Antilichaamkleuring in C. Elegans Een 'Freeze-Cracking "

Het algemene doel van deze procedure is om antilichaamkleuring uit te voeren op C elegans. Om dit te doen, worden nematoden gespoeld, verspreid op glazen platen en voorzichtig samengedrukt tussen twee kleefstoffenglazen, die vervolgens worden bevroren op droog ijs. Vervolgens worden de glazen gescheiden om de nematoden open te kraken en onmiddellijk in fixeermiddel geplaatst.

De nematoden worden vervolgens gekleurd met behulp van standaard antilichaamkleuringstechnieken. Analyse door middel van fluorescentiemicroscopie onthult een succesvolle antilichaamkleuring van semi intacte nematoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals het fixeren van intacte nematoden is dat het de chemische behandeling van het monster minimaliseert. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het voorbereiden van de glazen en nematoden enigszins lastig is om te demonstreren.

De procedure zal door mijzelf en RTO Basu, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium worden uitgevoerd. Om platen met nematoden voor kleuring voor te bereiden, begint u door een plat stuk metaal op droog ijs te plaatsen om het te koelen met behulp van gedestilleerd water en een glazen pipet om te spoelen. Wormen gekweekt op een 60 millimeter NGM-plaat met bacteriën in een 1,5 milliliter microfugebuis. De wormen kunnen gesynchroniseerd of van gemengde leeftijden zijn, maar vermijd het gebruik van platen met veel dowers die moeilijk te kraken zijn of uitgehongerde wormen, die de autofluorescentie zullen verhogen met behulp van dezelfde glazen pipet.

Spoel de wormen drie tot vier keer met gedestilleerd water om ze van bacteriën te bevrijden. Laat ze vervolgens drie tot vijf minuten op de werktafel zitten om voornamelijk volwassenen te verzamelen. Nadat de wormen op de bodem van de buis zijn bezonken, verwijdert u het grootste deel van het water uit de buis, waardoor ongeveer twee keer het volume water als wormen overblijft, maar minimaal 25 microliters totaal volume.

Label de mat kant van polylysine-glazen met onuitwisbare inkt en plaats de glazen op de werktafel naast de container met droog ijs met de labelkant omhoog. Dit zal dienen als de onderste glijbaan. Zorg voor een gelijk aantal schone niet-polylysine behandelde.

Bovenste glijbanen beschikbaar. Pipet vervolgens ongeveer 25 microliters wormen in water op de onderste hechtingsglijbaan en gebruik de zijkant van de pipettip om de wormen over het midden van de glijbaan te verspreiden. Laat ze 30 seconden tot twee minuten bezinken.

De uiteinden van de wormen zullen blijven plakken als ze contact maken met de glijbaan. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het voorkomen dat de wormen te vervormd raken tijdens de volgende paar stappen. De beste manier om dit te doen is door geduldig te zijn, alles klaar te hebben en niet te veel cafeïne te drinken, zodat uw handen lekker en stabiel zijn.

Houd de onderste glijbaan in één hand en plaats de bovenste glijbaan eroverheen zodat alleen de mat delen overlappen. De vloeistof moet de glijbanen iets uit elkaar houden, zodat de wormen nog steeds enige bewegingsvrijheid hebben. Laat de glijbanen niet over elkaar glijden, wat de wormen zal verdraaien.

Gebruik vervolgens de duimen en wijsvingers van elke hand om voorzichtig rechtop te drukken op de bovenste glijbaan. Met de juiste hoeveelheid druk zullen een paar van de grootste hermafrodieten aan de rand van de glijbaan scheuren. Terwijl de meeste volwassenen en larven contact maken met elke glijbaan, maar intact blijven, plaatst u ze onmiddellijk en voorzichtig, zonder dat de glijbanen uit elkaar glijden, op het stuk metaal op droog ijs. Binnen een minuut zullen de glijbanen bevroren lijken, maar laat ze daar vijf minuten staan om ervoor te zorgen dat ze grondig bevroren zijn.

De glijbanen zijn nu klaar voor fixatie. Als u niet onmiddellijk doorgaat, bewaart u de glijbanen in een gelabelde doos op minus 80 graden Celsius gedurende enkele dagen. Ze moeten binnen een week of zo worden gebruikt nadat ze zijn gemaakt.

Gebruik de glijbanen niet na langdurige opslag. Individuele nematoden kunnen ook op glijbanen worden voorbereid in een methode die vergelijkbaar is met die zojuist getoond. Plaats een plat stuk metaal op droog ijs om het te koelen.

Gebruik vervolgens een wormpick om individuele nematoden over te brengen naar een druppel water op een NGM-plaat om ze van bacteriën te bevrijden. De nematoden moeten goed gevoed zijn om de autofluorescentie te verminderen. Indien mogelijk, herhaal de overdracht naar nieuwe watervlekken zoals nodig is totdat de worm vrij is van bacteriën.

Bereid vervolgens de bovenste en onderste glijbanen voor zoals eerder. Plaats vervolgens een druppel van vijf tot 10 microliter water op het polylysine behandelde gebied van de onderste glijbaan terwijl u met een microscoop observeert. Gebruik een wormpick om maximaal 20 wormen naar de druppel water over te brengen.

De wormen moeten naar beneden zinken om het kleverige glijbanenoppervlak aan te raken. Plaats vervolgens de bovenste glijbaan zoals eerder, maar comprimeer niet terwijl u ervoor zorgt dat de glijbanen niet onmiddellijk uit elkaar glijden. Plaats de glijbanen op het metaal op droog ijs.

Bewaar ze vijf tot 30 minuten op droog ijs en ga onmiddellijk door naar fixatie. Deze glijbanen kunnen niet worden opgeslagen voor later gebruik. Om de wormen licht te fixeren, begint u met het plaatsen van kleurvaten met fixeeroplossingen op ijs om ze 10 minuten te koelen.

De oplossingen die nodig zijn, zijn 100% methanol, 100% aceton en fosfaat gebufferd zout. Neem snel een paar onderste en bovenste glijbanen van het droog ijs, draai ze uit elkaar en dompel onmiddellijk de onderste glijbaan in ijskoud methanol gedurende twee minuten, gooi de bovenste glijbaan weg. Breng vervolgens de glijbanen van methanol over naar ijskoud aceton gedurende vier minuten.

Als de glijbanen veel wormen hadden, zullen de meeste ervan in het fixeermiddel vallen, zelfs met goed voorbereide gli