Name: Farmacologische Inductie van epidermale melanine en bescherming tegen zonnebrand in een gehumaniseerd muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Leer hoe forskolin epidermale melanine induceert in een muismodel met lichte huid en bescherming tegen UV-straling biedt. Deze methode helpt onderzoekers huidbescherming en melanoomrisico te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Malinda Spry bedanken voor technische bijstand. Wij huidige en vroegere financieringsbronnen erkennen ook: de National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), het Wendy Will zaak Kanker Onderzoek Fonds, de Markey Cancer Foundation, de Children&#39;s Miracle Network en de Jennifer en David Dickens Melanoma Research Foundation.

1. Voorbereiding van Forskoline voor topische toediening van een ruwe Root Extract van de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Plant <ol><li> Protocollen voor muizen experimenten volgde de richtlijnen voor het ethisch handelen in de zorg en het gebruik van dieren en werden goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de Universiteit van Kentucky (Protocol # 00768M2004). De wortel extract bestaat 40% gewicht / volume in een standaard dermatologische basis van 70% ethanol, 30% propyleenglycol. </li><li> Weeg 200 g ruwe forskolin wortel extract en overbrengen naar een beker. Aan 500 ml van een 40% (w / v) oplossing, mengen 200 g ruw forskoline wortel extract door toevoeging meeste maar niet alle van het volume van het voertuig (70% ethanol, 30% propyleenglycol) en brengen de oplossing ongeveer 450 ml. </li><li> Roer gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd. De oplossing zal enigszins viskeus zijn en kan met de hand agitatie vereisen om &quot;lift&quot; het extract in de oplossing voorhet roerstaafje in staat is om over te nemen. </li><li> Na een uur roeren, giet het mengsel in een maatcilinder en breng het volume op 500 ml met een voertuig dat is gebruikt om &quot;spoelen&quot; het bekerglas dat werd gebruikt om de suspensie te roeren (tot herstel van forskoline uit de beker te maximaliseren) . </li><li> Breng de massa tot 50 ml polypropyleen centrifugebuis. Centrifuge (1500 xg, kamertemperatuur, 15 min.) met een tafelblad centrifuge. Op dit punt zal het onoplosbare materiaal vrij verdicht, waardoor de supernatant gemakkelijk worden afgegoten. </li><li> Filtreer de oplossing door een 0,22 micrometer celluloseacetaat membraan achtergebleven onoplosbaar materiaal uit het extract te verwijderen. We gebruiken een fles-systeem is ontworpen voor celkweek, samen met het gebruik van pre-filters die bij het apparaat om voortijdige verstopping van het membraan van onoplosbare bestanddelen van de wortel extract te voorkomen. Bij het maken van grote hoeveelheden van het extract, filteren ongeveer 100 ml per keer, verandert het voorfilter between elke extra volume. </li><li> Wanneer bewaard bij kamertemperatuur, het extract onderhoudt biologische activiteit tot maximaal een jaar. </li></ol> 2. Voorbereiding van C57Bl / 6 K14-Scf muizen voor lokale behandelingen <ol><li> Verwijder dorsale bont van de dieren door een elektrische scheren. Kort verdoven de dieren met inhalatie isofluraan afschuiven van dorsale bont met elektrische scharen uitgerust met een 0,25 mm chirurgische voorbereidende hoofd (Fisher Scientific) te vergemakkelijken. Bij voorkeur alleen gebruik maken van een vorm van anesthesie (bijv. ketamine / xylazine) om het risico van een overdosis verdovingsmiddel te minimaliseren. De verzadigde inhalatiekamer draagt ​​arbeidsrisico&#39;s bij gebruik buiten een zuurkast en levert onbekende hoeveelheden verdoving dieren. Idealiter een precisie vaporizer worden gebruikt. </li><li> Om de resterende haren stoppels te verwijderen, te laten verzorgen met een chemische ontharingscrème. Dien anesthesie het dier met een ip injectie van ketamine 40 mg / kg en xylazine 4 mg / kg </li&gt; <li> Zodra dieren afdoende worden verdoofd (zoals beoordeeld door teen knijpen), breng dan een vingertop kleine hoeveelheid van ontharingscrème aan geschoren dorsale huid met een gehandschoende vinger. Wrijf de crème in de huid gedurende 30-60 seconden of totdat haren duidelijk zichtbaar in de room als deze wordt verplaatst. Laat de crème op alleen voor de minimale tijd die nodig is voor ontharing als langdurige blootstelling leidt tot chemische verbranding van de huid, afbraak epidermale en de dood van het verlies van epidermale integriteit. </li><li> Veeg de dorsale huid met water doordrenkte gaasjes totdat alle ijs is verwijderd. Droge dieren met behulp van zachte papieren handdoeken, en hen in staat stellen om te herstellen in een warme afgelegen locatie (bijvoorbeeld schone kooien geplaatst op een warming pad). Ontharen de dieren een voor een en op de voet tijdens de gehele procedure. </li></ol> 3. Lokale toediening van Forskoline of Vehicle Control <ol><li> Dieren dient dit te worden behandeld tegelijk. Kort verdoven met inhalerend isofluraan door het plaatsen van de muis op een vorm uitgerust nylonfilter luchtdoorlatende grond waarvan is geplaatst een-isofluraan verzadigde papieren handdoek in een-isofluraan verzadigde lidded helder glazen pot in een zuurkast. Expose de muis om isofluraan gedurende een voldoende tijd om vrijwillige spierbewegingen te onderdrukken, maar om spontane ademhaling (meestal 10-20 sec) te behouden. Het verlaten van het dier in isofluraan te lang zal leiden tot respiratoire onderdrukking en dood. Het is beter om het zekere voor de kant van &quot;going light&quot; met kort opnieuw bloot de muis om meer isofluraan dan overbelicht het dier aan de drug en het risico dood. </li><li> Verwijder het dier uit de isofluraan kamer en op een schone absorberende bankje pad. </li><li> Met behulp van een 1000 ui micropipet uitgerust met een wegwerp polypropyleen tip, stellen 400 ul van 40% ruwe forskolin extract (voertuigbeheersing dieren zullen 70% ethanol, 30% propyleenglycol alleen ontvangen). </li><li> Breng het extract op derug van het dier te druppelen zij op de huid en dan via de zijkant van de pipetpunt, smeer het extract via dorsale huid tot alle huid bedekt. Het is niet nodig om de huid na aanbrengen blot. </li><li> De terugkeer van de muis naar zijn kooi, en zorgvuldig te observeren totdat hij herstelt van anesthesie. </li><li> Om te voorkomen dat niet-pigment cAMP effecten niet UV gevoeligheid experimenten moeten beschamen, staken alle actuele behandelingen 2 dagen voor UV blootstelling (pigment effect duurt enkele dagen na de laatste lokale behandeling). </li></ol> 4. Skin Kleurmeet door Reflecterende Colorimetry <ol><li> Kort verdoven de muis met geïnhaleerde isofluraan (zie hierboven). </li><li> Kalibreer een Minolta colorimeter door het plaatsen van de draagbare hoofd op de gestandaardiseerde witte oppervlak voorzien van de colorimeter. </li><li> Plaats de draagbare meetkop van de colorimeter gelijk met de dorsale huid van het dier te zorgen dat de 1 cm 2 ronde aperture volledig gedrukt op de huid. Neem ten minste drie afzonderlijke metingen in verschillende gebieden van de dorsale huid. </li><li> Bereken de gemiddelde L * score ± SD per dier en per behandelingsgroep. Reflecterende colorimetrie kan gedaan worden op elk punt in het experiment. </li></ol> 5. Bepaling van de UV gevoeligheid door Berekening van &quot;Minimal Erythemateuze Dose&quot; (MED) <ol><li> Gebruik dieren die zijn voorbehandeld met ofwel drager of forskoline zoals hierboven beschreven. Verdoven dieren intraperitoneale injectie van een standaardmengsel van ketamine en xylazine (zie hierboven). </li><li> Bereid een stuk UV-occlusieve tape voor MED testen. Om gaten in de tape te genereren, gebruik dan een heavy-duty perforator met een 1 cm 2 cirkelvormige uitsparing (figuren 2A en B). Met gaten van een bepaalde grootte en symmetrische opstelling van de band vergemakkelijkt erkenning van veranderingen van de huid na bestraling. Over elk gat in de band, met een klein maar gemakkelijk afneembaar stuk<html> van tape die op bepaalde tijden kunnen worden verwijderd tijdens UV-blootstelling aan de toediening van verschillende doses UV toestaan. </li><li> Zodra de dieren voldoende worden verdoofd, plaats de tape op de rugzijde. Oogzalf moeten altijd worden gebruikt onder narcose. </li><li> Schakel de UV-bron bestaat uit twee Westinghouse F15T8UV-B lampen met een piekvermogen van 313 nm en een reeks 280-370 nm. Laat de lamp in evenwicht om een ​​constante UV-uitgang, zoals gemeten door een UV-fotometer met een UVB-sensor (duurt meestal een paar minuten voor de lampen op te warmen). </li><li> Op basis van de UV transmissiesnelheid zoals gemeten door de UV-fotometer Bereken UV belichtingstijd voor elke gewenste dosis. Bijvoorbeeld, UVB outputmaatregelen onze lamp 2,4 mW / cm 2. Daarom, om 5 kJ / m 2 dienen, zou de huid moeten worden blootgesteld aan 208 sec (die 3 min en 28 sec) UVB straling, zoals hieronder berekend: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Plaats verdoofde dieren (elk met occlusieve tape op zijn plaats) buikoppervlakte beneden om zelfs UV-blootstelling te garanderen. Om de gekozen doses van UV-straling toe te dienen, achtereenvolgens verwijder de kleine occlusieve tapes die de gaten om 1 cm 2 gebieden van de huid bloot te stellen aan de juiste doses straling. Daarom worden bij het ​​bovenstaande voorbeeld, als 40 kJ / m 2 de grootste dosis in het experiment, dan zou het dier onder de lamp voor 27 min en 47 sec totaal en de huid in de 40 kJ / m 2 staat zouden niet moeten bovenliggende tape de hele tijd. Toch zou tape bovenop de 5 kJ / m 2 toestand worden verwijderd wanneer er 208 seconden nog in de belichting. Timing van de tape verwijderen moet worden gedaan, zodat elke voorwaarde eindigt tegelijk. </li><li> Na blootstelling aan UV, haal de tape van de dorsale huid zorgvuldig, zorg ervoor dat u de huid met plotselinge of overdreven krachtige bewegingen rippen. Plaats dieren in een warme rustige plek omherstel van anesthesie. </li><li> Monitor muizen gedurende 24-48 uur te zoeken discrete gebieden van erytheem (roodheid) en oedeem (zwelling) overeenkomend met de anatomische gebieden blootgesteld aan de specifieke dosis UV bestraling. Documenteer huid bevindingen fotografisch. </li><li> MED correspondeert met de minimale dosis UV die de ontsteking veroorzaakt zoals gedefinieerd door erytheem en / of oedeem van de gehele cirkel blootgestelde huid. Merk op dat pigmentatie van de huid kunnen uitdagen bepaling van MED, echter, erytheem en oedeem kan nog steeds over het algemeen nauwkeurig worden geëvalueerd, mede dankzij de gedefinieerde vorm van de openingen in de band tijdens blootstelling aan UV. </li></ol> 6. Statistische analyse Analyseren van gegevens tussen cohorten van muizen door een weg ANOVA met Bonferroni na de test (Graph Pad PRISM). P-waarden &lt;0,05 worden beschouwd als statistisch significant.

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Met behulp van een diermodel van de lichte huid van de mens, vinden we dat de actuele toepassing van een forskolin rijk ruw extract van de wortel stevig donkerder de opperhuid door het stimuleren van de productie van melanine in de huid. Epidermale melanisatie is afhankelijk van de expressie van stamcel factor in de basale epidermis, zoals bij humane huid, maar niet in genetisch gemodificeerde muizen huid. De dorsale huid van genetisch gemodificeerde muizen onvoldoende aantallen interfolliculaire melanocyten pigment gev...

De incidentie van melanoom, de meest dodelijke vorm van huidkanker, is dramatisch toegenomen in de afgelopen decennia in de Verenigde Staten, met name bij lichte huid individuen. Sterke moleculaire en epidemiologische bewijs impliceert UV-straling als een belangrijke oorzakelijke factor milieu 2-5. Verhoogde UV blootstelling in de vorm van blootstelling aan de zon en zonnebank gebruik waarschijnlijk verantwoordelijk voor veel van de verhogingen van melanoom incidentie 6-7 zijn. Melanoom risico lijkt vooral verbonden met zonnebrand 8, vooral die vroeg in het leven 9-10. Risico van zonnebrand is niet alleen op de dosis en de intensiteit van UV-straling, maar ook door erfelijke factoren die cutane reactie op UV-straling beïnvloeden. Pigmentatie van de huid is een van de belangrijkste determinanten van de UV-gevoeligheid, het risico van zonnebrand en het risico op kanker. Melanoom komt voor ongeveer twintig keer vaker voor bij lichte huid personen in vergelijking met een donkere huidskleur individuatiels 11-13. Melanine, een pigment geproduceerd door melanocyten in de epidermis, is de belangrijkste determinant van de huid teint. Melanine komt in twee belangrijke soorten: (1) eumelanine, een donkerbruin / zwart pigment effectief in het absorberen van de energie van UV-straling en (2) pheomelanin, een rood / blond pigment minder effectief in het voorkomen penetratie van UV-fotonen in de huid. Huidskleur, UV-gevoeligheid en melanoom risico&#39;s worden grotendeels bepaald door de epidermale melanine gehalte 14-15. Hoe meer eumelanine in de epidermis, hoe minder UV fotonen in de huid doordringen. Vanwege de lage aangeboren niveaus van melanine, een lichte huid mensen zijn veel meer vatbaar voor acute en chronische effecten van UV-straling 16-18. Huidpigmentatie, melanoma&#39;s en de mogelijkheid om &quot;tan&quot; na UV-belichting alle correleren met de signalering vermogen van de melanocortine 1 receptor (MC1R), een Gs-gekoppelde zeven transmembraan surface receptor op melanocyten 19-22. Wanneer MC1R bindt zijn verwante hoge affiniteit ligand, α-melanocyt stimulerend hormoon (α-MSH), is de activering van adenylylcyclase en productie van het tweede messenger cAMP 23. De normale fysiologische reactie van de huid na blootstelling aan UV omvat epidermale productie van α-MSH door keratinocyten 24-29. Wij en anderen veronderstellen dat-keratinocyten afgeleide α-MSH bindt aan MC1R op epidermale melanocyten, het initiëren van downstream-productie van de cAMP tweede boodschapper door activatie van adenylylcyclase 30. cAMP niveaus controleren vele aspecten van melanocyten differentiatie, waaronder overleving routes, DNA-reparatie en pigment synthese. MC1R signalering en cAMP duidelijk induceren pigment enzymniveaus en eumelanine productie. Wanneer MC1R signalering is intact en melanocytaire cAMP niveaus zijn robuust, wordt eumelanine geproduceerd en de huid donkerder. Indien MC1R signalering defect encytoplasmatische cAMP niveaus laag blijven, wordt pheomelanin plaats 1 geproduceerd. Eumelanine synthese kan farmacologisch worden gestimuleerd door agenten die cAMP verhogen 1,14,31-35. Sinds het MC1R-eiwit is een belangrijke regulator van melanoom risico voor de mens 36-46, wij zijn geïnteresseerd in mechanismen waardoor MC1R beschermt melanocyten tegen UV-geïnduceerde carcinogenese. Als basis voor onze studies genereerden wij een transgene MC1R-variant muismodel op een zuivere C57BL / 6 genetische achtergrond 1. In dit model, stamcelfactor (SCF) wordt constitutief tot expressie gebracht in de basale epidermis en interfolliculaire epidermale melanocyten worden vastgehouden in de huid gedurende het leven 47, in tegenstelling tot de niet-transgene muizen waarin melanocyten lokaliseren de dermis in haarfollikels. Met de K14-Scf transgen opgenomen, wordt de epidermis gepigmenteerd met de specifieke melanine pigmenten kenmerk van het pigmentstam van het dier 1. K14-Scf muizen op de C57BL / 6 genetische achtergrond met wild type MC1R signalering hebben gitzwarte huid gekenmerkt door zeer hoge niveaus van melanine pigment. Niet verrassend, deze dieren zijn zeer UV-bestendig. Daarentegen genetisch matched K14-Scf C57BL / 6 dieren met een mutant inactief MC1R ophopen bijna geen melanine in de epidermis. In plaats daarvan, deze &quot;uitbreiding&quot; dieren (MC1R e / e) hebben een lichte huid teint wordt veroorzaakt door afzetting van pheomelanin pigment (Figuur 1A) en zijn veel meer UV-gevoelige 48-49. Farmacologische verbindingen met chemische eigenschappen die penetratie in de huid mogelijk is aangetoond krachtig eumelanine induceren in de verlenging (MC1R e / e) K14-Scf diermodel door direct manipuleren cAMP niveaus in epidermale melanocyten in de huid. Melanine opregulatie in dit model is r geweesteported van adenylaat cyclase activeren 1 als fosfodiesterase 4 inhibitie 35. In dit artikel tonen we aan de voorbereiding en de actuele toepassing van forskolin in extensie (MC1R e / e) K14-Scf dieren welk model de lichte huid UV-gevoelige mens. We laten zien dat tweemaal daags aanbrengen van het geneesmiddel bevordert de versnelde melanisatie, dat de huid donkerder is te wijten aan epidermale afzetting van melanine pigment en dat veroorzaakte epidermale melanine beschermt tegen UV-geïnduceerde zonnebrand door meting van de &quot;minimale erythemateuze dosis&quot; (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli extract 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurane, USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, USA</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Anased Injection</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, USA</td></tr><tr><td>Ketamine HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, USA</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, USA</td></tr><tr><td>Depilatory cream, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Radiometer photometer</td><td>International light</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA,USA</td></tr><tr><td>Chromameter</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>Data Processor for Chromameter CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

farmacologische inductie van epidermale melanine en bescherming tegen zonnebrand in een gehumaniseerd muismodel

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Eerlijke huid, UV gevoeligheid en het risico van huidkanker alle correleren met de fysiologische functie van de melanocortine receptor 1, een Gs-gekoppelde signalerende proteïne op het oppervlak van melanocyten. MC1R stimuleert adenylylcyclase en cAMP-productie die op zijn beurt op-reguleert melanocyt productie van melanine in de huid. Om de mechanismen die MC1R signalering beschermt de huid tegen UV-schade bestuderen deze studie wordt een muismodel met &quot;gehumaniseerde skin&quot; gebaseerd op epidermale expressie van stamcelfactor (SCF). K14-Scf transgene muizen behouden melanocyten in de epidermis en derhalve de mogelijkheid om melanine deponeren in de epidermis. In dit diermodel, wild type MC1R-status leidt tot robuuste afzetting van zwarte eumelanine pigment en een uv-bescherming fenotype. In tegenstelling, K14-Scf dieren met defecte MC1R signalering vermogen vertonen een rood / blond pigmentatie, heel weinig eumelanine in de huid eneen UV-gevoelige fenotype. Redeneren dat eumelanine afzetting zou kunnen worden versterkt door actuele agenten dat MC1R signalering na te bootsen, vonden we dat directe toepassing van forskolin extract om de huid van MC1R-defecte lichte huid muizen resulteerde in robuuste eumelanine inductie en UV-bescherming 1. Hier beschrijven we de werkwijze voor het bereiden en toepassen van een-forskolin met natuurlijke extract van de wortel naar K14-Scf lichte huid muizen en rapporteren van een methode voor het meten van UV-gevoeligheid door het bepalen van minimale erythemateuze dosis (MED). Met dit diermodel is het mogelijk om te bestuderen hoe epidermale cAMP inductie en melanisatie van de huid beïnvloeden fysiologische reacties op blootstelling aan UV.

C57BL / 6 muizen werden gegenereerd op eumelanotic, pheomelanotic of amelanotisch achtergronden waarin de K14-Scf transgen beschreven (Figuur 1A). Cohorten van lichte huid extensie (MC1R e / e, Tyr + / +) werden muizen die lokaal werden behandeld met tweemaal daags doses van het voertuig (70% ethanol, 30% propyleenglycol) of 40% ruwe Coleus forskohlii wortel extract (80 micrometer per dosis) gedurende 5 dagen (Figuur 2B). Effecten van actuele beha...

Epidermale melanine wordt geïnduceerd door topische applicatie van forskolin in een muizenmodel van de lichte huid UV-gevoelige mens. Farmacologische manipulatie van cAMP niveaus in de huid en epidermale donkerder sterk tegen UV-gemedieerde inflammatie (zonnebrand) zoals gemeten door de minimale erythemateuze dosis (MED) assay.

Farmacologische Inductie van epidermale melanine en bescherming tegen zonnebrand in een gehumaniseerd muismodel

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de UV-gevoeligheid te meten door de minimale erythemdosis te bepalen in lichtgekleurde muizen die zijn voorbehandeld met vier huiden. Dit wordt bereikt door eerst de dorsale huid van de muizen voor te bereiden op bestraling middels scheren en ablatie. Vervolgens worden topische behandelingen met forskoline aangebracht op de dorsale huid.Vervolgens worden de muizen blootgesteld aan verschillende doses UV-bestraling om de effecten van vier mediate meloen op UV-geïnduceerde ontsteking te bepalen. De resultaten laten zien dat topische toepassing van forline de huidpigmentatie robuust verhoogt en dat dieren met farmacologisch versterkte me UV-resistent zijn, zoals bepaald door de MED. Dit zijn proof-of-conceptstudies die aantonen dat het mogelijk is om farmacologisch een bruining op te wekken bij een individu dat niet in staat is tot bruinen vanwege een defect in een zeer belangrijk melanocytegen genaamd de melanocortine-1-receptor of MC1R. Bij menselijke populaties correleert het functieverlies van MC1R met UV-gevoeligheid, de neiging tot zonnebrand, het onvermogen om te bruinen en later in het leven een tot vier keer hoger risico op melanoom.We hebben scullin gekozen als geneesmiddel voor deze studies omdat het in staat is om een defecte signaleringsroute van de melanocortine-receptor te omzeilen en de melanocyten te misleiden door hen te laten 'denken' dat zij over een goed functionerende mc1R-signaleringsroute beschikken; hierdoor produceren ze veel melanine, dat in de huid wordt afgezet en de dieren beschermt tegen UV-straling. Hoewel we weten dat deze methode inzicht biedt in huid die kan zonnen, kan het mogelijk ook belangrijk zijn voor kankerpreventie.Aangezien bekend is dat UV-straling de belangrijkste carcinogeen is voor de overgrote meerderheid van de huidkankers, en het verbeteren van de implementatie van huidbescherming helpt tegen UV-schade, worden er intraperitonele injecties uitgevoerd. Zorg ervoor dat er wordt geaspireerd na het plaatsen van de naald en vóór het injecteren van de inhoud om te bevestigen dat de naald geen bloedvat, darmen of de urineblaas heeft gepenetreerd. IP-injecties moeten aan de rechterkant worden toegediend om de milt te vermijden. Nadat het forline-extract is voorbereid en de muis kortstondig is geanestheseerd met isofluraan.Inhalatie, volgens het tekstprotocol, dien aanvullende anesthesie toe aan het dier via een IP-injectie van ketamine en xylazine. Voer een knijptest bij de teen uit om de sedatie te verifiëren. Gebruik een elektrische trimmer uitgerust met een chirurgische voorbereidingskop van 0,25 millimeter om de dorsale vacht te trimmen.Gebruik een ontharingscrème om de stoppels te verwijderen. Gebruik vervolgens, om brandwonden of andere beschadigingen aan de huid te voorkomen, onmiddellijk met water verzadigde gaaskussentjes om de dorsale huid voorzichtig schoon te vegen totdat alle crème is verwijderd. Gebruik zachte papieren handdoeken om het dier te drogen voordat het in een schone kooi op een warmhoudmat wordt geplaatst om te herstellen.In het algemeen moeten muizen kortstondig worden geanestheseerd om topische toediening van forskoline of controle-oplossingen te vergemakkelijken, waarbij isofluoraan via inhalatie onder een zuurkast wordt gebruikt. Begin met een met isofluoraan verzadigde papieren handdoek in een met isofluoraan verzadigde, glazen pot met deksel. Nadat er een nauwsluitend, luchtdoorlatend nylon filter is bevestigd, wordt de muis geanestheseerd door deze net lang genoeg op het filter te plaatsen om vrijwillige spierbewegingen te onderdrukken, waarna het gesedeerde dier op een schoon, absorberend benchpad wordt geplaatst.Breng na het uitvoeren van een teenknijpoverdracht 400 µL ruw voorhoornextract aan op de rug van het dier door het op de huid te druppelen. Gebruik vervolgens de zijkant van de tip om het extract over het gehele oppervlak van de blootgestelde dorsale huid uit te smeren. Plaats de muis terug in de kooi en observeer deze zorgvuldig totdat het dier zich heeft hersteld van de anesthesie om pigmentverlies te voorkomen.Cyclische A MP effecten uit verwarrende experimenten naar UV-gevoeligheid. Sta alle topische behandelingen twee dagen vóór de UV-blootstelling stop om reflectiecolorimetrie uit te voeren. Na het kortstondig anesthetiseren van de muis via isofluoraan-inhalatie.Kalibreer een colorimeter door de draagbare kop op het gestandaardiseerde witte oppervlak te plaatsen dat bij het apparaat is geleverd. Plaats de draagbare meetkop vlak tegen de dorsale huid van het dier, waarbij u ervoor zorgt dat de ronde opening van één vierkante centimeter volledig tegen de huid wordt gedrukt. Voer ten minste drie afzonderlijke metingen uit in verschillende gebieden van de dorsale huid.Bereken de gemiddelde L-score, plus of minus de standaarddeviatie per dier en per behandelingsgroep. Om de minimale erythemogene dosis of MED te bepalen, wordt elk dier blootgesteld aan verschillende UV-dosissen. Begin met het voorbereiden van een stuk UV-occlusieve tape door een stevige pons te gebruiken met een ronde uitstansopening van één vierkante centimeter om gaten in de tape boven elk gat te ponsen.Met tape. Breng een klein, gemakkelijk verwijderbaar stukje tape aan dat kan worden losgemaakt. Plaats de tape voor UV-blootstelling op het dorsale oppervlak van de geanestheseerde muis.Indien de ogen van het dier openstaan, breng dan kunsttranen aan om letsel door uitdroging en UV-blootstelling te voorkomen. Zet de UV-bron aan, bestaande uit twee UVB-lampen met een piekoutput van 313 nanometer en een bereik van 280 tot 370 nanometer. Laat het lam acclimatiseren aan een constante UV-output voordat u een UV-fotometer met een UVB-sensor gebruikt om de output te verifiëren; bereken, op basis van de UV-transmissiesnelheid zoals gemeten door de UV-fotometer, de UV-blootstellingstijd voor elke gewenste dosis.Stel dat de UVB-opbrengst van uw lampen 2,4 milliwatt per vierkante centimeter bedraagt. Om dus vijf kilojoule per vierkante meter toe te dienen, moet de huid gedurende 208 seconden worden blootgesteld aan UVB-straling, zoals hier berekend. Plaats vervolgens een gesedeerd dier met de ventrale zijde naar beneden om een gelijkmatige UV-blootstelling te garanderen bij het sequentieel toedienen van de gekozen dosis straling.Verwijder op het juiste tijdstip de kleine stukjes plakband die de gaten afdekken. Als 40 kilojoules per vierkante meter bijvoorbeeld de hoogste dosis is, zou de muis 27 minuten en 47 seconden onder de lamp verblijven, en zou het gat voor deze dosis vanaf het begin worden blootgesteld. Voor de conditie van vijf kilojoules per vierkante meter zou het plakband echter na 208 seconden blootstelling worden verwijderd.Wanneer de tijd na UV-blootstelling is verstreken, wordt de tape voorzichtig verwijderd en worden de dieren op een warme, rustige plaats geplaatst om zich te herstellen van de anesthesie voordat ze terugkeren naar hun kooien. De minimale erythemoze dosis of MED-waarde komt overeen met de minimale dosis UV die ontsteking veroorzaakt, gedefinieerd als erytheem en/of oedeem van de gehele blootgestelde cirkel huid. Houd de muis 24 tot 48 uur in de gaten om te zoeken naar discrete gebieden van erytheem of oedeem in de UV-blootgestelde gebieden.Soms bemoeilijkt residuele eerste stoppels de interpretatie van de MED-testen door onderliggend erytheem of oedeem van de huid te maskeren; het bevochtigen van de huid met 70% ethanol maakt de huid veel beter interpreteerbaar. Documenteer alle huidbevindingen fotografisch en breng de muizen vervolgens terug naar de dierfaciliteit. In deze experimenten werden C 56 black six muizen gegenereerd op anodic anodic of anodic achtergronden met het K 14 stamcel-factor transgene, waardoor de muizen melanocyten in de epidermis behouden en als gevolg daarvan melanine afzetten.In de hier getoonde epidermis werden groepen fair skin extension-muizen vijf dagen lang tweemaal daags topicaal behandeld met respectievelijk het vehikel of 40% ruw wortelextract van Colus fors coly. De effecten van de topicale behandelingen op de epidermale pigmentatie werden bepaald via zowel visuele inspectie als reflectieve kleurbeeldvorming. De toepassing van het wortelextract was geassocieerd met een robuuste epidermale verdonkering in de K 14 SCF-transgene achtergrond, maar niet in genetisch overeenkomstige niet-transgene dieren, wat suggereert dat interfolliculaire epidermale melanocyten aanwezig moeten zijn om farmacologisch geïnduceerd melanine te kunnen afzetten.In de epidermis, hoewel het wortelextract diep gekleurd is vanwege de aanwezigheid van fytochemicaliën uit planten naast vier galin, kan de huidverdonkering niet uitsluitend worden toegeschreven aan een kleureffect van het drugumiddel. Aangezien niet-transgene dieren geen huidverdonkering vertoonden bij topische toepassing van het wortelextract tweemaal daags, zoals hier wordt gedemonstreerd, werden de melanine-effecten van forskoline al na twee dagen opgemerkt. Hoewel maximale verdonkering pas na enkele extra dagen duidelijk werd, zoals in deze figuur wordt getoond door font mason en melaninekleuring van dorsale huidsecties.De mate van melaninevorming is dosisafhankelijk; dieren die één keer per dag gedurende 15 dagen of twee keer per dag gedurende vijf dagen met four skin werden behandeld, vertoonden vergelijkbare hoeveelheden huidverdonkering. Daarnaast waren er in geen van beide behandelgroepen duidelijke toxische effecten waarneembaar na blootstelling aan four skin. We concludeerden derhalve dat de versnelde behandeling van vijf dagen een veilige melaninevorming van de dorsale huid bevorderde, net zo effectief als de standaard behandeling van één keer per dag.Deze figuur laat zien dat, zoals gemeten via MED-testen, door forgalin geïnduceerde epidermale verdikking resulteerde in een aanzienlijke UV-bescherming, terwijl de gemiddelde MED voor K 14 SCF-extensiemuizen die vijf dagen lang tweemaal per dag met het vehikel werden behandeld, 5,0 ± 0,0 kilojoules per meter vier was. De gemiddelde MED voor cohorten die behandeld werden met topische forgalin was groter dan 30,0 ± 0,0 kilojoules per meter vier. In feite was een dosis van 30,0 kilojoules per meter vier onvoldoende om erytheem op te wekken. In dit experiment met standaard forgalin-dosering was de gemiddelde MED voor behandelde K 14 SCF-extensiemuizen 50,0 ± 7,1 kilojoules per vierkante meter.Belangrijk is dat de voorbehandeling met foriline de MED niet beïnvloedde bij dieren die niet in staat waren tot melanineproductie, Dette kwam ofwel door het ontbreken van K 14 SCF-gemedieerde epidermale melanocyten, of door een tyrosinase-deficiëntie. Aangezien de toepassingen van foriline twee dagen vóór de UV-blootstelling waren gestaakt en na de UV-blootstelling niet werden hervat, concluderen wij dat niet-pigmentaire CAMP-effecten geen rol speelden in de MED-resultaten. De gegevens suggereren juist dat epidermale melanine het mechanisme was waarmee foriline UV-bescherming induceerde in dit model.Zodra deze techniek onder de knie is, maakt ze een eenvoudige en reproduceerbare beoordeling van de respons van de huidpigmentatie en de ultravioletgevoeligheid mogelijk. Bij toepassing in diermodellen neemt het aanbrengen van de forland slechts enkele minuten per dag in beslag; het grootste deel van de experimentele tijd wordt daadwerkelijk besteed aan de UV-bestraling en de MED-testen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de huid geleidelijk terugkeert naar haar farmacologische basislijn van een lichte teint.De inductie van melanine vertoont grote gelijkenissen met de reactie op nain, in die zin dat de huid donker blijft zolang deze wordt gestimuleerd, maar dat deze bruining gedurende de volgende weken geleidelijk uit de huid verdwijnt zodra de stimulus wordt weggenomen.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In this video, human-derived melanoma cells are implanted subcutaneously into the flank region of an immunocompromised mouse. The PDX model allows preclinical investigation of melanoma cells that better recapitulate the tumor heterogeneity and melanoma aggressiveness observed in in vivo conditions.

Patient-derived Xenograft Modeling: A Technique to Generate Melanoma Mouse Models

This video describes the procedure to induce two-stage skin carcinogenesis to study tumor initiation by topical application of chemicals. In the first step, a mutagen, DMBA, is applied onto the skin of a mouse model which initiates tumor formation by causing mutations in the stem cells, followed by the application of a growth stimulator, TPA, which accelerates skin papilloma formation.

Chemical-induced Two-stage Skin Carcinogenesis Model: An Experimental In Vivo Mouse Model of Skin Cancer

This video describes a method to measure UV sensitivity in a humanized mouse model—a mouse model that mimics human skin. We determine the minimal erythematous dose (MED) of UV radiation that can cause erythema or edema on the skin. The method can help to find out the efficacy of drugs used to reduce UV sensitivity.

Minimum Erythematous Dose Assay: A Method for Measuring UV Sensitivity in Mouse Models

We beschrijven drie experimentele methoden voor de evaluatie van de activiteit van de verdikking van chemische stoffen in vitro: kwantificering van 1) cellulaire tyrosinase-activiteit en 2) melanine inhoud, en 3) meting van melanine door cellulaire melanine kleuring en beeld-analyse.

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Tweetraps huid carcinogenese wordt geïnduceerd door twee topisch toegepaste chemicaliën. Een mutagene stof 7, 12-dimethylbenz [a] anthraceen) veroorzaakt mutaties in de epidermale cellen en een continue toepassing van de algemene groeistimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat versnelt de vorming van papillomavirus.

Chemisch-geïnduceerde huid carcinogenese model met behulp van Dimethylbenz [a] anthraceen en 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetaat (DMBA-TPA)

Het doel van dit protocol is om voorbijgaande in vivo productie van niet-dodelijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren, waardoor fysiologische reacties in het weefsel verder worden bevorderd.

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Het protocol beschrijft een onderzoek naar de systemische en lokale huideffecten van blootstelling aan ultraviolet B bij muizen.

Onderzoek naar chronische blootstelling van muizen aan ultraviolette B-straling 

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van voortijdige veroudering in HNM met behulp van tBHP, gestandaardiseerde protocollen voor het analyseren van belangrijke senescentiemarkers, waaronder groeistop, SA-β-galactosidase-activiteit en SASP-factoren.

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in primaire menselijke melanocyten met behulp van tert-butylhydroperoxide

Leer hoe forskolin epidermale melanine induceert in een muismodel met lichte huid en bescherming tegen UV-straling biedt. Deze methode helpt onderzoekers huidbescherming en melanoomrisico te bestuderen.

Farmacologische Inductie van epidermale melanine en bescherming tegen zonnebrand in een gehumaniseerd muismodel

Meer video's verkennen