Name: A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer een systematische materialen screening aanpak voor sol-gel eiwit microarrays met pin-printing. Deze methode optimaliseert enzym assays voor efficiënt kleine-molecuul onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge en Laura Lautens voor hulp bij de ontwikkeling van eiwit-microarrays. De auteurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) dank ook voor de financiering van deze werkzaamheden. De auteurs ook de Canada Foundation bedanken voor Innovatie en de Ontario Innovation Trust voor ondersteuning van dit werk. JDB houdt de Canada Research Chair in Bioanalytisch Chemie en Biointerfaces.

<ol><li>Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene+expression+patterns+with+a+complementary+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.</a> Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhu%2C+HH+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 293 (5537), 2101-2105 (2001).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nature Biotechnology. , (2012).</li>
<li>Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sol-Gel-Derived+Acetylcholinesterase+Microarray+for+Nanovolume+Small-Molecule+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multianalyte+pin-printed+biosensor+arrays+based+on+protein-doped+xerogels%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels.</a> Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).</li>
<li>Cho, E. J., Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+Rapidly+Produce+and+Screen+Biodegradable+Polymer+and+Sol-Gel-Derived+Xerogel+Formulations.+Applied+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy.</a> Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+Screening+for+Sol-Gel-Derived+High-Density+Multi-Kinase+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays.</a> Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).</li>
<li>Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanovolume+Kinase+Inhibition+Assay+Using+a+Sol-Gel-Derived+Multicomponent+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray.</a> Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+enzyme+reaction+microarrays+based+on+pin-printing+of+sol-gel+derived+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials.</a> Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).</li>
<li>MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacBeath%2C+GG+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 289 (5485), 1760-1763 (2000).</li>
<li>Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAST+slides%3A+a+novel+surface+for+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">FAST slides: a novel surface for microarrays.</a> BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).</li>
<li>Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+sol-gel+formulations+and+surface+treatments+for+the+development+of+pin-printed+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays.</a> Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).</li>
<li>Gill, I., Ballesteros, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+biologicals+within+silicate%2C+siloxane%2C+and+hybrid+sol-gel+polymers%3A+An+efficient+and+generic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach.</a> Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+entrapped+in+silica+monoliths+prepared+from+glyceroxysilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sol-gel+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes.</a> Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).</li>
<li>Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-modified+silanes%3A+precursors+for+silica+monoliths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths.</a> Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469(2004).</li>
<li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+protein+microarray+support+materials%3A+Evaluation+for+protein+and+antibody+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications.</a> Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).</li>
<li>Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Sol-Gel+Process+for+Protein+Encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation.</a> Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De hier beschreven methode werd gekozen als het meest geschikt voor het identificeren printable sol-gel afgeleide materialen met een contact printer, waardoor een tijd-en kosten-effectieve procedure voor het snel identificeren van optimale materialen zonder grote hoeveelheden materialen te screenen. Uit een totaal van ~ 20.000 mogelijke materialen, het mogelijk was ~ 200 materialen die geschikt zijn voor afdrukken op basis van geleringstijd alleen waren identificeren. Dit het aantal materialen moeten worden voorbereid vervolgens printen proeven aanzienlijk verminderd. Deze bedrukbare materialen werden vervolgens op 4 dia oppervlakken voor een totaal van 768 materiaal-slide combinaties afgedrukt. Gemiddeld kan 50 vlekken / replica van een materiaal worden gedrukt in ca. 3 min., inclusief sample laden, spot depositie en pin reiniging. Van deze 155 materiaal, ongeveer 20%, toegestaan ​​voor het drukken het maximum aantal vlekken per opname oplossing en geproduceerd reproduceerbaar vlekgroottes. Opgemerkt wordt dat de 4 slide oppervlakken getest, materialen beter afgedrukt in de volgorde: amine&gt; epoxy&gt; aldehyde&gt; PMMA; PMMA dia&#39;s leverden geen bruikbare arrays voor alle materialen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan de polariteit van de oppervlaktelaag. Vergelijking van de bovengenoemde glijvlakken zijn de meer polaire amine en epoxy beter geschikt voor de sols in vergelijking met de PMMA dia. Verder van de geteste oppervlakken de amine gecoate glaasjes een potentieel positief geladen oppervlak voor het ingebrachte anionische sol te binden. We vermoeden, het silicium nanodeeltjes op het raakvlak tussen de glijbaan en de sol interactie langs het oppervlak. Zowel de epoxy en de aldehyde glijvlakken missen dezelfde initiële kosten gebaseerde interactie. Om een ​​optimale plek depositie verzekeren is het sterk aanbevolen om pre-gecoate glaasjes gebruiken van een leverancier, zoals Arrayit. In-house coating produceert inconsistent oppervlakken die leiden tot slechte reproduceerbaarheid spot 13 ​​en, in sommige gevallen, kan leiden tot problemen kwantificeringblemen. 18 Van even groot belang, temperatuur en vochtigheid van invloed op de &quot;bedrukbaarheid&quot; van de materialen. Hoewel er geen gedetailleerde studies over de effecten die verband houden met temperatuur werden uitgevoerd, werd afdrukken altijd uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 ± 3 ° C). Vochtigheid (meer dan 80%) werd gecontroleerd binnen de afdruk kamer om onregelmatige vorm depositie door de kleine hoeveelheden afzetting (0,7-2,3 nl) en verdamping te voorkomen. Terwijl het materiaal scherm werd geleid naar het identificeren optimale sol-gel afgeleide materialen speciaal voor het afdrukken van AChE en kinasen, een klein aantal materialen geïdentificeerd die werkte voor beide eiwitten. Inderdaad, zowel van de materialen die werden geïdentificeerd kinase microarray fabricage waren gebaseerd op PVA SS + + glycerol en beide materialen werden geïdentificeerd in de 26 materialen geselecteerd AChE microarrays. Deze &quot;optimale&quot; materialen kan een generieke uitgangspunt bieden voor de verdere ontwikkeling van protein gedoteerde sol-gel gebaseerde microarrays en kleine schermen rond deze samenstellingen kunnen identificeren nog betere materialen voor microarray fabricage. Een tweede punt om op te merken is het belang van het gebruikte enzym. Bij AChE (nogal robuust enzym), 26 (of ongeveer 40%) van de oorspronkelijke 66 materialen geïdentificeerd als assay-compatibele behield de activiteit van AChE ingesloten. Voor de meer delicate kinasen, slechts 2 van de 69 assay-compatibele samenstellingen, of ruwweg 3% van het materiaal, konden de activiteit van kinasen behouden. Terwijl voldoende aantallen van verschillende enzymen zijn niet onderzocht om definitieve uitspraken te doen, lijkt het erop dat het optimaliseren scala van constructies met relatief onstabiel enzymen kan leiden tot de identificatie van materialen die een breed scala aan eiwitten te mutliplexed microarray fabricage mogelijk kunnen vangen. Ongeacht de gekozen eiwit, grote cut-off factor voor het identificeren bedrukbare materiaal was behoefte aan een langemateriaal geleringstijden (&gt; 2,5 uur). Bij het ontwikkelen SS based sol-gel materiaal, is het zeer belangrijk dat, na ionenuitwisseling en filtratie werd het sol is bij ongeveer pH 4. Sols met een lagere initiële pH kan resulteren in materialen met een lager dan neutrale pH hebben een negatieve invloed enzymactiviteit. 19 Afstellen hoeveelheid Dowex (ionenwisselaar) SS kan de uiteindelijke pH van de sol te wijzigen. Wanneer een nieuwe partij van de hars is bereid de verhouding van hars tot SS dient te worden aangepast aan sols produceren bij een pH van ongeveer 4 volgens de procedure van punt 2 van het protocol. Ook de bereiding van kristallijn DGS is vaak een bron van fouten in verband met materiaal falen bij gebruik van DGS sols voor het biomolecuul beknelling. Hoewel hier niet in detail gerapporteerd, moet grote zorg tijdens de synthese van kristallijne DGS, met name de noodzaak de aanwezigheid van water tijdens de synthese voorkomen dat polyglycerated silica produceren wordentes eerder dan monomere DGS. Ook, vanwege de hygroscopische aard van DGS het kristallijne monster moet bewaard worden gedroogd en binnen 6 maanden na synthese. Kristallijne DGS ouder dan 6 maanden mogen niet volledig oplossen (als gevolg van gedeeltelijk gecondenseerde polyglyceryl silicaat), zelfs met sonicatie in een zure omgeving. Onvolledige DGS ontbinding produceert solen met onbekende en oncontroleerbare silica inhoud en dus, minder robuuste materialen. Een belangrijk punt om op te merken met de contactpersoon afdrukken is de kwaliteit van de pennen. Beschadigde of onjuiste behandeling kunnen (figuur 9) zal nooit tot reproduceerbare arrays onafhankelijk van het materiaal dat wordt afgedrukt. Het wordt aanbevolen om pin kwaliteit te controleren met behulp van een dissectie microscoop om ervoor te zorgen kapot of verstopt pinnen worden niet gebruikt. Zorgvuldige behandeling verzekert een lange levensduur voor het pinnen. Vrij verkeer van de pen is ook belangrijk. Wanneer vocht wordt opgesloten in de printkop tussen de kop en de pen, de penzal niet stoel correct en zal dus goed contact maken met het oppervlak, wat resulteert in een onvoldoende afzetting van materiaal. Tot slot hebben we een gedetailleerd uit meerdere screening aanpak voor het ontwikkelen van high-density eiwit gedoteerde pin-gedrukte microarrays. De screening vereist optimalisering van materiaaleigenschappen (geleertijd en bedrukbaarheid) om afdrukken van materialen, gevolgd door meer gerichte screening materialen die compatibel zijn met een gegeven test en kunnen enzymactiviteit behouden te identificeren. Deze geleide materiaal screening aanpak kan worden toegepast om extra microarray formaten om tijd en kosten van een productie efficiënte high-density microarrays verminderen.

Microarrays zijn populariteit binnen de wetenschappelijke gemeenschap verworven als een methode voor het verhogen van test throughput. Sinds de ontwikkeling van microarray technologie om genexpressie 1 beoordelen in het midden van de jaren 1990, hebben microarrays gebruikt in de ontwikkeling van high-throughput assays om eiwit-eiwit en eiwit-klein molecuul interacties te identificeren en om nieuwe materialen te vinden met unieke eigenschappen. 2-5 Recenter microarrays zijn ontwikkeld waarbij specifieke materialen worden gebruikt om functionele eiwitten te immobiliseren, waardoor een driedimensionale microarray element waarin eiwitten worden ingesloten, waardoor gemakkelijke meting van enzymatische activiteit en remming van de microarray zelf met een geschikt fluorescentie test die is gekoppeld substraat omzet. 5-10 Belangrijk is dat dergelijke microarrays zijn ontworpen om alle noodzakelijke componenten voor het screenen monsters en controles samen omvatten in een zeer parallel mode. 5,8 &lt;/ P&gt; Vroege voorbeelden van eiwit microarrays werden meestal bereid met behulp van standaard methoden voor eiwitimmobilisatie op vaste dragers, zoals covalente binding, 11 affiniteit vastleggen 3 en fysische adsorptie. 12 Hoewel deze methoden van bio-immobilisatie zorgen voor verhoogde monsterconcentratie en versnelde reactiekinetiek nodig voor assay miniaturisatie, zij elk lijden nadelen. Meer algemeen houdt verlagen het natieve biomolecuul functionaliteit wegens chemische modificatie van het oppervlak, gehinderde toegang tot actieve plaatsen of onjuiste oriëntatie door niet-specifieke immobilisatie. Derhalve zijn alle werkwijzen resulteren in lagere testgevoeligheid ondanks een toename biomolecuul depositie, een reactie die waarschijnlijk ontstaat door de noodzaak om kunstmatig biomoleculen binden aan een oppervlak. Een nieuwe benadering voor de productie van functionele biomolecule microarrays is via pin-drukken van eiwit-gedoteerdesilica sols op vaste dragers, die typisch ofwel gefunctionaliseerde glasplaatjes of individuele putjes van platen met microputjes. De sol-gel-werkwijze zelf gebeurt in een waterige omgeving bij kamertemperatuur, en het is de vloeibare precursor die wordt afgedrukt en gels te vangen biomoleculen in de 3D-matrix, waardoor eiwitrijke laden 13 en insluiten van meerdere componenten binnen dezelfde microarray element. 13,14 Afstemming van de sol-gel afgeleide materiaal kan door zorgvuldige selectie van verschillende silica precursoren, en door het veranderen van de waterige component door het gebruik van verschillende buffers (pH, ionsterkte) en opname van verschillende toevoegsels (polymeren, kleine moleculen) een optimale materiaal bereiken, de specifieke aard afhangt van de biologische molecule die wordt ingesloten. 10 Een mogelijke beperking in verband met de ontwikkeling van sol-gel afkomstig eiwit microarrays via pin-afdrukken isde noodzaak om sol-gel composietmaterialen kunnen worden afgedrukt zonder gelering in de pen of met ongewenste eigenschappen (reproduceerbaar spotgroottes, barsten, slechte hechting, onverenigbaarheid met testcomponenten, slechte eiwitactiviteit) eenmaal afgedrukt op een oppervlak bepalen. 5 Gelijktijdige optimalisering van al deze parameters sluit aanpak waarbij materialen worden ontworpen novo of langzaam op seriële wijze onderzocht. Anderzijds, steekproeven van vele duizenden of tienduizenden materialen noch tijd niet kosteneffectief. In dit artikel beschrijven we een gerichte screening aanpak die snelle identificatie van geschikte materialen kunnen voor de productie van eiwit-microarrays zonder willekeurig screenen van grote aantallen materialen. Met een geleide benadering worden die geschikt zijn voor microarray druk eerst geïdentificeerd, gevolgd door een reeks van kleine schermen identificeren optimale sol-gel afgeleide materialenal combinaties die kunnen reproduceerbaar worden afgedrukt, zonder barsten en verenigbaar zijn met een gegeven test. Tenslotte worden optimale materiaal geïdentificeerd op basis van retentie van enzymactiviteit en prestaties in een laatste kleine-molecule screeningstest. Op deze wijze kan een optimale materialen worden geïdentificeerd uit vele duizenden kandidaten met slechts enkele honderden assaystappen. We demonstreren deze benadering voor de productie van zowel high-density acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays en het gebruik van dergelijke microarrays voor kleine molecule screening.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Reagens/Materiaal</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) (PVA)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>360627</td><td>80% gehydrolyseerd, Mw 600</td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 600 (PEG)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>482595</td><td>50 wt% oplossing in water</td></tr><tr><td>Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>25% in water</td></tr><tr><td>N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>50% in ethanol</td></tr><tr><td>bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropyleenoxide (MDSPPO)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltrimethoxysilaan (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bis(triethoxysilyl)ethaan (Bis-TEOS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilaan (APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Alderich</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydraat</td><td>Sigma-Alderich</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&epsilon;-Acetyl-L-lysine</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td><td>Sigma-Alderich</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Alderich</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide, 1,0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zoutzuur, 1,0 N/0,1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diglycerolsilaan (DGS)</td><td></td><td></td><td>Bereid in laboratorium</td></tr><tr><td>Natriumsilicaatoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 ionenuitwisselingshars</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetylthiocholinejodide</td><td>Sigma-Alderich</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetylcholinesterase uit Electrophorus electricus (elektrische paling)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystine</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Fosfoproteïne/Fosfopeptide Microarray Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenosine 5'trifosfaat dinatriumzout (ATP) oplossing</td><td>Sigma-Alderich</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP Kinase 2 (MAPK2)</td><td>EMD Millipore</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), actief</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Epidermale groeifactor (EGFR)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Gedoneerd door Millipore</td></tr><tr><td>Glycogensynthase kinase 3&beta; (GSK-3&beta;)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Myeline basisproteïne (MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Substraat voor MAPK2 en p38&alpha;, Gedoneerd door Millipore</td></tr><tr><td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td><td>Substraat voor GSK-3&beta;</td></tr><tr><td>Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>Substraat voor EGFR</td></tr><tr><td>Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth pin</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amine gecoate slides</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aldehyde gecoate slides</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Exposy gecoate slides</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly(methylmethacrylaat) (PMMA) gecoate slides</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,2-&mu;m spuitfilter</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Apparatuur</td></tr><tr><td>Virtek Contact Printer</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray Fluorescerende Slide Imager</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Desktop microarray centrifuge</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>Gebruikt om al het water dat nodig is voor experimenten te filteren</td></tr></tbody></table>

a guided materialen screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve sol-gel afgeleid eiwit microarrays

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

Microarrays zijn gebruik in de ontwikkeling van high-throughput assays voor nieuwe materialen en werden kleine-molecule drug leads. Hierin beschrijven we een geleide materiaal screening aanpak sol-gel gebaseerde materialen die geschikt zijn voor het produceren driedimensionale eiwit microarrays te identificeren. De eerste benadering identificeert materialen die kunnen worden afgedrukt microarrays, versmalt het aantal materialen die momenten die compatibel zijn met een bepaald enzym assay en vervolgens slijpstenen in op optimale materialen gebaseerd op behoud van maximale enzymactiviteit. Deze benadering wordt toegepast op microarrays voor twee verschillende enzymanalyses, een met acetylcholinesterase en de andere met behulp van een set van vier kinasen betrokken bij kanker. In ieder geval was het mogelijk om microarrays die kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve kleine-molecule screening assays en productie van dosis-afhankelijke remmer responscurves produceren. Belangrijk is de mogelijkheid om veel mate screenenrials geproduceerde informatie over de soorten materialen die het meest geschikt zowel microarray productie en retentie van enzymactiviteit. De materialen gegevens geven inzicht in basismateriaal eisen die nodig zijn voor het op maat optimaal, high-density sol-gel afgeleid microarrays.

Door het uitvoeren van een geleide factoranalyse van het materiaal scherm, waren we in staat om het aantal geteste materialen van ~ 20.000 tot enkele honderden die geleringstijden voor beschrijfbaarheid minimaliseren. Door het toepassen van een strikte leidraad waarbij materiaal geleringstijd van 2,5 uur of meer, materialen die waarschijnlijk de drukkerij pinnen verstoppen of produceren reproduceerbare arrays werden nooit gedrukt. De bedrukbare materialen geïdentificeerd om voldoende (&gt; 2,5 uur) geleringstijden hebben gedrukt werden op 4 verschillende gefunctionaliseerde glasplaatje oppervlakken. Om te worden beschouwd als &quot;printen&quot;, het maximum aantal vlekken per opname volume van de pen moesten worden afgedrukt (SMP3 = 200). Spots werden ook beoordeeld voor spot morfologie zodat er geen scheuren of ongewenste fasescheiding had plaatsgevonden met behulp van eenvoudige helderveld microscopie zoals getoond in figuur 2. Vanaf deze fase van geïdentificeerde bedrukbare materialen, werden microarrays geproduceerd met AChE enkinases opgenomen in de gebufferde waterige component. Materialen die compatibel zijn met de testprocedure (inclusief mogelijke overdrukken en wassen of vlekken stappen) waren werden geïdentificeerd door het observeren van het behoud van microarray plekken (geen kraken, verlies van plekken of ongewone fluorescentie patronen) en een positieve controle (PC) om negatieve controle (NC ) ratio groter dan 1, zoals waargenomen door afbeelding. Aangezien dit ongeveer 50% van het materiaal een grotere PC / NC verhouding van 3 werd gebruikt om optimale materialen definiëren met behoud van eiwit activiteit. Via deze methode 26 sol-gel afgeleide materialen die AChE en 2 materialen die kinases tevredenheid van&gt; 3 PC / NC criteria. Figuur 3 en figuur 4 tonen een grafische analyse van de 5 geleide materiaal scherm stappen voor de identificatie van optimale AChE en kinase microarrays, respectievelijk. De assays kunnen ook worden bevestigd door het genereren van een Z-score 17. </sup&gt; Dit werd gedaan met behulp van het materiaal dat de hoogste PC / NC verhouding geproduceerd. Figuur 5 toont de Z &quot;plot verkregen door het signaal gegenereerd uit spots 200, 100 en PC 100 NC na overdrukken indicatorkleurstof en substraat de AChE matrix vergelijken. De AChE en kinase arrays resulteerde in de respectieve Z-scores van 0,60 en 0,67, een aanwijzing voor een uitstekende assay. Er moet worden opgemerkt dat voor assay validatie had on-matrix enzym, kleurstof, substraat en co-factor concentratie worden geoptimaliseerd door het overdrukken van een reeks concentraties van elke component en de concentratie die het sterkste signaal kiezen geproduceerd, zoals in detail elders . 5 Om de testen te valideren, werden kwantitatieve remming verkregen met bekende en onbekende AChE remmers, met resultaten in duplo uitgevoerd en gebruikt om dubbele plots (Figuur 6A) en inhibitie curven (figuren 6B en 6C) te produceren. &lt;strong&gt; Spots werden eerst overdrukt met mengsels van bekende biologisch actieve kleine-molecule inhibitoren dan met kleurstof en substraat, en controle mengsels die hetzij bekend remmers of geen remmer werden opgenomen. Duplicate plots werden gegenereerd enzymactiviteit beoordelen en allerlei mengsels die resulteerden in minder dan 25% enzymactiviteit werd als positief voor remming. Afzonderlijke verbindingen uit dergelijke mengsels werden vervolgens getest in tweevoud aan de specifieke kleine molecule (s) die verantwoordelijk is voor de remming te identificeren. Eenmaal geïdentificeerd, deze kleine moleculen is de kwantitatieve remmingskrommen genereren IC50 waarden remmingconstanten bepalen. Vergelijkbare kwalitatieve resultaten werden verkregen met behulp van de multikinaseremmer array met een gemeenschappelijke kinase remmer, staurosporine. Figuur 7A en 7B tonen imago van de microarray en geven aan dat het signaal intensiteiten na overdrukken en kleuren van de multikinaseremmerarray zoals verwacht voor een negatieve controle (- ATP), positieve controle (+ ATP) en bekende remmer (+ ATP + inw). De mogelijkheid om kwantitatieve gegevens te verkrijgen remming van de microarrays tonen, werd een concentratie-afhankelijke inhibitie assay uitgevoerd voor een enkele kinase. Zoals getoond in figuren 8A en 8B, signaalintensiteit afneemt als inhibitor concentratie toeneemt, en de reactie volgt de verwachte concentratie afhankelijke remming curve van de p38α/MBP kinase / substraatsysteem. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemeen schema voor de begeleide materialen screening aanpak. Elk blok staat voor een stap van het scherm in de juiste volgorde. Getallen aan de linkerkant is het totaal aantal materialen voor analyse bereid. Met een geleertijd van meer dan 2,5 uur (materialen geleringstijden minder dan 2,5 uur are aangegeven door de drie slag), wordt het aantal materialen dat elke fase voorbij en tijdens de materiële scherm overgedragen aangegeven door het aantal aan de rechterkant. * Geeft materialen met minder dan optimale fasescheiding. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> Figuur 2. Optische beelden tonen verschillende faalwijzen van materialen op de bedrukbaarheid stap van het scherm. Een beeld van een &quot;goede&quot; materiaal (tweede rij, derde kolom) wordt ook getoond ter vergelijking. Overgenomen met toestemming van referentie-8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> Figuur 3. Een gerichte materiaal screening aanpak voor de identificatie van optimale materialen voor het vervaardigen van sol-gel-afgeleide AChE microarrays. Overgenomen met permissie uit referentie 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> Figuur 4. Een gerichte materialen screening aanpak voor de identificatie van optimale materialen voor het vervaardigen van sol-gel-afgeleide kinase microarrays. Overgenomen met toestemming van referentie-8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> Figuur 5. (A) Een deel van AChE microarray tonen HC (helder groen) en LC (lichtgroen) vlekken (een zwart-groen palet werd toegepast als pseudocolor voor de duidelijkheid van de presentatie), (B) een vergrote weergave van de boxed gebied om plek te markeren morfologie en uitlijning;. en (C) een Z &#39;plot Solid lijnen geven het gemiddelde van de<html> repliceert, terwijl stippellijnen corresponderen met 3SD. Overgenomen met toestemming van referentie 5, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> Figuur 6. (A) Dubbele plot voor on-matrix screening van synthetische analogen van alkaloïden Amaryllidaceae, (B) 50 IC percelen vastgestelde potentiële inhibitoren aangeduid als respectievelijk verbindingen 1 en (C) verbinding 2, met foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie van het gemiddelde van 25 repliceert. Representatieve plaatsen blijken te verschillen in signaal evenredig met remmerconcentraties illustreren. Overgenomen met toestemming van referentie 5, copyright 2013 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; altijd &quot;&gt; <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> Figuur 7. On-reeks testen van vier kinasen gebruik 1.4SS/1.0PVA voor invangen wordt en op een amine-gederivatiseerde slide. (A) Een beeld van een deel van microarray waarbij vlekken met kinasen samen ingesloten hun respectieve substraten werden overdrukt met buffer (NC, bovenste rij), of oplossingen die ATP (PC, middelste rij) of ATP + staurosporine (onderste rij). (B) Staafdiagram signaalintensiteiten vergelijking tussen geremd en ongeremd reacties, na aftrek van de achtergrond signalen en de foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie van het gemiddelde van 25 duplo&#39;s. Overgenomen met toestemming van referentie-8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> Figuur 8. Inhibiti. on test op een p38a/MBP microarray (A) Secties van microarrays tonen representatieve plekken overspotted met verschillende concentraties van staurosporine, zoals aangegeven (de beelden werden verkregen door een enkele scan van dezelfde dia; samengestelde afbeelding wordt getoond voor de duidelijkheid). (B) IC 50 curve gegenereerd op basis van de geanalyseerde matrix afbeeldingen. De intensiteit verkregen op 100 mM werd afgetrokken van alle beelden, alle andere intensiteiten werden genormaliseerd door de intensiteit verkregen op 10 nM tot een waarde van 100% activiteit. Overgenomen met toestemming van referentie-8, copyright 2013 American Chemical Society. <img alt="Figuur 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> Figuur 9. Afbeeldingen van microscopische stealth pen gebruikt voor contact pin-afdrukken met verschillende imperfecties: (A) verstopt, (B) verbogen.

Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.

A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe sol-gel-gebaseerde materialen voor de vervaardiging van microarrays en het gebruik hiervan voor enzymassays met nanovolumes. Dit wordt bereikt door eerst materialen te identificeren die voldoende lange geleringstijden hebben om gelering in de microarray-printpen tijdens het printproces te voorkomen. De tweede stap is om materialen met lange geleringstijden te beoordelen op hun vermogen om reproduceerbaar als microarrays te worden geprint, hun resistentie tegen barstvorming, de adhesiekwaliteit, ongewenste fasescheiding en uiteindelijk de hoge activiteit van de ingesloten enzymen.Vervolgens wordt het betreffende enzym als een microarray geprint met behulp van de optimale materialen, waarna de capaciteit om de assay-oplossing op de spots aan te brengen en een meetbare enzymatische respons te genereren, wordt getest. De laatste stap is het evalueren van de materialen op hun vermogen om zeer reproduceerbare assays met het betreffende enzym uit te voeren en kwantitatieve gegevens te genereren. Vervolgens wordt het definitieve materiaal voor de fabricage van de array gekozen.Uiteindelijk worden protein microarrays afgeleid van soul gel gebruikt om kleine moleculen te identificeren die de enzymactiviteit verminderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals screening op basis van platen, is dat grote aantallen materialen zeer snel en op een systematische manier gescreend kunnen worden met gebruik van lage volumes reagentia. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat materialen in de printpinnen kunnen geleren.Als deze vervolgens niet correct worden gereinigd, ontstaan er gemiste plekken die kunnen worden geïnterpreteerd als niet-printbare materialen. Begin met het bereiden van de diverse additieve oplossingen zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Veel van de oplossingen kunnen vooraf worden bereid en tot een maand of langer worden bewaard onder de juiste omstandigheden, maar sommige moeten op de dag van het experiment worden gemaakt.Meng de op natriumsilicaat gebaseerde saws onmiddellijk voor gebruik en zorg ervoor dat ze op ijs worden bewaard. De SOS moet binnen één uur na het toevoegen van water worden gebruikt, aangezien langere wachttijden leiden tot verminderde en inconsistente DATION-tijden. Bereid vervolgens diverse combinaties van buffers, salans polymeren en organs lanes voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol, om vast te stellen welke combinaties kunnen worden gebruikt als printbaar materiaal met dilatatietijden van meer dan 2,5 uur.Zodra een aantal combinaties zijn geïdentificeerd, stelt u de luchtvochtigheid in de printkamer in op 80 tot 90%; een luchtvochtigheid van minder dan 80% kan leiden tot verdamping van het monster en inconsistenties bij het printen vanwege de kleine depositievolumes van de printer. Zodra deze gereed is, stelt u de te printen array-patronen in met het Chip Writer Pro-programma. Stel de verplaatsing in de XY-richting in op 10 millimeter per seconde en de snelheid van de monsterbenadering in de Z-richting op twee millimeter per seconde, met een monsterlaadtijd van 2,5 seconden, gebruikmakend van de eerder geïdentificeerde gelcombinaties.Bereid 25 µL van de basismaterialen voor door de overeenkomstige polymeren, organolanes en kleine molecuuladditieven te combineren die via het prescreeningproces zijn geïdentificeerd. Voeg 50 mM heaps met een pH van 8,0 toe aan individuele putjes van een 384-wells microtiterplaat. Sonicate vervolgens maximaal vier gesleufde sheath-pinnen met een diameter van 100 µm in dubbel gedestilleerd water.Na 15 minuten worden ze gedroogd onder een stroom stikstof. Gebruik vervolgens een pijpenrager om resterend vocht uit de pinhouder te verwijderen en plaats de pin voorzichtig in de printhoofd van de contactpin-printrobot. Het niet verwijderen van resterend vocht kan ertoe leiden dat de pin niet vrij in de houder kan bewegen, wat resulteert in gemiste plekken.Voeg vervolgens vlak voor het printen 25 µL van de betreffende SA toe aan het well. Meng de oplossing door 50 keer op en neer te pipetteren. Minimaliseer de hoeveelheid lucht die in de oplossing terechtkomt.Luchtbellen voorkomen een volledige vulling van het monster in de pin. Laad vervolgens de pin door deze in het monster te laten zakken. Zodra de pinnen zijn geladen, start u het printproces en print u het monster op één oppervlak van de objectglas.Pauzeer het printproces voordat u zout toevoegt aan de volgende bronplaat. Verwijder, terwijl het proces is gepauzeerd, de printpin met behulp van een magneet en plaats een pijpenrager in de printkop om vochtophoping in de printkop te voorkomen. Spoel vervolgens de printpin af met dubbel gedestilleerd water en soniciteer deze gedurende 30 seconden in schoon dubbel gedestilleerd water.Droog vervolgens de printpen onder een stroom stikstof en plaats de pen daarna terug in de printhoofd. Ga door met het mengen, printen en reinigen voor alle overige monsters in de bronplaat; tot 12.000 spots met een diameter van 100 microns kunnen op één enkele slide worden aangebracht. Zodra het printen is voltooid, laat u de array minimaal 30 minuten en maximaal 24 uur rijpen in de printkamer bij een vochtigheid van 80 tot 90%.Bereid vlak voor gebruik 50 µL van de positieve controle voor door 25 µL acetylcholinejodide (1 mM), 0,14 µL BODIPY-FL-cysteïne (5 mM) en 25 mM Tris bij pH 7,0 met 4% glycerol te combineren in de put van een 384-wells microtiterplaat; pipetteer de oplossing langzaam op en neer om te mengen zonder bellen te vormen. Bereid vervolgens vlak voor gebruik de negatieve controles voor door 0,14 µL BODIPY-FL-cysteïne (5 mM) te combineren met 49,86 µL 25 mM Tris bij pH 7,0 met 4% glycerol in een andere put van een 384-wells microtiterplaat en meng deze voorzichtig. Print de controles op de verouderde microarrays met behulp van dezelfde processen als beschreven in de vorige sectie. Gebruik echter, in plaats van de pinnen met een diameter van 100 µm, geslepten pinnen met een diameter van 235 µm.Dit zorgt ervoor dat de oplossingen de eerder gedeponeerde spots volledig bedekken. De spots worden gedurende één uur bij kamertemperatuur bij een luchtvochtigheid van 80 tot 90% be AGEd vanwege de autohydrolyse van acetylcholine. Langere incubatietijden kunnen leiden tot fout-positieven als gevolg van verhoogde enzymactiviteit.Zorg ervoor dat de alpha innotech novo array imager is ingeschakeld en is uitgerust met een 478 ± 17 nanometer excitatie- en 538 ± 21 nanometer emissiefilter voor de meting van de acetylcholine esterase-microarrays. Plaats vervolgens het objectglas in de objectglashouder met de spots naar boven gericht. Stel het aantal preview-secties zo in dat er aan weerszijden van het objectglas ten minste één sectie wordt gepreviewd met een minimale resolutie van 4 µm met behulp van auto-exposure.Zodra de parameters acceptabel zijn bevonden, wordt er een afbeelding van het preparaat gemaakt en opgeslagen als een TIFF-bestand. Open vervolgens de verkregen afbeelding van het preparaat in ImageJ 64. Klik op de Oval Selection Tool en selecteer elke spot.Selecteer een gebied dat iets groter is dan de waargenomen spot en zorg voor een consistente grootte tussen de spots om de subjectiviteit van Image J te verminderen. Meet vervolgens de signaalintensiteit van elke spot met de optie measure onder het tabblad analyze. Bereken het gemiddelde van de intensiteit van 25 vergelijkbare positieve controlespots en deel dit door de gemiddelde intensiteit van 25 vergelijkbare negatieve controlespots om de ratio's tussen positieve en negatieve controles voor de individuele materiaalsamenstellingen te verkrijgen.Hier wordt een voorbeeld getoond van het dynamische bereik van de resulterende microarrays die met deze methoden zijn geprepareerd. De hoge controles resulteerden in heldergroene regio's, terwijl de lage controles resulteerden in veel zwakkere spots. De intensiteit, gemeten met ImageJ 64, laat zien dat de hoge controles gemiddeld ongeveer 22 000 relatieve fluorescentie-eenheden bedroegen en de lage controles gemiddeld dicht bij de 8 000 lagen.De stippellijnen vertegenwoordigen drie standaarddeviaties van het gemiddelde. Hier zijn voorbeeld-microarrays voor een honor array-screening van synthetische analogen van ameral sier-alkaloïden, geïdentificeerd als verbinding één en verbinding twee. Beide assen representeren het percentage enzym, zoals bepaald door het fluorescentiesignaal.In duplo geeft de nabijheid van de stippen tot de diagonaal een hoge reproduceerbaarheid van de assay aan. Hier worden IC 50-plots van twee verschillende potentiële inhibitoren weergegeven. Verbinding één resulteerde in een IC 50-waarde van 16 micromolar, terwijl de IC 50 van verbinding twee 21 micromolar was. Representatieve spots worden hierboven getoond om de verschillen in signaal proportioneel aan de inhibitorconcentraties te illustreren.De hier getoonde array werd geprint met vier verschillende kinasen: P 38 map kinase, EGFR en GSK, en werd overgeprint met enkel buffer, buffer met ATP en buffer met ATP en staurosporine, een remmer van enzymactiviteit. De resultaten tonen een significant effect van de kinase-remmer staurosporine aan op basis van de resulterende fluorescentie-intensiteiten, zoals hier beschreven. Het grootste verschil bij de hier gebruikte concentratie staurosporine was zichtbaar bij de P 38 spots.Hier worden representatieve spots van een P 30 8:00 AM BP microarray getoond, die zijn overspotted met variërende concentraties stor sporin. Zoals aangegeven is de IC 50 van dit molecuul bepaald op één micromolair, wat wordt weergegeven in de grafiek rechts. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in enkele uren worden uitgevoerd indien deze correct volgens deze procedure wordt uitgevoerd.Andere methoden, zoals immunoassays of eiwitinteractie-assays, kunnen ook worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot diagnostiek of de ontdekking van kleine moleculen.

a-guided-materials-screening-approach-for-developing-quantitative-sol

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een grootschalige multiplex tweedimensionale DNA of antilichaam-array, met potentiële toepassingen in cell signaling studies en biomarker detectie.

Flow-patroon Begeleide Fabrication van High-density Barcode Antibody Microarray

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

We tonen een module chiptechnologie voor het uitvoeren van cross-country-reactivity-vrije multiplexed sandwich-immunoassay door simpelweg twee dia's uitlijnen. Een apparaat module wordt gebruikt voor het op betrouwbare wijze overbrengen van reagentia van microarray-naar-microarray. De module-chip kan worden gebruikt voor alle biochemische reacties vereisen colocalization van verschillende reagentia zonder kruisbesmetting.

Snap Chip voor cross-country-reactivity-gratis en Spotter-gratis Multiplexed Sandwich-immunoassay

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Leer een systematische materialen screening aanpak voor sol-gel eiwit microarrays met pin-printing. Deze methode optimaliseert enzym assays voor efficiënt kleine-molecuul onderzoek.

A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Meer video's verkennen