Name: Kwantitatief In vitro Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer een kwantitatieve neutrofieladhesie-assay voor inflammatieonderzoek met humane microvasculaire endotheelcellen. Deze methode meet fluorescerende neutrofilen en helpt bij het begrijpen van ontstekingsreacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Ministerie UCSF van Anesthesie en perioperatieve zorg.

1. Plating en onderhoud van microvasculaire endotheelcellen <ol><li> Ontdooien en groei van uw microvasculaire endotheelcellen volgens de fabrikant geleverd. In dit protocol werden de cellen gekweekt in EGM-2 MV media (Lonza), en het wordt aanbevolen dat alle experimenten worden uitgevoerd binnen twee weken na het ontdooien om elke wijziging te wijten aan passagenummer minimaliseren. Onze experimenten met HMVEC-Lung worden uitgevoerd tussen passages 4-9. </li><li> Dag 1: Wanneer de cellen bereiken 80-90% confluentie, trypsinize en resuspendeer bij 120.000 cellen per ml. Plaat 36000 cellen (0,3 ml) per putje in 48-well, polystyreen weefselkweek plaat (s). Inclusief putjes van HMVEC die niet worden geïncubeerd met neutrofielen om een achtergrond fluorescentie aflezing. Tenzij met 48-well platen die speciaal voor fluorescentie-assays, afwisselende rijen of kolommen zal geen licht vervuiling van naburige putten minimaliseren. OPMERKING: Wells kan vooraf bekleed met poly-Lysine, collageen of fibronectine. </li><li> Dag 2: Voeg verse media. </li><li> Dag 3: Door fasecontrastmicroscopie, bevestigen de cellen gezond zijn (dwz &quot;kinderkopjes&quot; uiterlijk en kleine cel puin), en ze zijn 100% confluent (figuur 1). Als de cellen zijn niet 100% samenvloeiing, veranderen de media elke dag tot ze klaar zijn. </li><li> Zodra de HMVEC monolagen klaar zijn voor de behandeling, was de cellen eenmaal met Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en voeg 0,3 ml vers EGM-2 MV media of media met inflammatoire agonist aan de juiste putten. In dit protocol werden de HMVEC-Lung behandeld met TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) gedurende 3 uur omdat dit een goed beschreven activator van EC 21. OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat u de tijd van uw experiment, zodat uw geactiveerde HMVEC cellen (Stap 4.1) en calceïne AM gelabelde neutrofielen (Stap 3.5) zijn klaar om te gebruiken op hetzelfde moment. Het kost ons ongeveer 2,5 uur te isoleren en te labelen neutrophils. </li></ol> 2. Neutrofielen Isolatie behulp Polymorphprep <ol><li> Isoleer neutrofielen zoals hiervoor 22 beschreven, of met een kant en klare dichtheidsgradiënt oplossing polymorfonucleaire granulocyten isoleren uit volbloed. Gebruikmakend Polymorphprep volgens het protocol dat door Nuzzi, et al.. 2007 resulteert in opbrengsten van ongeveer 2-3 x 10 6 neutrofielen per ml volbloed 23. OPMERKING: Om te voorkomen dat overmatig erytrocyten lysis, een dextransedimentatie om rode bloedcellen te verwijderen kan worden uitgevoerd voorafgaand aan dichtheidsgradiëntcentrifugatie 24. </li><li> Breng de Polymorphprep dichtheidsgradiënt oplossing voor RT. </li><li> Verzamel 30 ml vol bloed van een gezonde menselijke vrijwilligers in aanwezigheid van een anti-stollingsmiddel zoals heparine, EDTA of citraat. Het bloed moet worden gebruikt binnen 2 uur, en bleef tussen 18-22 ° C. </li><li> Laag 5 ml volledig bloed over 5 ml van de dichtheidsgradiënt oplossing in een 15 ml conische buis ( <strong&gt; Figuur 2A). Voorkom wijzigingen hoeveelheden bloed en de dichtheid gradiënt oplossing omdat dit de daaropvolgende centrifugeren omstandigheden kunnen veranderen. </li><li> Centrifugeer bij 450 xg gedurende 30 min bij 18-22 ° C. Zorg ervoor dat u langzaam versnellen en neer de centrifuge (dwz zet de centrifuge rem), en de balans van de buizen goed om trillingen te voorkomen dat te helpen verminderen activatie van de neutrofielen en de vermenging van de lagen te voorkomen. Langere tijden centrifugeren of hoger centrifugaalkracht zal resulteren in de onderste laag leukocyten, neutrofielen die bevat om verder migreren naar de gepelleteerde rode bloedcellen. </li><li> Zuig het plasma en leukocyten bovenste band met PBMC&#39;s tot de verontreiniging van de laag met neutrofielen (figuur 2B) te voorkomen. </li><li> Gebruik een 1-2 ml serologische pipet om de onderste leukocyten laag met neutrofielen te verwijderen. Combineer de neutrofielen lagen in 30 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) in een 50 mlconische buis. </li><li> Breng het volume tot 50 ml met PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en gecentrifugeerd bij 450 xg gedurende 10 min bij 18-22 ° C. </li></ol> Opmerking: Stappen 2.9 en 2.10 zijn optioneel, maar sterk aanbevolen. <ol start="9"><li> Het supernatans aspireren. Resuspendeer de neutrofielen in 8 ml steriel water gedurende 30 seconden om rode bloedcellen te lyseren, onmiddellijk de celsuspensie toe te voegen aan 2 ml 5x PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en meng met de hand. NIET cellen geïncubeerd in water langer dan 30 sec sinds significante neutrofiel dood kan optreden. </li><li> Centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C. </li><li> Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +) en centrifugeer opnieuw bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C. </li><li> Resuspendeer de neutrofielen in 10 ml RPMI-1640 (zonder fenolrood) en tel de levende cellen met behulp van de trypan blue werkwijze voor kleurstofuitsluiting. Vermijd langdurige celdichtheden groter dan 5 x 10 6 per ml aangezien dit kan leiden tot activatie van de neutrofielen. </li></ol> 3. Neutrofielen Labeling met Calcein AM <ol><li> 6 x 10 5 neutrofielen per putje van een 48-wells plaat. </li><li> Na het tellen, de overdracht van de geresuspendeerde cellen een ml conische buis 50 en verdun de neutrofielen tot 2-4 x 10 6 cellen per ml met fenol rood-vrij RPMI-1640. </li><li> Voeg calceïne AM stockoplossing aan 3 uM (dwz 2,98 ul van calceïne AM voorraad (1 mg / ml) per ml van de media) en meng goed door voorzichtig flicking de buis. Groter dan 5 uM calceïne AM zal resulteren in lekkage van de neutrofielen. Let op: Niet-fluorescerende calceïne AM is gesplitst in de cellen door endogene esterases aan de sterk fluorescerende molecule calceine (dwz dode cellen zullen niet fluoresceren) produceren. </li><li> Bedek de buis met aluminiumfolie en incubeer fof 30 min bij 37 ° C in het donker. Opmerking: Langere incubatietijden kunnen tot meer calceïne bevrijd van neutrofielen in de loop van de adhesietest. </li><li> Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C, en was de neutrofielen 2x met 10 ml RPMI-1640 (zonder fenolrood, voorverwarmd tot 37 ° C). Na resuspenderen van de cellen voor de tweede maal spoelen, eerst langs de neutrofielen hoewel een 40 uM steriel filter om klonten te verwijderen en centrifugeer weer bij 450 g gedurende 5 minuten bij 18-22 ° C. </li><li> Resuspendeer de neutrofielen in RPMI 1640 (zonder fenolrood, voorverwarmd tot 37 ° C) en 2 x 10 6 neutrofielen per ml. </li></ol> 4. Neutrofiel Binding Assay <ol><li> Was de HMVEC monolagen 3x met 0,5 ml filter-gesteriliseerd (0,22 urn) RPMI 1640 (zonder fenolrood) met 3% BSA per well. </li><li> Zuig het medium en voeg 6 x 10 5 calceïne-gelabelde neutrofielen (0,3 ml cel suspension), of 0,3 ml RPMI 1640 (zonder fenol rood) zonder neutrofielen, om de geschikte putjes van de 48-well plaat. Opmerking: Dit is het equivalent van 8 x 10 5 neutrofielen per cm 2. </li><li> Incubeer gedurende 20 min in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. </li><li> Totaal Neutrofiel Fluorescentie (PRE wasbeurt): Meet de fluorescentie-intensiteit van elk putje met een excitatie golflengte van 485 nm en een emissie golflengte van 520 nm (fluoresceïne filter set) in een Fluostar, of gelijkwaardig, spectrofotometer. Voer deze stap vlak voor de incubatie eindpunt Opmerking: In dit protocol werden calceïne excitatie en detectie van het uitgezonden licht uitgevoerd vanaf de bovenkant van de onbedekte putten, maar beide kunnen ook worden uitgevoerd vanaf de bodem van de putjes.. </li><li> Was de putjes die HMVEC monolayers en neutrofielen 5x met 0,5 ml per putje van PBS (w / Ca2 + en Mg2 +). Verwijder het medium en wassendoor het omkeren van de plaat, en zachtjes deppen op papieren zakdoekjes om de resterende vloeistof te verwijderen. </li><li> Voeg rug 0,3 ml RPMI 1640 (zonder fenol rood) per well. </li><li> Hechtende neutrofielen Fluorescentie (POST wasbeurt): Meet de fluorescentie-intensiteit van elk putje als in stap 4.4. </li><li> Bepaal het percentage hechting en relatieve hechting per put: </li></ol> Opmerking: In dit stadium, kunnen beelden van de calceïne-gemerkte neutrofielen worden verkregen door toepassing van een fluorescentie microscoop staat met standaard fluoresceïne filters. De afbeeldingen in figuur 4 werden verkregen op een Olympus IX51 omgekeerde microscoop uitgerust met een Retiga 2000R camera (Q Imaging) met behulp van Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules%3A+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+binding+of+NAP-1%2FIL-8%3A+role+in+neutrophil+emigration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li>
<li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-activating+protein+1%2Finterleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b%2FCD18+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li>
<li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li>
<li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li>
<li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+Cinderella+of+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li>
<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li>
<li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li>
<li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22The+Handbook%3A+A+Guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labelling+Technologies%22">The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies</a>. , 10, (2005).</li>
<li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li>
<li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK5+protein+promotes%2C+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates%2C+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li>
<li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745(2008).</li>
<li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).</li>
<li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li>
<li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+%28mitogen+activated+protein+kinase%29+inhibitor+RWJ+67657%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li>
<li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent%2C+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li>
<li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li>
<li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li>
<li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes%2C+monocytes%2C+and+related+leukocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li>
<li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1%2C+endotoxin%2C+and+tumor-promoting+phorbol+diesters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li>
<li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li>
<li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li>
<li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelium%3A+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li>
<li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li>
<li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li>
<li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease%3A+a+Jack+of+all+trades%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li>
<li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Wegener%26%2339%3Bs+granulomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+de+Medecine+Interne%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Wegener&#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li>
<li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stappen voor een succesvolle neutrofielen / microvasculaire endotheelcel adhesie test zijn: 1) het gebruik van lage passage nummer (&lt;9), gezonde endotheelcellen, 2) handhaven van de geïsoleerde neutrofielen bij een lage dichtheid (dat wil zeggen &lt;5 x 10 6 cellen / ml) en het gebruik ervan binnen twee uur van isolement, en 3) Fastidious wassen van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen en het gebruik van de calceïne AM-gelabelde neutrofielen tijdig aan EG vervuiling en verlies ...

Aangezien het vasculaire endotheel in direct contact met het circulerende bloed wordt uniek gelegen om een ​​snelle ontstekingsreactie tijdens infectie of letsel leiden. Endotheelcellen (EC) express patroonherkenning receptoren die verschillende geconserveerde bacteriële bestanddelen gevaar moleculen herkennen en receptoren voor gastheer inflammatoire mediatoren zoals TNFa. Activering van deze receptoren induceert EC aan cytokinen (bijvoorbeeld IL-6, IL-8, CXCL1 en CCL2) afscheiden, en adhesiemoleculen (bijv. E / P-selectine, VCAM-1 en ICAM-1) opreguleren hun celoppervlak 1 , 2. Deze moleculen allemaal om de gastheer van de infectieuze agentia wissen en initiëren weefselherstel 3,4 vergemakkelijken lokalisatie van leukocyten naar plaatsen van infectie en verwonding. De neutrofiel respons op infectie gaat een goed gecoördineerde wisselwerking tussen het vasculaire endotheel en de reagerende neutrofielen. Na activatie EC, IL-8 wordt afgescheiden en vormt een intravasculaire gradiënt op het endotheel die neutrofielen maakt om thuis op de plaats van infectie of letsel 5,6. E / P-selectines bemiddelen neutrofielen afvang en rollend door relatief zwakke associaties met glycomoleculen op de neutrofielen celoppervlak. Deze interacties met IL-8-binding aan zijn verwante receptor, vergemakkelijken de robuuste, integrine-gemedieerde hechting en eventuele arrestatie van neutrofielen op de endotheliale celoppervlak 7-10. Na arrestatie kan neutrofielen migreren uit de vasculatuur voor de locaties van infectie direct pathogene schimmels, produceren neutrofielen extracellulaire vallen om de verspreiding van ziektekiemen te voorkomen, bevordering van wondgenezing en laat andere factoren die rekruteren andere leukocyten zoals monocyten, macrofagen en dendritische cellen 11-17. Beschreven in dit rapport is een in vitro methode om neutrofielen aanhankelijkheid kwantificeren om microvascular EC na activering door de gastheer inflammatoire mediator TNF. Deze test is bedoeld om de activering van EC en niet neutrofielen beoordelen. Primaire menselijke neutrofielen zijn eerst geïsoleerd met behulp van dichtheidsgradiënt scheiding, en worden dan gelabeld met calceïne acetoxymethyl (AM). Esterases binnen de levende cellen hydrolyseren calceïne AM om de sterk fluorescerende calceïne molecuul met een excitatie van 492-495 nm en emissie van 513-516 nm 18. Het fluorescentie-gemerkte neutrofielen vervolgens geïncubeerd met EC monolagen en niet-hechtende neutrofielen worden vervolgens verwijderd. De fluorescentie van de resterende, gebonden neutrofielen wordt vervolgens gemeten met een fluorescentie spectrofotometer, en berekend als percentage van totaal neutrofielen fluorescentie ingang per putje. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat de gebonden calceïne gemerkte neutrofielen in spectrometrie direct worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie een meer kwalitatieve uitgelezen uit EG ac gevenzendvermogen. Aangezien deze assay wordt uitgevoerd onder statische omstandigheden, zal alleen de eerste gebeurtenissen die plaatsvinden in de neutrofiel adhesie cascade worden beoordeeld. Dit wordt bevestigd in dit verslag met E-selectine blokkerende antilichamen aan dat neutrofielen aanhankelijkheid aan TNF-behandelde menselijke long microvasculaire EC (HMVEC-Lung) monolagen wordt drastisch verminderd wanneer de interactie met E-selectine wordt verstoord zien. Naast TNFa, hebben we met succes deze assay om de omvang van humane navelstreng EC (HUVEC) activering bepalen door Toll-like receptor 1/2 agonisten peptidoglycan-geassocieerde lipoproteïne (PAL), mureïne lipoproteïne (MLP) en Pam3Cys en HMVEC-Lung activering door Pam3Cys 19,20. Daarnaast hebben we met succes deze test met kinase remmers en na RNAi-gemedieerde knockdown van oppervlakte-en cytoplasmatische eiwitten in HMVEC-Lung, wat suggereert dat deze methodologie is compatibel met een verscheidenheid van biochemische en screening assays 20. Kortom, dit assay geeft een eenvoudig, reproduceerbaar, meer functionele manier te gebruiken om de mate van activering van EG ontstekingsmediatoren in vitro.

<table><tbody><tr><td>HMVEC-Lung</td><td>Lonza</td><td>CC-2527</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>Kan vervangen worden door elke leverancier</td></tr><tr><td>48-well Tissue Culture Plates</td><td>BD Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>PBS (zonder fenol rood)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL001</td><td>Kan vervangen worden door elke leverancier</td></tr><tr><td>D-PBS (zonder Ca2+ en Mg2+ en fenol rood)</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td>CCFAL003</td><td>Kan vervangen worden door elke leverancier</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (zonder fenol rood)</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114683</td><td></td></tr><tr><td>calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3099</td><td>(0,995 mM) stock soln</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;M filters</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Kan vervangen worden door elke leverancier</td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer</td><td>BMG LABTECH</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatief<em&gt; in vitro</em&gt; assay om neutrofieladhesie maatregel om activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Het vasculaire endothelium speelt een integrale rol in de ontstekingsreactie. Tijdens de acute fase van ontsteking, zijn endotheelcellen (EC) geactiveerd door gastheer bemiddelaars of rechtstreeks door geconserveerde microbiële componenten of gastheer-afgeleide gevaar moleculen. Geactiveerde EC express cytokinen, chemokinen en adhesiemoleculen die mobiliseren, activeren en handhaven leukocyten op de plaats van infectie of letsel. Neutrofielen zijn de eerste leukocyten te komen, en zich aan het endotheel via diverse adhesie moleculen op de oppervlakken van beide cellen. De belangrijkste functies van neutrofielen zijn om direct te elimineren microbiële bedreigingen, de indienstneming van andere leukocyten te bevorderen door het vrijkomen van aanvullende factoren en initiëren wondheling. Daarom is hun werving en gehechtheid aan het endotheel is een cruciale stap in de initiatie van de ontstekingsreactie. In dit rapport beschrijven we een in vitro assay met neutrofieladhesiecalceïne AM-gelabelde primaire humane neutrofielen de omvang van microvasculaire endotheelcel activatie kwantificeren onder statische omstandigheden. Deze werkwijze heeft het bijkomende voordeel dat dezelfde monsters gekwantificeerd d.m.v. fluorescentie spectrofotometrie ook direct worden gevisualiseerd middels fluorescentiemicroscopie voor een kwalitatieve beoordeling van neutrofiel binding.

Om betrouwbare, reproduceerbare resultaten met neutrophil bindingstest verkrijgen, is het essentieel dat de gezondheid en de confluentie van de microvasculaire endotheelcellen optimaal op de dag van de assay, zoals geïllustreerd HMVEC-Lung in figuur 1. Daarnaast is het noodzakelijk dat lage passage aantal microvasculaire EC&#39;s worden gebruikt (dwz minder dan 9 passages), en bijgevolg, raden wij u aan alle experimenten binnen twee weken na het ontdooien. De gezondheid van de neutrofielen is t...

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor de<em&gt; In vitro</em&gt; Kwantificering van primaire humane neutrofiel binding aan endotheelcellen geactiveerd door ontstekingsmediatoren onder statische omstandigheden.

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mate van inflammatoire activatie van microvasculaire endotheelcellen te bepalen door het relatieve aantal neutrofielen te kwantificeren dat in vitro onder statische condities aan de endotheelcellen hecht. Dit wordt bereikt door in de tweede stap gezonde, confluente monolagen van microvasculaire endotheelcellen te behandelen met de gewenste experimentele stimulus. Neutrofielen van gezonde menselijke vrijwilligers worden geïsoleerd en vervolgens gelabeld met calcium am.Vervolgens worden de gelabelde neutrofielen toegevoegd aan de endotheelcellen en 20 minuten de tijd gegeven om te hechten, waarbij gedurende deze periode een pre-wash meting wordt uitgevoerd via fluorescentiespectrometrie. In de laatste stap worden de niet-adherente neutrofielen weggewassen, waarna een post-wash meting wordt verkregen. Uiteindelijk kan het percentage en de relatieve adhesie van de met calcium gelabelde neutrofielen aan de endotheelcellagen onder elke behandelingsconditie worden bepaald.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de menselijke inflammatoire biologie, aangezien hiermee de relatieve mate van inflammatoire acti

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

In this video, we demonstrate an assay utilizing fluorescence microscopy to detect the adhesion of cancer cells to neutrophil extracellular traps (NETs). In the test wells, there is a notable increase in the number of fluorescently labeled cancer cells adhering to NETs, whereas wells treated with DNase exhibit reduced cancer cell adhesion to NETs.

In Vitro Adhesion Assay to Detect the Adherence of Cancer Cells to Neutrophil Extracellular Traps

Neutrofiele trans-epitheliale migratie als reactie op mucosale bacteriële infectie draagt bij aan epitheelletsel en klinische ziekte. Er is een in vitro model ontwikkeld dat pathogene, menselijke neutrofielen en gepolariseerde menselijke epitheelcellagen combineert die op transwellfilters zijn gekweekt om onderzoeken naar het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die dit fenomeen orkestreren te vergemakkelijken.

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Leer een kwantitatieve neutrofieladhesie-assay voor inflammatieonderzoek met humane microvasculaire endotheelcellen. Deze methode meet fluorescerende neutrofilen en helpt bij het begrijpen van ontstekingsreacties.

Kwantitatief In vitro Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden (Video) | JoVE Journal

Kwantitatief

Meer video's verkennen