A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe sol-gel-gebaseerde materialen voor de vervaardiging van microarrays en het gebruik hiervan voor enzymassays met nanovolumes. Dit wordt bereikt door eerst materialen te identificeren die voldoende lange geleringstijden hebben om gelering in de microarray-printpen tijdens het printproces te voorkomen. De tweede stap is om materialen met lange geleringstijden te beoordelen op hun vermogen om reproduceerbaar als microarrays te worden geprint, hun resistentie tegen barstvorming, de adhesiekwaliteit, ongewenste fasescheiding en uiteindelijk de hoge activiteit van de ingesloten enzymen.

Vervolgens wordt het betreffende enzym als een microarray geprint met behulp van de optimale materialen, waarna de capaciteit om de assay-oplossing op de spots aan te brengen en een meetbare enzymatische respons te genereren, wordt getest. De laatste stap is het evalueren van de materialen op hun vermogen om zeer reproduceerbare assays met het betreffende enzym uit te voeren en kwantitatieve gegevens te genereren. Vervolgens wordt het definitieve materiaal voor de fabricage van de array gekozen.

Uiteindelijk worden protein microarrays afgeleid van soul gel gebruikt om kleine moleculen te identificeren die de enzymactiviteit verminderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals screening op basis van platen, is dat grote aantallen materialen zeer snel en op een systematische manier gescreend kunnen worden met gebruik van lage volumes reagentia. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat materialen in de printpinnen kunnen geleren.

Als deze vervolgens niet correct worden gereinigd, ontstaan er gemiste plekken die kunnen worden geïnterpreteerd als niet-printbare materialen. Begin met het bereiden van de diverse additieve oplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Veel van de oplossingen kunnen vooraf worden bereid en tot een maand of langer worden bewaard onder de juiste omstandigheden, maar sommige moeten op de dag van het experiment worden gemaakt.

Meng de op natriumsilicaat gebaseerde saws onmiddellijk voor gebruik en zorg ervoor dat ze op ijs worden bewaard. De SOS moet binnen één uur na het toevoegen van water worden gebruikt, aangezien langere wachttijden leiden tot verminderde en inconsistente DATION-tijden. Bereid vervolgens diverse combinaties van buffers, salans polymeren en organs lanes voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, om vast te stellen welke combinaties kunnen worden gebruikt als printbaar materiaal met dilatatietijden van meer dan 2,5 uur.

Zodra een aantal combinaties zijn geïdentificeerd, stelt u de luchtvochtigheid in de printkamer in op 80 tot 90%; een luchtvochtigheid van minder dan 80% kan leiden tot verdamping van het monster en inconsistenties bij het printen vanwege de kleine depositievolumes van de printer. Zodra deze gereed is, stelt u de te printen array-patronen in met het Chip Writer Pro-programma. Stel de verplaatsing in de XY-richting in op 10 millimeter per seconde en de snelheid van de monsterbenadering in de Z-richting op twee millimeter per seconde, met een monsterlaadtijd van 2,5 seconden, gebruikmakend van de eerder geïdentificeerde gelcombinaties.

Bereid 25 µL van de basismaterialen voor door de overeenkomstige polymeren, organolanes en kleine molecuuladditieven te combineren die via het prescreeningproces zijn geïdentificeerd. Voeg 50 mM heaps met een pH van 8,0 toe aan individuele putjes van een 384-wells microtiterplaat. Sonicate vervolgens maximaal vier gesleufde sheath-pinnen met een diameter van 100 µm in dubbel gedestilleerd water.

Na 15 minuten worden ze gedroogd onder een stroom stikstof. Gebruik vervolgens een pijpenrager om resterend vocht uit de pinhouder te verwijderen en plaats de pin voorzichtig in de printhoofd van de contactpin-printrobot. Het niet verwijderen van resterend vocht kan ertoe leiden dat de pin niet vrij in de houder kan bewegen, wat resulteert in gemiste plekken.

Voeg vervolgens vlak voor het printen 25 µL van de betreffende SA toe aan het well. Meng de oplossing door 50 keer op en neer te pipetteren. Minimaliseer de hoeveelheid lucht die in de oplossing terechtkomt.

Luchtbellen voorkomen een volledige vulling van het monster in de pin. Laad vervolgens de pin door deze in het monster te laten zakken. Zodra de pinnen zijn geladen, start u het printproces en print u het monster op één oppervlak van de objectglas.

Pauzeer het printproces voordat u zout toevoegt aan de volgende bronplaat. Verwijder, terwijl het proces is gepauzeerd, de printpin met behulp van een magneet en plaats een pijpenrager in de printkop om vochtophoping in de printkop te voorkomen. Spoel vervolgens de printpin af met dubbel gedestilleerd water en soniciteer deze gedurende 30 seconden in schoon dubbel gedestilleerd water.

Droog vervolgens de printpen onder een stroom stikstof en plaats de pen daarna terug in de printhoofd. Ga door met het mengen, printen en reinigen voor alle overige monsters in de bronplaat; tot 12.000 spots met een diameter van 100 microns kunnen op één enkele slide worden aangebracht. Zodra het printen is voltooid, laat u de array minimaal 30 minuten en maximaal 24 uur rijpen in de printkamer bij een vochtigheid van 80 tot 90%.

Bereid vlak voor gebruik 50 µL van de positieve controle voor door 25 µL acetylcholinejodide (1 mM), 0,14 µL BODIPY-FL-cysteïne (5 mM) en 25 mM Tris bij pH 7,0 met 4% glycerol te combineren in de put van een 384-wells microtiterplaat; pipetteer de oplossing langzaam op en neer om te mengen zonder bellen te vormen. Bereid vervolgens vlak voor gebruik de negatieve controles voor door 0,14 µL BODIPY-FL-cysteïne (5 mM) te combineren met 49,86 µL 25 mM Tris bij pH 7,0 met 4% glycerol in een andere put van een 384-wells microtiterplaat en meng deze voorzichtig. Print de controles op de verouderde microarrays met behulp van dezelfde processen als beschreven in de vorige sectie. Gebruik echter, in plaats van de pinnen met een diameter van 100 µm, geslepten pinnen met een diameter van 235 µm.

Dit zorgt ervoor dat de oplossingen de eerder gedeponeerde spots volledig bedekken. De spots worden gedurende één uur bij kamertemperatuur bij een luchtvochtigheid van 80 tot 90% be AGEd vanwege de autohydrolyse van acetylcholine. Langere incubatietijden kunnen leiden tot fout-positieven als gevolg van verhoogde enzymactiviteit.

Zorg ervoor dat de alpha innotech novo array imager is ingeschakeld en is uitgerust met een 478 ± 17 nanometer excitatie- en 538 ± 21 nanometer emissiefilter voor de meting van de acetylcholine esterase-microarrays. Plaats vervolgens het objectglas in de objectglashouder met de spots naar boven gericht. Stel het aantal preview-secties zo in dat er aan weerszijden van het objectglas ten minste één sectie wordt gepreviewd met een minimale resolutie van 4 µm met behulp van auto-exposure.

Zodra de parameters acceptabel zijn bevonden, wordt er een afbeelding van het preparaat gemaakt en opgeslagen als een TIFF-bestand. Open vervolgens de verkregen afbeelding van het preparaat in ImageJ 64. Klik op de Oval Selection Tool en selecteer elke spot.

Selecteer een gebied dat iets groter is dan de waargenomen spot en zorg voor een consistente grootte tussen de spots om de subjectiviteit van Image J te verminderen. Meet vervolgens de signaalintensiteit van elke spot met de optie measure onder het tabblad analyze. Bereken het gemiddelde van de intensiteit van 25 vergelijkbare positieve controlespots en deel dit door de gemiddelde intensiteit van 25 vergelijkbare negatieve controlespots om de ratio's tussen positieve en negatieve controles voor de individuele materiaalsamenstellingen te verkrijgen.

Hier wordt een voorbeeld getoond van het dynamische bereik van de resulterende microarrays die met deze methoden zijn geprepareerd. De hoge controles resulteerden in heldergroene regio's, terwijl de lage controles resulteerden in veel zwakkere spots. De intensiteit, gemeten met ImageJ 64, laat zien dat de hoge controles gemiddeld ongeveer 22 000 relatieve fluorescentie-eenheden bedroegen en de lage controles gemiddeld dicht bij de 8 000 lagen.

De stippellijnen vertegenwoordigen drie standaarddeviaties van het gemiddelde. Hier zijn voorbeeld-microarrays voor een honor array-screening van synthetische analogen van ameral sier-alkaloïden, geïdentificeerd als verbinding één en verbinding twee. Beide assen representeren het percentage enzym, zoals bepaald door het fluorescentiesignaal.

In duplo geeft de nabijheid van de stippen tot de diagonaal een hoge reproduceerbaarheid van de assay aan. Hier worden IC 50-plots van twee verschillende potentiële inhibitoren weergegeven. Verbinding één resulteerde in een IC 50-waarde van 16 micromolar, terwijl de IC 50 van verbinding twee 21 micromolar was. Representatieve spots worden hierboven getoond om de verschillen in signaal proportioneel aan de inhibitorconcentraties te illustreren.

De hier getoonde array werd geprint met vier verschillende kinasen: P 38 map kinase, EGFR en GSK, en werd overgeprint met enkel buffer, buffer met ATP en buffer met ATP en staurosporine, een remmer van enzymactiviteit. De resultaten tonen een significant effect van de kinase-remmer staurosporine aan op basis van de resulterende fluorescentie-intensiteiten, zoals hier beschreven. Het grootste verschil bij de hier gebruikte concentratie staurosporine was zichtbaar bij de P 38 spots.

Hier worden representatieve spots van een P 30 8:00 AM BP microarray getoond, die zijn overspotted met variërende concentraties stor sporin. Zoals aangegeven is de IC 50 van dit molecuul bepaald op één micromolair, wat wordt weergegeven in de grafiek rechts. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in enkele uren worden uitgevoerd indien deze correct volgens deze procedure wordt uitgevoerd.

Andere methoden, zoals immunoassays of eiwitinteractie-assays, kunnen ook worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot diagnostiek of de ontdekking van kleine moleculen.