Een geautomatiseerd 3D-trackingsysteem gebruiken om individuele vissen en groepen volwassen zebravissen te registreren

Het algemene doel van deze procedure is het bestuderen van de driedimensionale bewegingspatronen van zebravissen of andere aquatische dieren en het analyseren van hun kinematische, ruimtelijke en sociale kenmerken. Dit maakt de detectie van veranderd gedrag mogelijk als gevolg van genetische mutaties of chemische en omgevingsfactoren. Dit wordt bereikt door eerst het systeem te kalibreren, wat tevens de aanzienlijke beeldvervorming corrigeert die wordt veroorzaakt door refractie.

De tweede stap bestaat uit het gelijktijdig vastleggen van videoframes met een relatief hoge temporele resolutie vanuit ten minste twee verschillende hoeken. Vervolgens reconstrueert de software de trajecten van de vissen. Geavanceerde algoritmen worden toegepast om het effect van ruis te verminderen en om de positie van een vis af te leiden wanneer er occlusie of clustering optreedt.

De laatste stap is het analyseren van de gegevens en het uitvoeren van een statistische analyse voor de snelheidsversnelling, de draaihoek, de horizontale en verticale distributie in de observatiecontainer, de interindividuele afstanden en andere parameters van belang. Uiteindelijk is de gecalibreerde 3D-tracking met hoge snelheid nuttig om gedragsdeficiënties bij gemuteerde zebravissen en de effecten van geneesmiddelen op een verscheidenheid aan gedragssystemen te bestuderen. Voor het doel van geneesmiddelenonderzoek is een voordeel van het systeem dat het mogelijk maakt om het gedrag van vissen in 3D te bestuderen.

Dit is belangrijk omdat vissen zich van nature in alle drie de dimensies bewegen en, bij het gelijktijdig opnemen van meerdere vissen, een 2D-opname zeer misleidend kan zijn bij het onderzoeken van de ruimtelijke configuraties van de groep. Een ander voordeel van het systeem is dat het corrigeert voor lichtbreking, wat, indien niet gecorrigeerd, in de huidige configuratie kan leiden tot aanzienlijke meetfouten. De observatiecontainer met de zebravis is geplaatst in de observatiekamer.

De kamer bevat daarnaast een camera, een spiegel, die onder een hoek van ongeveer 45 graden boven de houder is opgehangen, en LED-lichtbalken. Calibreer vóór de opname het systeem om de locaties van de wand van de houder en het wateroppervlak te bepalen, evenals de schaalfactor van de opgenomen frames; corrigeer daarnaast voor de fout die wordt veroorzaakt door lichtbreking bij de overgang van water naar lucht. Zodra de kalibratie is voltooid, dient er een testrun te worden uitgevoerd met een proefvis.

Een herkalibratie dient te worden uitgevoerd als de posities van de spiegel of camera niet correct zijn of als er problemen zijn met de tracking. Om een opnamesessie te starten, plaatst u de observatiecontainer, gevuld met water tot aan de markeringen, in de observatiekamer. De voetjes van de container moeten in de uitlijningsgaten worden geplaatst.

Plaats de containers zodanig dat de halftransparante of ondoorzichtige wanden naar de achterkant en naar rechts zijn gericht, gezien vanuit de camera. Schakel vervolgens de verlichting in het compartiment in, plaats de vissen in de container en sluit de gordijnen. Open de opnamemodule, waarna de beelden van het vooraanzicht en bovenaanzicht van de container op het scherm verschijnen.

In eerste instantie is het verkregen beeld mogelijk niet ideaal en moet er daarom mogelijk enkele aanpassingen worden gedaan om voldoende contrast tussen de vis en de achtergrond te verkrijgen. Om het beeld aan te passen, selecteert u camera-instellingen en deselecteert u vervolgens in het geopende venster met algemene instellingen de hier getoonde vakjes; pas vervolgens de sluitertijd en gain aan zodat het beeld niet overbelicht is. Selecteer daarna, aan de linkerkant van het venster voor de camera-instellingen, de kleurbalans en deselecteer in het nieuwe venster het vakje 'auto'. Pas vervolgens de rode en blauwe waarden aan om het beste kleurcontrast te verkrijgen in zowel het vooraanzicht als het bovenaanzicht.

Nadat de aanpassingen zijn voltooid, kunnen meerdere correcties noodzakelijk zijn. Selecteer in het hoofdmenu van de opnamemodule de datalocatie om een map aan te maken of te selecteren. Elke opname moet een eigen map hebben, die een submap van de experimentmap moet zijn.

Druk nu op start recording en voer een geheel getal in voor de duur van de opname in minuten; druk vervolgens op okay, waarna de experimentele opnamesessie zal beginnen. Zodra de opnames zijn voltooid, kopieert en plakt u de gegevens van de diercontainer en de submappen met correspondentiegegevens van de kalibratiemap naar de eerder aangemaakte mappen During recording om te beginnen met de padreconstructie; open hiervoor de trajectory-module van de software. Druk vervolgens op data location om de map te selecteren die met de record-module is aangemaakt.

Druk vervolgens op de knop voor systeeminstellingen om eerst het venster met parameters te openen en pas de kleur-drempelwaarden voor het bovenzicht aan. Een goede startwaarde is 1000. Selecteer vervolgens de drempelwaarden voor de afmetingen van het bovenzicht.

Een goede beginwaarde voor een middelgrote zebravis is 10, gebruik 20 voor een grote vis en vijf voor een kleine vis. Hoe hoger deze drempelwaarden, des te kleiner de kans dat de software ruis oppikt. Bij een te hoge waarde is het echter mogelijk dat de vis niet kan worden gedetecteerd.

Het kan tijdens het experiment noodzakelijk worden om deze drempelwaarden later aan te passen. Voor de bovenste grootte-drempelwaarde is een waarde van 3000 gewoonlijk voldoende. Voor de specifieke lengte behoudt u de vooraf ingestelde waarde van 220.

Het aantal vissen verwijst naar het aantal vissen in het observatiereservoir. Max numb of points verwijst naar het totale aantal frames; noteer of onthoud dit getal en druk op Okay. Selecteer vervolgens acquire background.

Het volgende venster vraagt om twee velden in te vullen. Pas na het laden van de achtergrond de drie rode kaders met de muis aan; deze kaders markeren de gebieden waarin de software naar de vissen zoekt. Minimaliseer het kader aan de linkerkant.

Aangezien het zijzicht alleen voor kalibratie wordt gebruikt, drukt u nu op de knop voor het genereren van trajecten, waarna de padreconstructie begint. Idealiter moet de tag op de afbeelding van de vis worden geplaatst; als deze vaak onjuist wordt geplaatst, open dan het informatievenster. Hier zien we een ideaal geval waarin alleen de contouren van de vis zichtbaar zijn.

Bij overmatige ruis drukt u op stop in het hoofdmenu en kiest u nieuwe drempelwaarden voor kleur en grootte. Controleer daarnaast of de rode kaders enigszins kunnen worden verkleind. Bekijk bijvoorbeeld op het 3D-scherm de trajectorie aan de bovenzijde om de ruis die door waterbewegingen wordt veroorzaakt uit te sluiten.

Door met de rechtermuisknop te klikken, kan de onderzoeker kiezen tussen rotatie en translaties van de 3D-configuratie. Om te beginnen met de gegevensverwerking, opent u de module voor gegevensverwerking, selecteert u project op de werkbalk en kiest u vervolgens in het uitklapmenu voor nieuw en voert u een experimentnaam in. Selecteer daarna project bewerken.

Voeg het vervolgens toe aan het project, gevolgd door een nieuwe groep, en vul een naam in voor de experimentele groep. Selecteer nu de experimentele groep in het rechtervenster. Let op dat de werkbalk zal veranderen.

Selecteer de bewerkingsgroep, klik vervolgens op toevoegen aan groep en daarna op nieuwe metingen. Hiermee wordt een browservenster geopend. Open vervolgens de map die tijdens de opname is aangemaakt, selecteer de submap trajectories en kies daarna het point smoothened-bestand.

In het hier gepresenteerde voorbeeld werden voor groep A zes bestanden geladen en voor groep B vier bestanden. Selecteer om de analyse te starten het bestand met uitgevlakt punt in het rechtervenster. Selecteer vervolgens gegevensverwerking en enkelvoudige waarde eindpunten in het uitklapmenu.

Ter illustratie: selecteer duration freezing. Er opent een venster waarin u de freezing-instellingen kunt specificeren op basis van de snelheidsdrempelwaarde en de duur-drempelwaarde, zodat u vertrouwd raakt met het programma. Probeer andere voorbeelden, zoals travel distance depth distribution, waarmee men het aantal diepteniveaus en de burst-frequentie kan bepalen.

Wanneer deze optie wordt geselecteerd, wordt batchverwerking uitgevoerd waarbij standaarddrempels voor ongeveer 200 eindpunten in deze context worden berekend. Standaard betekent dat de afbakeningen zijn ingesteld. Zo wordt momenteel de diepteverdeling berekend voor drie diepteniveaus en de hoekverdeling berekend voor vier secties.

Nadat de parameters zijn gegenereerd, opent er een nieuw venster waarin wordt gevraagd om de locatie en de naam van het bestand dat moet worden aangemaakt. Deze worden opgeslagen in CSV-formaat en kunnen worden geïmporteerd in andere software. Hier toont figuur A een typisch voorbeeldframe voor de controle.

Zebravis, terwijl figuur B een typisch voorbeeldframe laat zien van zebravis behandeld met MK 801, beide opgenomen tijdens een ochtendsessie. Merk op dat de gecontroleerde zebravis zich dicht bij de bodem en dicht bij elkaar bevonden. In contrast hiermee bevonden de met MK 801 behandelde zebravis zich dicht bij de oppervlakte en zwommen zij op aanzienlijke afstand van elkaar.

Hier worden twee representatieve trajecten gepresenteerd voor controlevissen en zebravisen behandeld met 10 µM MK 801, voor zowel een ochtendsessie als een middagsessie. In deze figuur worden de gemiddelde sociale afstanden voor de controles en de met 10 µM MK 801 behandelde vissen voor beide sessies weergegeven, en hier worden de tijdlijnen van de gemiddelde interindividuele afstanden voor beide groepen gepresenteerd.

Hier in figuur A zien we de distributie van de zebravis over 10 gelijke diepteniveaus voor de ochtendsessie, en in B de distributie voor de middagsessie. De temporele distributie over de vier radiale zones van de experimentele groepen is hier te zien. De inzet toont de locaties van deze zones van het centrum naar de periferie, en hier zien we de temporele distributie over de vier kwadranten van de experimentele groepen.

De inzet toont de locatie van de kwadranten. Dubbele lijnen stellen witte wanden voor, enkele lijnen stellen transparante wanden voor. De camera bevindt zich links van de inzet, dus het dichtst bij kwadrant één en vier.

Zwarte asterisken geven vergelijkingen aan tussen de groepen van de ochtendsessie en grijze asterisken voor die van de middagsessies. Ten slotte worden hier de X-, Y- en Z-componenten van de afgelegde afstand van de zebravis tijdens de ochtend- en middagsessies weergegeven. Gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde zijn gepresenteerd.

Houd er bij het werken met het systeem rekening mee dat de gegevens slechts zo goed zijn als de opname; zorg er daarom voor dat het systeem goed is gekalibreerd en dat de camerainstellingen optimaal zijn. De rest is eenvoudig en is enkel een kwestie van gewenning aan de verschillende stappen.