline/Streptomycine (PS). Bewaren bij 4 &deg;C. Dit medium wordt gebruikt voor het onderhoud van Vero-cellen. Besmettelijk medium: 2-tot-1 mengsel van OptiMEM en DMEM 10 %FBS 1 %PS. Bewaren bij 4 &deg;C. Dit medium wordt gebruikt tijdens virale infecties. 10X Fosfaatgebufferd zout (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g van Na2HPO4.7H2O, 2 g van KH2PO4. Voeg ddH2O tot 1 liter toe. Breng pH aan op 7,3. Steriliseer door autoclaveren. Bewaren bij kamertemperatuur. 1X PBS: Verdun 10X PBS 1:10 met ddH2O. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij kamertemperatuur. 2,5 % BSA: 2,5 g BSA in 97,5 ml van 1X PBS. Bewaren bij 4 &deg;C. Dit wordt gebruikt als blokkeeroplossing voor IFA. </td></tr></tbody></table>

generatie van recombinant arenavirus for vaccine development in fda-goedgekeurde vero cellen

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

De ontwikkeling en implementatie van arenavirus reverse genetics is een belangrijke doorbraak in het areanavirus veld 4. Het gebruik van cel-gebaseerde arenavirus minigenoom systemen samen met de mogelijkheid om recombinant infectueus arenavirussen met voorafbepaalde veranderingen in hun genomen te genereren is het onderzoek naar de bijdrage van virale determinanten van de verschillende stappen van de arenavirus levenscyclus, en virus-gastheer vergemakkelijkt interacties en mechanismen van pathogenese arenavirus 1, 3, 11. Bovendien is de ontwikkeling van trisegmented arenavirussen toegelaten gebruik van de arenavirus genoom aanvullende vreemde genen van interesse en aldus de mogelijkheid van arenavirus gebaseerd vaccin vector toepassingen 5 openen. Ook aan een enkele cyclus infectieuze arenavirussen kan uitdrukken reporter genen verschaft een nieuwe experimentele methode om de veiligheid van onderzoek met highl verbetereny pathogene menselijke arenaviruses 16. De generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken heeft tot nu toe vertrouwd op het gebruik van knaagdieren cellijnen 7,19, die enkele barrières voor de ontwikkeling van de Food and Drug Administration (FDA)-licentie vaccin of vaccinvectoren poses. Om dit obstakel te overwinnen, beschrijven we hier de efficiënte productie van recombinante arenaviruses in FDA-goedgekeurde Vero-cellen.

Succesvolle redding van een recombinant wildtype arenavirus wordt bevestigd door de aanwezigheid van virale antigenen met IFA (figuur 5). Bij recombinante trisegmented virussen kunnen succesvolle virale redding worden beoordeeld door het observeren GFP expressie door fluorescentie microscopie (figuur 6A). Succesvolle rescue zullen verder bevestigd door het beoordelen Gluc expressie (Figuur 6B). Representatieve resultaten illustreren de succesvolle redding van wild-type ...

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA&#39;s, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter bestrijding humane pathogene arenavirussen.

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudig en zeer reproduceerbaar protocol te demonstreren voor de generatie van recombinante arenavirussen in FDA-goedgekeurde Vero-cellen voor potentiële vaccin- of vaccinvectorzaad ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst zorgvuldig de plasmide DNA-transfectiemixtuur voor te bereiden. De tweede stap is om Vero-cellen te transfecteren met de plasmide DNA-transfectiemixtuur.Vervolgens is het noodzakelijk om getransfecteerde cellen op te schalen in 100 millimeter schotels. Uiteindelijk is de laatste stap het bevestigen van een succesvolle virusredding door immunofluorescence met wild type-virus of bifluorescentiemicroscopie en GIA-luciferase-expressie met behulp van tris-segmenteerde virus in vergelijking met bestaande methoden zoals reddingen en rine-cellijnen. Dit protocol genereert renale virussen in Vero-cellen, die door de FDA zijn goedgekeurd voor de ontwikkeling van vaccins.Naast de generatie van potentiële vaccinzaad, kan het gerapporteerde gen dat tri-segmenteerde virussen tot expressie brengt ook worden toegepast voor de identificatie van antiviralen tegen VIRs in head-throughput-screens zonder de noodzaak van secundaire assays voor virale detectie. Bereid eerst 250 microliters van optimaal media en, afhankelijk van het virus, red 10 tot 12 microgram van lipo 2000 per transfectie gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Gedurende deze tijd bereidt u de plasma-transfectiemix in een aparte microcentrifugebuisje voor met behulp van de aanbevolen hoeveelheden voor elke virusredding.Breng het uiteindelijke volume naar 50 microliter met optimaal. Vervolgens voegt u 250 microliter van de optimaal lipo-mix in de plasma-DNA-transfectiemix en incubeert u deze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Om Vero-cellen voor te bereiden, brengt u eerst de P-B-S-D-M-E-M 10%FBS 1%PS media en het trypsin-EDTA-mengsel in evenwicht tot 37 graden Celsius om het bureau van cellen te oogsten, was de culturen twee keer met vijf milliliter PBS.Voeg vervolgens een milliliter trypsin-EDTA toe voor celafscheiding, indien nodig, tik voorzichtig om de cellen volledig te losmaken. Resuspendeer nu de cellen in 10 milliliter compleet DMEM in een 15 milliliter centrifugebuisje. Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 1000 RPM en resuspendeer de cellen in 10 milliliter compleet DMEM.Tel de cellen en pas de concentratie aan tot een keer 10 tot zes cellen per milliliter. Na de 20 tot 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur, voegt u een milliliter Vero-cellen toe aan de optimale lemine, DNA-plasmidemix en incubeert u deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Zaai nu het lipo DNA-celmengsel in zes welborden.Schud voorzichtig en plaats vervolgens in de incubator. Na 16 tot 24 uur na de transfectie, verwijdert u het transfectiemedium en voegt u twee milliliter infectiemedium toe. Kweek de cellen nog eens 48 uur. Na het passeren verwijdert u de weefselkweeksupernatant, was twee keer met een XPBS en trypsin-ijs de cellen zoals eerder getoond.Resuspendeer vervolgens de cellen in een milliliter compleet DMEM om de cellen te pelleten, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 5.000 RPM en vier graden Celsius. Resuspendeer de pellets voorzichtig in een milliliter infectiemedium en breng de cellen over naar een 100 millimeter schotel.Breng het totale volume in de schotel met infectieus medium naar acht milliliter, een voldoende volume om uitdroging van de cellen te voorkomen, evenals om het virus te concentreren. Schud voorzichtig de 100 millimeter schotel voor een uniforme monolaag van getransfecteerde cellen na cultuur. Na 72 uur verzamelt u de weefselkweeksupernatant, centrifugeert u deze om cellulaire brokjes te verwijderen en bewaart u de supernatanten op min 80 graden Celsius de dag voor titratie.Was de Vero-cellen twee keer met PBS en trypsin-ijs. Tel de cellen na het resuspenderen in 10 milliliter compleet DMEM met een heemocytometer en pas de concentratie aan tot vier keer 10 van de vier cellen per putje. Bereid vervolgens 96-welborden voor om 80 tot 90% cofluency te bereiken.De volgende dag. Schud de borden voorzichtig met de hand om een uniforme verdeling van de cellen te krijgen. Kweek de cellen gedurende de nacht op de dag van infectie.Controleer de cellen onder de microscoop om een monolaag te bevestigen voordat u doorgaat met de infectie. Verdund nu serieel het virus bevattende weefselkweeksupernatant die eerder in optimaal in een 96-welbord werd hersteld. Aas vervolgens het medium van de gezaaide Vero-cellen. Was twee keer met 50 microliter PBS en infecteert u de cellen met 50 microliter van het serieel verdunde virus.Infecteer de cellen gedurende anderhalf uur bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Vervolgens verwijdert u het virus-inoculum bij 100 microliter infectiemedium per putje en incubeert u de cellen gedurende 16 tot 18 uur. Verwijder nu de weefselkweeksupernatant uit elk.Fixeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met 4% formaldehyde verdund in PBS. Vervolgens verwijdert u het formaldehyde en permeases met 0,1% trite X 100 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Aspirieer vervolgens de permeatieoplossing en was drie keer met 100 microliter PBS. Blokkeer de cellen met 2,5% bovien serumalbumine.Verdun het primaire antilichaam specifiek voor een arenavirus-eiwit in 2,5% BSA en centrifugeer gedurende 15 minuten. Bij 3.500 RPM, incubeert u de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius met het antilichaam na drie PBS-washingen bij een geschikt fluoro-vier geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwijder het secundaire antilichaam en was drie keer met 100 microliter PBS.Titreer vervolgens door fluorescente focusvormende eenheden te tellen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Vergelijkbaar met wild type recombinant arenavirus. Titreerp het tri-segmenteerde virus door eerst het virus in het weefsel

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectoren worden steeds waardevol...

Productie en Titering van recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren

Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

We tonen de basistechniek om moleculair ingenieur en synthetische adeno-geassocieerde virale (AAV) gentherapievectoren evolueren via DNA-familie shuffelen. Bovendien geven we algemene richtlijnen en representatieve voorbeelden voor de selectie en analyse van individuele chimere capsiden met verbeterde eigenschappen op doel cellen in cultuur of in muizen.

Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.

Genereren van recombinante aviaire Herpesvirus vectoren met CRISPR/Cas9 Gene bewerken

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.

Procesontwikkeling voor de productie en zuivering van Adeno-geassocieerd virus (AAV)2 Vector met behulp van Baculovirus-Insect Cell Culture System

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent &gt; 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.

Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid

Naarmate het gebied van gentherapie zich blijft ontwikkelen, is er een groeiende behoefte aan innovatieve methoden die deze uitdagingen kunnen aangaan. Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform, dat voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies.

Een gestroomlijnde en gestandaardiseerde procedure voor het genereren van adeno-geassocieerde virusvectoren met een hoge titer en hoge kwaliteit met behulp van een Cell Factory-platform

Leer een reproduceerbare methode voor het genereren van recombinant arenavirus in FDA-goedgekeurde Vero-cellen voor vaccinontwikkeling. Dit protocol omvat plasmide-transfectie en virusrescue-bevestiging.

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

Meer video's verkennen