Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis

Het algemene doel van deze procedure is om fluorescentie te gebruiken voor het kwantificeren van de respiratory burst-respons. Laad eerst de zebravissenembryo's in de putjes van een 96-wells plaat. Voeg vervolgens een fluorescent substraat toe en activeer de respiratory burst met een chemisch agens.

Kwantificeer vervolgens de relatieve fluorescentie met behulp van een fluorimeter. Uiteindelijk wordt de fluorescentie gebruikt om het potentieel van de respiratory burst aan te tonen. Deze methode kan worden gebruikt om te bestuderen hoe experimentele manipulaties de algehele gezondheid van het aangeboren immuunsysteem beïnvloeden.

Hier gebruiken we het om inzicht te krijgen in de respiratoire burst van zebravissenembryo's, maar het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals volwassen zebravissen, niercellen en celpreparaten van andere vissoorten. Kweek de embryo's in diepe Petrischalen bij 28 °C in eivrij water tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Verwijder dagelijks alle dode embryo's.

Giet het oude eierwater voorzichtig af en vul dit dagelijks aan met nieuw eierwater. Maak op de dag van het experiment een verdunde fluoresceïne-werkoplossing in een met folie omwikkelde microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Bereid daarnaast een werkoplossing voor met een uiteindelijke PMA-concentratie van 20 micrograms per milliliter.

Maak vervolgens vijf milliliter van elke doseringsoplossing in 15 milliliter conische buizen, zoals beschreven in de begeleidende tekst. Houd de doseringsoplossingen op ijs. Zet eerst de microplaatlezer aan en warm de lichtbron op om de fluorescentie te meten. Stel een programma in met de excitatie- en emissiegolflengten, de optische positiegevoeligheid, en voeg ook een schudstap van vijf seconden toe.

Bereid vóór de start de experimentele benodigdheden voor, waaronder schaaltjes met gecoate embryo's, een zwarte 96-well microplaat, een P 200 pipet met bijbehorende tips en een ijsemmer met de fluoresceïne-bevattende reagentia. Daarnaast zijn een multichannel P 200 pipet, twee steriele reservoirs, aluminiumfolie en een schaar nodig.

Knip nu een pipetpunt zo af dat de embryo's of nieren door de opening passen. Stel een P 200 pipet in op 100 µL en breng één embryo samen met eitjeswater over naar zoveel wells van een zwarte 96-well microplate als gewenst. Giet nu de doseeroplossing in een steriel reservoir van 25 mL met een multichannel P 200 pipet.

Voeg 100 µL van de H 2D CFDA-doseeroplossing toe aan één kolom van de 96-well plaat; herhaal dit voor de helft van de controle-embryomonsters en de helft van de experimenteel gemanipuleerde embryomonsters. Giet de PMA-bevattende doseeroplossing in een nieuw steriel reservoir van 25 mL.

Verdeel vervolgens deze doseeroplossing in aliquoten over de resterende kolommen van de 96-wells microplaat. Dek de microplaat af met aluminiumfolie en plaats deze gedurende ongeveer 20 seconden op een schudmachine. Incubeer de microplaat bij 150 RPM op 28 °C wanneer deze niet wordt uitgelezen.

Lees de microplaat af na de toevoeging van PMA. Ga door met het uitvoeren van metingen om de paar minuten gedurende het gewenste tijdsinterval, of incubeer de met folie omwikkelde microplaat bij 28 °C tot een vast tijdstip. Haal vervolgens de embryo's uit de putjes en eutanaseer de embryo's volgens het institutionele protocol voor dierverzorging en -gebruik.

Voer daarnaast de microplaat en andere wegwerpmaterialen af in de container voor biologisch gevaarlijk afval. Bepaal het tijdstip waarop u de fluorescentie wilt vergelijken. Trek de gemiddelde fluorescentiewaarde van de niet-geïnduceerde controlegroep af van de individuele fluorescentiewaarden van de PMA-geïnduceerde controlegroep.

Herhaal dit voor de experimentele groep met en zonder PMA. Sla deze genormaliseerde fluorescentiewaarden vervolgens op in kolommen: de controlegroep plus PMA en de experimentele groep plus PMA. Bereken daarna de gemiddelden en standaarddeviaties van de genormaliseerde fluorescentiewaarden voor de controlegroep plus PMA en de experimentele groep plus PMA.

Vergelijk de genormaliseerde fluorescentiewaarden met een ongepaarde T-toets om de statistische significantie te bepalen. Zet vervolgens de gemiddelden van de controlegroep plus PMA en de experimentele groep plus PMA uit in een grafiek, met foutenbalken die dedes bijbehorende standaarddeviaties weergeven; vermeld het significantieniveau in de grafiek en in het bijschrift van de figuur. Dit experiment vergelijkt de respons van de respiratory burst in wild-type zebravissenembryo's met een AB-achtergrond op 48 uur en 72 uur na bevruchting.

Ruwe fluorescentie werd gemeten vier uur na de toevoeging van PMA in de PMA-geïnduceerde groepen. De ruwe fluorescentiewaarden waren hoger in de 72 HPF populatie. Zoals aangegeven door de berekende gemiddelden, zijn de fluorescentiewaarden genormaliseerd om rekening te houden met variabiliteit in de achtergrondniveaus van fluorescentie.

De resultaten van deze respiratory burst-assay onthulden dat zebrafish-embryo's van 72 HPF in staat zijn om significant meer reactieve zuurstofspecies te produceren en dus een robuustere respiratory burst-respons vertonen dan embryo's van 48 HPF na inductie met PMA. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescentie kan worden gebruikt om het respiratory burst-potentieel van zebrafish-embryo's te kwantificeren. Vergeet niet dat het werken met PMA-poeder extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een mondmasker bij het afwegen van PMA-poeder.