Polymalic Acid-gebaseerde Nano Biopolymeren voor Targeting van Multiple Tumor Markers: een kans voor Gepersonaliseerde Geneeskunde?

Het algemene doel is het vaststellen van een nanoschaalplatform dat openstaat voor een universeel protocol om gepersonaliseerde medicijnen te synthetiseren op basis van de genetische opmaak van de ziekte van een persoon, met name bij kanker. Produceer en zuiver eerst polymaleïnezuur uit het micro-organisme frum polycephalum; activeer het gezuiverde PMLA chemisch bij de zijdelingse carboxylgroepen. Bevestig de kleine functionele groepen en de linker MEA door substitutie van de geactiveerde groepen en zet de ongebruikte geactiveerde groepen door hydrolyse terug naar carboxylgroepen.

Voeg vervolgens de antilichamen en antisense-moleculen toe via de sulfhydrylgroepen van de spacer, MEA en cap. De ongebruikte spacer wordt na voltooiing door reactie met PDP getest op de samenstelling en de functie van het lead-molecuul. Nano-drug resultaten zijn afkomstig uit een diermodel, zoals muizen met agressieve humane tumoren.

HER2-positieve borstkanker kan de effectiviteit van de behandeling bepalen, evenals of de behandeling zonder ongewenste bijwerkingen verloopt. Het belangrijkste voordeel van bioproductie ten opzichte van bestaande synthetische methoden, zoals ringopeningspolymerisatie, is dat het biopolymeer de volledige optische zuiverheid behoudt en niet verontreinigd is met bijproducten. Deze familie van PolyPhen-nanomedicijnen kan elk celtype targeten op basis van specifieke targeting en de eiwitexpressie reguleren.

Over het algemeen is kankerbehandeling met PHE-nanomedicijnen zeer efficiënt in verschillende diermodellen, in het bijzonder bij primaire hersen- en borstkanker. In eerste instantie kwam het idee voor deze methode voort uit het blokkeren van de synthese van glioblastoom-specifieke laminine in isovormen, en later hebben we de targeting en inhibitie van de HER2- en triple-negatieve borstkankerproteïnen aangetoond om tumorgroei te voorkomen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van kanker middels optische beeldvorming en magnetische resonantiebeeldvorming.

Poly-nanogiststoffen kunnen inzicht bieden in de toediening van geneesmiddelen voor de behandeling van kanker. Ze kunnen ook worden toegepast bij andere pathologische aandoeningen, zoals infectieziekten, pijnbestrijding en neurologische stoornissen. Nadat een zaadcultuur van plasmodium vanuit een spiraal op een boor is gegroeid, inoculeert u 100 milliliters basaal cultuurmedium en laat u de cultuur groeien bij 25 degrees Celsius.

Een thermostaatgestuurde incubator produceert een hoeveelheid gravitatiegepakte microplasm-media onder uitsluiting van licht. Om sporulatie in een bioreactorvat van 10 liter te voorkomen, lost men 80 gram calciumcarbonaat op in acht liter basaal medium, waarna de gepakte microplasm-media in het gemonteerde reactievat worden overgebracht en het bioproces voor 75 uur wordt ingesteld. Dit geschiedt bij 25 °C met een stroom gefilterde lucht van 10 liter per minuut en roeren bij 150 RPM met een segmentroerder.

Wanneer het kweekmedium een pH van 4,8 heeft, wordt de kweek gestopt om de productie van polymaleïnezuur te meten. Koel het medium nu af tot 17 °C, laat de cellen bezinken door zwaartekracht en verwijder het cultuursupernatant uit de reactor. Stel de pH in op 7,5.

Pomp nu het supernatant vanaf de onderzijde door een DEAE-cellulosekolom van 1,5 liter, geëquilibreerd met 20 millimolair tris-hydrochloride pH 7,5 bij vijf graden Celsius. Laat vervolgens drie kolomvolumes washbuffer met 0,3 molair natriumchloride van onder naar boven door de kolom lopen en elueer de PMLA in aanwezigheid van 0,7 molair natriumchloride. Stel de geëlueerde PMLA-fractie in op 0,1 molair calciumchloride en voeg 80% ijskoud ethanol toe om het PMLA-calcium neer te slaan; fractioneer vervolgens het PMLA-calcium met behulp van cidex G 25 en water.

Haal ten slotte elke fractie door een barnsteenlichtkolom en bevries onmiddellijk de doorstroom van polymaalzuur in vloeibare stikstof en lyophiliseer dit vóór bewaring bij -20 °C. Om de carboxylgroepen van PMLA te activeren, mengt men 1 mmol PMLA-H in 1 mL watervrij aceton en telkens 1 mmol van een hydroxy-CIN-aide en cylo-heyl-carbo-ide in 2 mL dimethylformamide; na drie uur roeren bij 20 °C wordt 0,05 mmol methyl Pega-mean in 1 mL DMF toegevoegd, gevolgd door 0,05 mmol triethylamine.

Voeg vervolgens druppelsgewijs 0,4 millimol leucine-ethylester toe en controleer na één uur of de reactie voltooid is door middel van een negatieve lyn-respons op dunne-laagschromatografie. Voeg op dezelfde wijze 0,1 millimol 2-mercaptoethylamine en 0,5 millimol TEA toe. Verwijder de resterende NHS-ester door spontane hydrolyse met fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Ontzout via een PD 10-kolom en lyofiliseer om een wit poeder te verkrijgen; bewaar dit pre-conjugaat droog bij -20 °C. Voeg vervolgens 30 mg antilichaam toe aan 4,5 ml 150 mM natriumchloride in 100 mM natriumfosfaat bij pH 5,5. Reduceer de disulfidebindingen met 5 mM tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride en zuiver via een PD 10-kolom.

Los nu de IDE PEG IDE op in twee milliliters van de bovengenoemde buffer, zijnde bij pH 6.3. Voeg het gereduceerde antilichaam toe en roer gedurende één uur bij 20 °C. Concentreer tot 2.5 milliliters met een AVEVA spin 20 met een uitsluiting van 30 kilodalton en zuiver vervolgens via cidex G 75.

Verifieer nu het product via SEC-HPLC. Meet de hoeveelheid bij 280 nanometer en bevestig tevens de afwezigheid van onzuiverheden bij andere golflengten. Meng vervolgens 50 milligram van het pre-conjugaat met 200 MLEs van het antilichaam-geconjugeerde PEG-IDE in vijf milliliter van de pH 6,3 buffer.

Stel de concentratie van sulfhydrylgroepen in op 2 mM en incubeer gedurende drie uur bij 20 °C. Om een opbrengst van 98% te verkrijgen, laat men het gesolubiliseerde 3'-amino antisense-oligonucleotide reageren met één volume SPDP, zuivert men de AON-PDP via Cidex LH 20 in methanol, verdampt men vervolgens de methanol, lost men het product op in water en lyofiliseert men dit. Incubeer nu 800 nmol van de geactiveerde AO's gedurende de nacht met het antilichaam-PEG-preconjugaat aan MEA SH. Wanneer de disulfide-uitwisselingsreactie is beëindigd, wordt het fluorescerende kleurblok geïncorporeerd, waarbij de overtollige sulfhydrylgroepen met PDP worden geblokkeerd en via Cidex G 75 worden gezuiverd.

Bewaar het uiteindelijke nanogiststof op basis van polymaleïnezuur bij -20 °C. Om het polymaleïnezuurgehalte tijdens de productie te schatten, ga als volgt te werk: voeg aan 320 µL monster 160 µL 10% hydroxylammoniumchloride en 160 µL 10% natriumhydroxide toe. Meng dit na 10 tot 15 minuten met 160 µL 5% ijzer(III)chloride-oplossing en visualiseer de vorming van een donkerpaarse kleur bij 540 nm. Hydrolyseer vervolgensHet nanogiststof overnacht in 2 M zoutzuur bij 110 °C in een verzegelde ampoule en bepaal het maleïnezuurgehalte via reversed-phase chromatografie.

Gebruik monsters die zijn gespikeerd met maleïnezuurstandaarden. Splits nu het nanogemiddel met 100 millimolair dihydriedtol en meet de morpholino antisense-oligonucleotiden via kwantitatieve reversed-phase HPLC ten opzichte van morpho-ON-standaarden. Meet met het gesplitste nanogemiddel de antilichaamconcentratie met een eiwitassaykit om de Malik PEG-inhoud te kwantificeren.

Reageer eerst met ammoniumthiocyanaat, extraheer vervolgens met chloroform en meet de absorbentie bij 510 nanometers. Test de antilichaamactiviteit en co-ligatie via ELISA met gebruik van vijf µL nanomedicijn per putje en 0,5 µg per putje HER2 als plaatgecoat antigeen. Bereken tot slot het behaalde percentage voor het antisense-oligonucleotide, EG, en het antilichaam ten opzichte van maleïnezuur.

Vergelijk dit met het percentage dat is beoogd door het geneesmiddelontwerp. Deze bimodale strategische aanpak voor het nanogeneesmiddel maakt gebruik van Herceptin om de HER2-signaalroute te remmen en een HER2-specifieke antisense-oligonucleotide om de transcriptie van de HER2-receptor te blokkeren; antilichamen faciliteren transcytose via endotheliale TFR van het tumorvat. Het nanoconjugaatplatform polymaleïnezuur is geproduceerd met gekweekte microplasma en gezuiverd; het activeren van de PMLA-carboxylgroepen faciliteerde de synthese van het pre-conjugaatgeraamte.

En tot slot, het leidende nanoconjugaat. Eli SA-assays toonden aan dat actieve monoklonale antilichamen behouden bleven gedurende de synthese van het nanogeneesmiddel. Met beide antilichamen geassembleerd op hetzelfde polymeerplatform, werd de cellulaire opname van het nanogeneesmiddel gevolgd met fluorescentie-confocale microscopie.

De overgelegde beelden bij nul en drie uur werden samen met de gelabelde endosomen geanalyseerd. De correlatiecoëfficiënten van Pearson voor colocalisatie wijzen op de afgifte van het nanogesticum uit endosomen naar het cytoplasma en de dissociatie van een ON van het nanogesticum door een glutathion-afhankelijke splitsing van disulfidebindingen in het cytoplasma. In vitro remde het leidende nanogesticum de groei het meest effectief in de HER2-overexpresserende cellijn.

In vivo-experimenten bij muizen met BT 4 74, HER2-overexpressieve menselijke borstkanker, toonden een groeiremming van meer dan 95% door het leidende nanogeneesmiddel met Herceptin. Bovendien wees HER2-specifieke ex vivo Western blotting op remming van zowel de HER2-synthese als fosforylering van a KT; PARP-splitsing markeerde apoptose. De tumorregressie als reactie op de medicamenteuze behandeling wordt aangetoond door krimp van de tumor en uitputting van tumorcellen via histologisch onderzoek.

U heeft nu een goed begrip van hoe een biocompatibel nanoplatform kan worden gebruikt om een effectieve gepersonaliseerde behandeling zonder bijwerkingen te realiseren en hoe een nanogeneesmiddel met een gecontroleerde samenstelling en geverifieerde functionele activiteiten kan worden bereikt. Zodra deze methode onder de knie is, kunnen deze sensoren met een hoge reproduceerbaarheid worden uitgevoerd na de ontwikkeling ervan. Deze techniek, waarbij een polyacrylaat-nanoplatform wordt gebruikt voor de gerichte aflevering van antisense-oligonucleotiden, baant de weg voor onderzoekers in het veld van de gepersonaliseerde nanogeneeskunde om tumorbehandelingen te verkennen die zich richten op specifieke moleculaire tumormarkers die door gepersonaliseerde genetische analyse zijn geïdentificeerd. Farmacologisch actieve stoffen en cellen kunnen uiterst gevaarlijk zijn.

Er moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het dragen van een masker en handschoenen, bij het uitvoeren van deze procedure.