De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten
18 november 2013
We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om grote aantallen tumor sferen van uniforme grootte te genereren. Dit wordt bereikt door eerst de microwell platen voor te bereiden om de cellen die gevormd moeten worden in steroïden te clusteren. Als tweede stap wordt een cultuur van het gewenste celtype geoogst, wat de celsuspensie levert die de grootte en samenstelling van de OID's bepaalt.
De celsuspensie wordt vervolgens gecentrifugeerd in de microputjes en geïncubeerd om steroïd te laten vormen na incubatie. De resulterende steroïd zijn zeer uniform en kunnen worden verzameld of gekweekt in de microputjes waarin ze zijn gevormd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden is dat zeer grote aantallen uniforme aggregaten gelijktijdig kunnen worden gemaakt.
Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen vinden dat hun brandstof zeer in grootte is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de celsuspensie gelijkmatig over de plaat is verdeeld en dat de zwaaiende plaatdragers in de centrale Fuge vrij bewegen, zodat de kracht loodrecht op het oppervlak staat. Om te beginnen, bereidt u een steriele agro-well 400 plaat voor door 0,5 milliliter oplossing met oppervlakte-actieve stof toe te voegen aan elke put.
Het gebruik van oppervlakte-actieve stof zorgt ervoor dat de cellen niet in contact komen met het oppervlak van de microputjes. Om luchtbellen in de microputjes te voorkomen, voegt u vloeistof aan één kant toe en laat u deze zich over het oppervlak verspreiden in plaats van verticaal op het oppervlak te laten vallen. Na het toevoegen van de oplossing aan de putjes, plaatst u het deksel weer terug.
Zorg ervoor dat de rotor goed uitgebalanceerd is voordat u de platen gedurende twee minuten centrifugeert bij 2000 keer G. Om luchtbellen te verwijderen met behulp van een geïnverteerde microscoop met lage vergroting, controleert u of de luchtbellen uit de microputjes zijn verwijderd. Incubeer de plaat gedurende minimaal 30 minuten met het deksel op bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius. Zuig de spoelvloeistof uit de putjes en was de plaat met steriel water of PBS onmiddellijk voor gebruik.
Laat de platen na het coderen niet uitdrogen. De details van celbereiding zullen variëren afhankelijk van het specifieke celtype dat wordt bestudeerd. We hebben echter waargenomen dat deze voorwaarde effectief is voor een breed scala aan cellen, inclusief de lijnen die we hier hebben besproken, evenals humane en neuronale embryonale stamcellen, humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, fibroblasten, putatieve, primitieve endone en stromale cellen Om cellen te bereiden, begint u met de T 75 flacon van HT 29 cellen.
Zuig groeimedium uit de flacon en voeg drie milliliter trypsine toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Stop de trypsine vertering door drie milliliter groeimedium toe te voegen.
Breng de rest over in een 15 milliliter centrifugeerbuis. Neem vervolgens uit een 15 milliliter buis een aliquot voor celtelling. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 200 keer G terwijl de centrifugatie bezig is.
Tel de cellen. Zuig vervolgens het tryin-medium mengsel af en vervang het door vers groeimedium met een volume bepaald door de vereiste celdichtheid, eerder berekend zoals beschreven in het tekstprotocol als een optionele stap.
Breng de celsuspensie door een zeef om eventuele klonten te verwijderen. Sferoïden kunnen worden gegenereerd in verschillende mediumformuleringen, maar aanvankelijke proeven moeten worden uitgevoerd met behulp van het medium waarin de cellen zijn gekweekt. Om gevolgen van overgang naar een driedimensionale kweek te onderscheiden van gevolgen van verandering van mediumsamenstelling, begint u met het toevoegen van 0,4 milliliter groeimedium aan elke put en centrifugeert u deze gedurende twee minuten bij 2000 keer G. Om luchtbellen te verwijderen met behulp van een geïnverteerde microscoop met lage vergroting, controleert u of de luchtbellen uit de microputjes zijn verwijderd.
Voeg vervolgens 0,4 milliliter celsuspensie toe met de vereiste dichtheid aan de microputjes. Meng voorzichtig door te pipetten op en neer zonder luchtbellen in de microputjes te introduceren, zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de put zijn verdeeld. Om consistente steroïd te verkrijgen.
Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 200 keer G, de plaat moet intern evenals tegen de andere plaat worden uitgebalanceerd, zodat het gewicht gelijkmatig over beide zijden van de platendrager is verdeeld. Dit zorgt ervoor dat de plaat zichzelf nivelleert tijdens centrifugatie, zodat convectiestroom niet ontstaat en resulteert in ongelijkmatige verdeling van cellen over de microputjes.
Controleer met behulp van een geïnverteerde microscoop of de cellen zich binnen de microputjes hebben geclusterd en dat ze gelijkmatig over de put zijn verdeeld voordat u de cellen gedurende de nacht incubeert bij 37 graden Celsius. Observeer het proces van sferoïdvorming met behulp van een geïnverteerde microscoop. Sommige cellijnen zullen binnen 24 uur compacte steroïd vormen.
Anderen kunnen langer duren. De progressie van cluster naar aggregaat bij HT 29 cellen wordt hier getoond. Het moeilijkste deel van deze procedure is om de intex steroïd uit te nemen zonder structuren te verstoren Om steroïd uit microputjes te extraheren, pipet op en neer zeer voorzichtig om de sferen uit de microputjes te laten komen.
Kanteel vervolgens de plaat om het medium-steroïdmengsel te aspireren. Gebruik brede orificië pipettenpunten voor steroïd van grotere grootte om te voorkomen dat de steroïd breekt. Na het herstellen van de steroïd uit de microputjes, brengt u deze over naar de suspensiekweek door ze voorzichtig met een pipet uit te straaien.
Alternatief kan de ernstige roos in beslag worden gehouden met een mediumvervanging. De duur hangt af van de initiële grootte en de groeisnelheid, die de tijd definieert totdat ze de microputjes overgroeien. Wel, ze werden gevormd Om het medium te vervangen zonder steroïd te verliezen.
Zuig het medium aan
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van grote aantallen uniforme tumorsferoïden met een gecontroleerde grootte en samenstelling met behulp van commercieel verkrijgbare microwell-platen. De methode maakt de simultane vorming van duizenden tot honderdduizenden sferoïden mogelijk, wat een significant voordeel biedt ten opzichte van bestaande technieken.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Uniforme tumorsferoïden zijn essentieel voor diverse biologische studies.
- Bestaande methoden voor de generatie van sferoïden missen vaak schaalbaarheid.
- Dit protocol voorziet in de behoefte aan high-throughput vorming van sferoïden.
- Microwellplaten faciliteren een gecontroleerde celaggregatie.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor het genereren van uniforme tumorsferoïden.
- Het verhogen van de efficiëntie van de productie van sferoïden voor onderzoeksdoeleinden.
- Het bieden van een protocol dat kan worden aangepast voor diverse celtypen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van microwell-platen met een spoeloplossing op basis van surfactant.
- Centrifugatie van cel-suspensies om een gelijkmatige distributie te garanderen.
- Incubatie van platen om sferoïdevorming mogelijk te maken.
- Extractie en onderhoud van sferoïden in kweek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van uniforme tumorsferoïden in grote hoeveelheden.
- Demonstratie van effectieve celclustering binnen microwells.
- Observatie van de dynamiek van sferoïdvorming bij verschillende cellijnen.
- Validatie van de toepasbaarheid van de methode op diverse celtypen.
Conclusies
- Het protocol maakt de high-throughput generatie van tumorsferoïden mogelijk.
- Het biedt een schaalbare oplossing voor onderzoekers in de celbiologie en oncologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen drug testing en ziektemodellering omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Uniforme, groottegecontroleerde tumorsferoïden die op grote schaal zijn geproduceerd, zijn cruciaal voor voorspellende oncologische geneesmiddelenontwikkeling en translationaal onderzoek. Het microwell-gebaseerde protocol maakt hoogdoorvoerse generatie van fysiologisch relevante 3D-tumormodellen mogelijk, wat robuuste assay-ontwikkeling en mechanische risicoreductie ondersteunt. Deze capaciteit versterkt vroege ontdekking, screening en preklinische workflows door reproduceerbare, kwantitatieve biologische systemen te bieden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van tumorbiologie mogelijk in een gecontroleerde 3D-context voor functionele validatie van targets.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door cel-cel- en cel-matrixinteracties te modelleren die relevant zijn voor tumoren in vivo.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de evaluatie van verbindingen in een vroeg stadium door de variabiliteit in biologische read-outs te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare sferoïdepopulaties voor kwantitatieve high-throughput screening.
- Maakt schaalbaarheid van assays en hergebruik van platforms mogelijk door honderden tot duizenden uniforme sferoïden per plaat te genereren.
- Verbetert de betrouwbaarheid van beoordelingen van de effectiviteit en toxiciteit van verbindingen in fysiologisch relevante systemen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro-modellen uit in lijn met ziekterelevante tumorarchitectuur voor translationele biomarkerstudies.
- Ondersteunt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door consistente modelgeneratie over verschillende cellijnen mogelijk te maken.
- Vermindert het risico op biologisch falen in een laat stadium door robuuste, predictieve preklinische gegevens te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze op microwells gebaseerde methode voor de productie van sferoïden integreert alle fasen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, waardoor een naadloze overdracht van gevalideerde modellen tussen R&D-teams mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-toetsing en het verduidelijken van signaalpaden in 3D-tumormodellen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare sferoïden voor de evaluatie van verbindingen en hit-triage.
- Analytics: Biedt kwantitatieve, grootte-gecontroleerde outputs voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers en de selectie van ziekterelevante modellen.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een schaalbaar, gestandaardiseerd platform dat aanpasbaar is aan diverse tumorgceltypen en onderzoeksbehoeften.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in oncologisch onderzoek.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows met gestandaardiseerde, high-throughput sferoïde-productie.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door biologische variabiliteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van oncologische assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in celkweek en het hanteren van 3D-modellen voor een optimale reproduceerbaarheid.
- Toegang tot centrifugatieapparatuur, inverted microscopie en infrastructuur voor steriele technieken is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van celsuspensies en het hanteren van platen.
- Aanpasbaar aan diverse tumor- en stamceltypes, maar voor nieuwe lijnen kan een initiële optimalisatie nodig zijn.
- Voorzichtig handelen is vereist om disruptie van sferoïden tijdens extractie en mediumvervangingen te voorkomen.
