Microfabricage van Nanoporeuze Gold Patronen voor Cell-materiaal Interaction Studies
15 juli 2013
Wij rapporteren over technieken micropattern nanoporeuze gouden dunne films via stencilafdruk en fotolithografie, alsook werkwijzen cultuur brengen van cellen op microschaal vervaardigde patronen. Verder beschrijven we beeld analysemethoden morfologie van het materiaal en de gekweekte cellen met behulp van scanning elektronenmicroscopie en fluorescentie microscopie technieken karakteriseren.
Het algemene doel van deze procedure is om nano poreuze gouden micropatronen te fabriceren en hun compatibiliteit met celkweek aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst stencil of fotolitografische maskers te maken. De tweede stap is om goud en zilver door de maskers heen te co-sputtering om het precursorlegering voor nano poreus goud te patrooneren.
Vervolgens worden de goud-zilverlegeringpatronen ontlegerd in salpeterzuur om nano poreuze gouden coatings te produceren. De laatste stap is om cellen over de nano poreuze gouden micropatronen te kweken en ze immunote verven. Uiteindelijk worden fluorescering en scanning elektronenmicroscopie gekoppeld aan beeldanalyse gebruikt om celmateriaalinteracties te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere methoden voor het creëren van nanogestructureerde coatings, zoals koolstofnanobuizen, is dat nano poreus goud profiteert van microfabricatiecompatibiliteit, hoge effectieve oppervlakte, gemak van functionelering met tegelgebaseerde chemie, elektrische geleidbaarheid en biocompatibiliteit.
Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden in de materialenwetenschap en bio-engineeringvelden, zoals het effect van materiaalnanostructuur op elektrische, mechanische, biologische en chemische eigenschappen. Hoewel deze methode inzicht biedt in het effect van nanostructuur op celmorfologie. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals de ontwikkeling van biosensoren, geneesmiddelafgiftesystemen en energieopslagplatforms.
Begin deze procedure door één inch bij drie inch microscoopglazen en kleine dekvlakken te reinigen met een piranha-oplossing. Laad de kleine dekvlakken in een porseleinen immunokleuringsboot en dompel de boot en het microscoopglaas in de piranha-oplossing. Zie het tekstprotocol voor details over de reinigingsprocedure. Na het reinigen, breng de monsters over naar kristallisatiekommen en spoel ze drie minuten met di water.
Plaats de monsters op pluisvrije handdoeken en droog ze met een stikstofpistool. Om millimeter-schaalpatronen te creëren. Prik 250 micron dikke siliconenelastomeerbladen met een biopsiepomp. Reinig de verwerkte elastomeerbladen door ze te onderdompelen in 70% isopropanol en droog ze vervolgens met een stikstofpistool.
Plaats vervolgens de ponsplaat op een pluisvrije handdoek en lijn de gereinigde dekvlakken uit over de stencil met de monsteroppervlak gericht naar de stencil. Breng de stencil met de dekvlakken over naar een dragerwafer om sub-millimeter-schaalpatronen te creëren. Plaats een schoongemaakt microscoop, schuif op een draaiende klus en blaas eventuele deeltjes weg met een stikstofpistool.
Dos 1,5 milliliter hexamethyl dilane op het glazen schuifje. Verspreid de hexamethyl dilane met behulp van een plastic pipet door de schuif succesvol te draaien met 500 RPM gedurende vijf seconden en 1500 RPM gedurende 30 seconden. Wanneer u klaar bent, bakt u de schuif op een hete plaat bij 115 graden Celsius gedurende zeven minuten en laat u hem vervolgens vijf minuten afkoelen.
Vervolgens, doseert u vier milliliter van een positief foto. Weerstand op de glazen schuif. Verspreid de fotoweerstand door de schuif te draaien met de eerder beschreven voorwaarden.
Bak de schuif op een hete plaat bij 115 graden Celsius gedurende 1,5 minuten en verwijder deze na UV-blootstelling en bakken. Los de blootgestelde foto op. Weerstand door de schuif onder te dompelen in een positieve foto.
Weerstandontwikkelaar gedurende ten minste 3,5 minuten. Wanneer u klaar bent, spoelt u de schuif grondig met DI-water en inspecteert u de ontwikkelde patronen onder een optisch microscoop. Laad vervolgens de monsters in een sputtermachine die onafhankelijk goud, zilver en chroom kan sputteren.
Reinig de monsters gedurende 90 seconden bij 50 watt onder een 25 millitorr Argonne-verwerkingsatmosfeer voordat u begint met de metaalafzetting onder 10 millitorr Argonne sputter chroom gedurende 10 minuten bij 300 watt. Sputtering vervolgens goud gedurende 90 seconden bij 400 watt, gevolgd door co-sputteren van goud en zilver gedurende 10 minuten met zilver bij 200 watt en goud bij 100 watt. Schakel de goudsputteringsbron uit ongeveer 10 seconden voordat u de zilversputteringsbron uitschakelt.
Verwijder de monsters uit de sputtermachine nadat u de monsters uit de sputtermachine hebt verwijderd. Soniceer ze in ongeveer 180 milliliter van een positieve foto. Weerstandstripper voor 10 cycli van 22e sonicatie met pauzes van twee minuten tussen de cycli.
Wanneer u klaar bent, spoelt u de monsters met di-water en droogt u ze met een stikstofpistool. Inspecteer de metalen patronen onder een microscoop. Schil vervolgens de elastomeer stencil van de niet-fotoweerstand gecoate monsters af met behulp van twee pincetten om het afgezette metaal te onthullen.
Behandel de kleine dekvlakken met luchtplasma bij 10 watt gedurende 30 seconden voordat u ze in salpeterzuur dompelt. Ontleger de microscoopglazen door ze gedurende 15 minuten in een beker met 70% salpeterzuur te dompelen bij 55 graden Celsius. Zodra het ontlegeren voltooid is, spoelt u de monsters door ze succesvol in bekers met di-water drie keer elk te dompelen.
Plaats de monsters op pluisvrije handdoeken en droog ze met een stikstofpistool. Stel de temperatuur van een hete plaat in op tussen 150 en 300 graden Celsius. Laat vervolgens de monsters langzaam op het hete oppervlak zakken om plotselinge temperatuurveranderingen te minimaliseren.
Verwijder de monsters na vijf minuten van de hete plaat om af te koelen. Plaats de nano poreuze gouden monsters in polystyreen schalen en behandel ze met luchtplasma bij 10 watt gedurende 30 seconden. Breng vervolgens de monsters over naar 24-well weefselkweekplaten.
Voeg 500 microliter volledige kweekmedia toe aan elk. Bewaar de platen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2 tot het zaaien van de cellen. Bewaar muis astrocytcellen in T 75 kolven met kweekmedia.
Zodra de cellen 70% conflueert zijn, passageer ze door eerst het oude medium te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken voor het micropatternen van nanoporeuze goudfilmen met behulp van stencilprinten en fotolithografie. Daarnaast worden methoden besproken voor het kweken van cellen op deze gefabriceerde micropatronen en de beeldanalysetechnieken die worden gebruikt om de morfologie van zowel de materialen als de gekweekte cellen te karakteriseren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Materiaalkunde
Achtergrond
- Nanoporeus goud heeft een hoog effectief oppervlak en een goede biocompatibiliteit.
- Microfabricatietechnieken maken nauwkeurige patroonvorming van materialen mogelijk.
- Compatibiliteit met celculturen is essentieel voor biomedische toepassingen.
- Beeldanalysetechnieken zijn cruciaal voor het beoordelen van cel-materiaalinteracties.
Doel van de studie
- Het vervaardigen van nanoporeuze gouden micropatronen.
- Het aantonen van de compatibiliteit van deze patronen met celkweek.
- Het kwantificeren van cel-materiaalinteracties met behulp van microscopische technieken.
Gebruikte methoden
- Creatie van stencils of fotolithografische maskers.
- Co-sputteren van goud en zilver om precursor-legeringen te patroonvormen.
- De-alloying van goud-zilverpatronen in salpeterzuur om nanoporeus goud te produceren.
- Kweken van cellen op de nanoporeuze goudmicropatronen en het uitvoeren van immunokleuring.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle fabricage van nanoporeuze gouden micropatronen.
- Compatibiliteit van nanoporeus goud met celkweek aangetoond.
- Kwantitatieve analyse van cel-materiaalinteracties gerealiseerd met behulp van microscopie.
- Voordelen van nanoporeus goud ten opzichte van andere nanogestructureerde coatings belicht.
Conclusies
- Nanoporeuze gouden micropatronen zijn effectief voor celkweektoepassingen.
- De beschreven technieken bieden voordelen op het gebied van compatibiliteit en functionaliteit.
- Toekomstige toepassingen in biomedische velden zijn veelbelovend op basis van deze bevindingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Microgefabriceerde nanoporeuze goudpatronen (np-Au) maken een nauwkeurige analyse van cel-materiaalinteracties mogelijk, wat vroege ontdekkingen bij de ontwikkeling van biosensoren en biomedische apparaten ondersteunt. De compatibiliteit van np-Au met gevestigde microfabricatieworkflows en de kwantificeerbare resultaten van celinteracties bieden voorspellende zekerheid voor translationeel onderzoek en platformintegratie. Deze capaciteit is strategisch gepositioneerd om risico's bij de materiaalselectie te verminderen en de portfolioontwikkeling van apparaatgestuurde therapeutica en diagnostiek te versnellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematische evaluatie van nanostructurele effecten op celadhesie en morfologie mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van de biocompatibiliteit van materialen voor apparaatinterfaces.
- Faciliteert mechanistische risicobeperking door cel-materiaalresponsen te kwantificeren.
- Biedt een platform voor hypothese-gedreven onderzoek naar oppervlaktechemie en topografie.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert reproduceerbare, microgefabriceerde substraten voor gestandaardiseerde celgebaseerde assays.
- Maakt kwantitatieve beeldanalyse mogelijk van celbedekking, oppervlakte en aantal op engineered oppervlakken.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en integratie met high-content screeningplatforms.
- Verbetert de betrouwbaarheid van de evaluatie van verbindingen of materialen in biosensor-workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro data over cel-materiaalinteracties uit met biologische eindpunten die relevant zijn voor het apparaat.
- Maakt continuïteit mogelijk van de materiaalselectie in de ontdekkingsfase tot het preklinische prototypen van het apparaat.
- Ondersteunt de risicogebaseerde verdere ontwikkeling van kandidaatmaterialen voor biomedische toepassingen.
- Biedt kwantitatieve metrieken voor de afstemming van translationele biomarkers wanneer dit relevant is.
Integratie van pipeline en workflow
Micro-gefabriceerde np-Au patroons zijn geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunen de materiaalkeuze, het prototypen van apparaten en de ontwikkeling van biosensor-assays.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert interacties tussen cellen en materialen om biocompatibiliteit en functionele prestaties te verduidelijken.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare substraten voor vergelijkende analyse van verschillende materiaalkandidaten.
- Analytica: Maakt het mogelijk om kwantitatieve metrieken zoals celoppervlak, dekking en celgetal uit microscopiebeelden te extraheren.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen in vitro bevindingen en apparaatgeoriënteerde biologische prestaties in preklinische modellen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare workflow voor microfabricage en analyse voor diverse materiaal- en apparaatprojecten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van de biocompatibiliteit van materialen en de integratie van apparaten.
- Operationele waarde: Standardiseert fabricage en analyse, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen voor materiaalkandidaten en apparaatkandidaten, waardoor risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van materialen en platforms voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfabricage, celkweek en kwantitatieve beeldanalyse.
- Toegang tot sputterapparatuur, fotolithografie en geavanceerde microscopie-infrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van fabricage- en analyseprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse celtypen en materiaalsystemen door optimalisatie van het protocol.
- Beperkingen omvatten potentiële variabiliteit in porositeit en filmadhesie, wat kwaliteitscontrole vereist.
