Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente Escherichia coli En Vibrio cholerae
8 oktober 2013
Elektroporatie is een algemeen gebruikte werkwijze voor het introduceren van DNA in bacteriën in een proces dat transformatie. Traditionele protocollen voor de bereiding van elektrocompetente cellen tijdrovend en arbeidsintensief. Dit artikel beschrijft een alternatieve, snelle en efficiënte werkwijze voor de bereiding van elektrocompetente cellen thans werkzaam sommige laboratoria.
Het algemene doel van deze procedure is om competente bacteriën snel en gemakkelijk op dezelfde dag te genereren. Ze zijn nodig voor transformatie. Dit wordt bereikt door de bacteriën eerst op LB-agar te plateren en ze vier tot zes uur te incuberen.
Vervolgens wordt het bacterie-lawn zorgvuldig van het oppervlak van de agar gehaald en wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in steriel koud water of buffer. Vervolgens wordt het bacterie-pellet drie keer gewassen bij vier graden Celsius en opnieuw gesuspendeerd in 40 microliter. Ten slotte worden de competente cellen geëlektroporeerd in aanwezigheid van DNA.
Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die niveaus van bacteriële transformatie laten zien die vergelijkbaar zijn met die verkregen met de traditionele methode die aanzienlijke apparatuur, grote volumes van bacterieculturen en steriele buffers vereist. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat verse, competente bacteriën vrijwel van elke laboratoriumstam kunnen worden bereid op de dag dat de transformatie is gepland zonder de noodzaak van grote centrifuges, rotors of leiders van steriele buffers en culturen Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode niet veel worstelen omdat dit slechts een kortere variant is van technieken die gewoonlijk worden toegepast in bacteriologische laboratoria. De oorspronkelijke ontwikkelaar van dit protocol kan niet worden geïdentificeerd, aangezien het door tal van onderzoekers in de loop van de tijd is gebruikt en geoptimaliseerd.
De hier gepresenteerde methode wordt al bijna twee decennia in onze laboratoria gebruikt, en het is ons doel om dit nuttige protocol te delen met onze collega's. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk voor één stap. In het bijzonder de verzameling van bacteriën van het gazon op de auger omdat het een ervaren oog vereist om de groei op de plaat te evalueren.
En dit wordt het beste gevisualiseerd. De procedure wordt gedemonstreerd door mevrouw Theresa Brooks, een onderzoeksassistent van het laboratorium van Dr. Te Koski aan de Universiteit van Alberta in Edmonton, Canada. Ik begin de bereiding van bacteriecultuur in de late namiddag, gebruik een kleine hoeveelheid e coli of v coray om een tot vijf milliliter autoclaaf LB-bouillon in steriele bo silicaat glas testbuisjes te inoculeren.
Plaats de geïnoculeerde testbuisjes in een roldrum en incubeer ze een nacht bij 37 graden Celsius en hoge snelheid. Bereid een celverspreider in de vorm van een hockeystick van een glazen staaf door het midden van de staaf in de vlam van een Bunsenbrander te verwarmen tot het glas zacht wordt. Gebruik vervolgens een pincet of een tang om de bocht voorzichtig in een hoek van 135 graden te richten.
Verwarm de staaf nogmaals op het middenpunt tussen het einde en de eerste bocht en buig deze onder een hoek van 45 graden naar binnen. Bereid lb aerates voor met en zonder antibiotica en bewaar ze bij vier graden Celsius. De volgende ochtend.
Plaats 100 microliters van de overnachtcultuur op elke LB-agarplaat. Gebruik de celverspreider en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende vier tot zes uur of totdat een dunne laag bacteriegroei zichtbaar wordt. Gebruik een inoculatielus om een bacteriemassa van ongeveer twee millimeter diameter uit de plaat te oogsten en resuspendeer deze in één milliliter ijskoud.
Twee millimolar calciumchloride. Als u v coray of sterieel dubbel gedestilleerd water gebruikt voor e coli, gebruikt u een gekoelde centrifuge ingesteld op vier graden Celsius, centrifugeert u de suspensie gedurende vijf minuten bij 5.000 Gs. Gooi het supernatant weg en herhaal de wassing nog twee keer. Na het verwijderen van het laatste supernatant resuspendeer het pellet in 40 microliter calciumchloride of dubbel gedestilleerd water en bewaar het op ijs.
Om een transformatie uit te voeren, voegt u maximaal één microgram plasma-DNA toe aan de 40 microliter bacteriesuspensie en brengt u het mengsel over in een voorgekoelde steriele 0,2 centimeter opening. Vete, breng de vete in de elektroporatiekamer van de pulscontrolemodule en ate bij 1,8 kilovolt en 25 micro phs. De tijdconstante moet ongeveer 5,0 milliseconden zijn en er mag geen boogovergang optreden.
Resuspendeer snel de cellen in één milliliter LB-bouillon en breng ze over in een eerder geautoclaveerde brouwglastestbuis. Laat de cellen herstellen door ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius onder aeratieve groeiomstandigheden te incuberen zonder antibiotische selectie. Plaats de bacteriën op LB ager-platen met antibioticum en incubeer ze een nacht bij 37 graden Celsius.
Zoals hier getoond, hebben we een reeks transformaties uitgevoerd met e coli en V co array om de transformatie-efficiëntie van onze snelle methodologie te vergelijken met een aanpassing van de traditionele methode oorspronkelijk beschreven door doer et al voor de bereiding van elektrocompetente bacteriën. De transformantrendement lag binnen de 10 van de zesde tot 10 van de zevende CFU's per microgram DNA in drie, replicaatexperimenten voor e coli en v coray. Met behulp van de traditionele methode voor elektrocompetentie.
Celbereiding, transformantrendement leek verminderd tienvoudig tot 10, tot de vijfde, tot 10 tot de zesde CFU's per microgram DNA in drie replicaatexperimenten voor e coli en v coray met behulp van de snelle methode. Om deze reden bepaalden we het percentage getransformeerde bacteriën door getransformeerde CFU's te delen door het aantal CFU's hersteld uit mock-transformaties uit anderszins identieke batches van competente cellen. Het percentage getransformeerde bacteriën lag binnen één log.
Ongeacht de bereidingsmethode en getransformeerde soort. Deze resultaten suggereren dat de efficiëntie van de snelle methode vergelijkbaar is met die van de traditionele langere procedure voor het bereiden van competente cellen, en dat de representatieve stammen van ieo, coray en esia coli even goed geschikt zijn voor de snelle procedure. Eenmaal beheerst, kan deze techniek binnen vijf tot zes uur worden uitgevoerd, mits goed uitgevoerd.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de bacteriën tijdens hun logaritmische groeifase te oogsten
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle en efficiënte methode voor het bereiden van elektrocompetente bacteriële cellen voor transformatie. De techniek maakt het mogelijk om op dezelfde dag competente bacteriën te genereren, waardoor de tijd en arbeid die bij traditionele protocollen komen kijken, aanzienlijk worden verminderd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetische manipulatie
- Celbiologie
Achtergrond
- Elektroporatie is een veelgebruikte methode om DNA in bacteriën te introduceren.
- Traditionele methoden voor het bereiden van elektrocompetente cellen zijn tijdrovend en vereisen uitgebreide middelen.
- Dit artikel beschrijft een alternatieve aanpak die het proces vereenvoudigt.
- De methode is in de loop van de tijd door verschillende onderzoekers gebruikt en geoptimaliseerd.
Doel van de studie
- Om een snel en efficiënt protocol te bieden voor het bereiden van elektrocompetente bacteriële cellen.
- Om aan te tonen dat de nieuwe methode vergelijkbare transformatie-efficiënties oplevert als traditionele methoden.
- Om het gebruik van deze techniek in diverse laboratoria te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bacteriën worden geplaatst op LB-agar en gedurende 4-6 uur geïncubeerd.
- De bacteriële lawn wordt geoogst en改めて gesuspendeerd in steriel koud water of buffer.
- De suspensie wordt meerdere keren gewassen bij lage temperaturen.
- Elektroporatie wordt uitgevoerd met de voorbereide competente cellen en DNA.
Belangrijkste Resultaten
- De snelle methode levert transformatie-efficiënties op die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden.
- De opbrengsten van transformanten lagen in het bereik van 106 tot 107 CFU's per microgram DNA.
- De methode kan binnen 5-6 uur worden voltooid.
- Het oogsten van bacteriën tijdens hun logaritmische groeifase is cruciaal voor het succes.
Conclusies
- De snelle bereiding van elektrocompetente cellen is haalbaar en efficiënt.
- Deze methode kan door laboratoria worden overgenomen om DNA-transformatieprocessen te stroomlijnen.
- Een visuele demonstratie van het protocol verbetert het begrip en de uitvoering.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De snelle bereiding van elektrocompetente Escherichia coli en Vibrio cholerae stroomlijnt workflows voor genetische manipulatie, waardoor transformatie op dezelfde dag mogelijk wordt en operationele knelpunten bij vroege ontdekking en assay-ontwikkeling worden verminderd. Dit protocol ondersteunt een flexibele selectie van stammen en een efficiënt gebruik van middelen, wat een directe impact heeft op de doorvoer en reproduceerbaarheid in microbiële engineering-pipelines. De adoptie hiervan vergroot de wendbaarheid van de portfolio door vertragingen te minimaliseren die gepaard gaan met traditionele, arbeidsintensieve methoden voor celbereiding.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Versnelt genetische modificatie voor hypothesegestuurde analyse van microbiële doelwitten.
- Maakt snelle constructie van gemodificeerde stammen mogelijk voor het ontrafelen van metabole routes en mechanisch risicobeheer.
- Ondersteunt functionele validatie van genetische elementen in diverse prokaryotische achtergronden.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de preparatie van gevalideerde bacteriële systemen voor high-throughput screening.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van de transformatie-efficiëntie over verschillende experimenten heen.
- Maakt een snelle doorlooptijd voor assay-klare stammen mogelijk, wat iteratieve optimalisatiecycli ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt flexibele aanpassing mogelijk aan verschillende bacteriële soorten die relevant zijn voor translationele studies.
- Bewaart de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door diverse behoeften aan strain-engineering te ondersteunen.
- Vermindert het risico op onderbrekingen in de workflow als gevolg van beperkte commerciële beschikbaarheid van stammen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit snelle protocol bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en screening, waardoor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde bacteriële stammen mogelijk wordt voor daaropvolgende functionele assays en de ontwikkeling van preklinische modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt snelle hypothesetoetsing en padanalyse via efficiënte transformatie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve transformatie-outputs voor de ontwikkeling van assays.
- Analytica: Maakt directe vergelijking van transformatie-efficiënties en opbrengsten onder verschillende condities mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert aanpassing aan meerdere prokaryotische systemen voor een bredere translationele relevantie.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol dat toepasbaar is op een breed scala aan laboratoriumstammen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de resultaten van genetische manipulatie en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Minimaliseert de voorbereidingstijd, de benodigde apparatuur en het verbruik van middelen.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie bij projecten voor microbiële engineering.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door snelle, reproduceerbare stamgeneratie over verschillende programma's mogelijk te maken.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basiskennis van microbiologie en ervaring met electroporatieapparatuur.
- Toegang tot standaard laboratoriumcentrifuges, koelopslag en steriele technieken is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare metingen van de transformatie-efficiëntie.
- Aanpasbaar voor diverse prokaryote soorten met geringe aanpassingen aan de buffer.
- Afhankelijk van nauwkeurige timing en temperatuurbeheersing tijdens de cellenogst en de wasstappen.
