A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays
August 26th, 2013
Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.
Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe op soulgel gebaseerde materialen voor microarray-fabricage te identificeren en deze te gebruiken voor enzymassays met nano-volumes. Dit wordt bereikt door eerst materialen te identificeren die voldoende lange ation-tijden hebben om gelling in de microarray-printpen tijdens het printproces te voorkomen. De tweede stap is om materialen met lange ation-tijden te beoordelen op hun vermogen om reproduceerbaarheidsweerstand tegen kraken, adhesiekwaliteit, ongewenste fasescheiding en uiteindelijk hoge activiteit voor gevangen enzymen als microarrays af te drukken.
Vervolgens wordt het enzym van belang afgedrukt als een microarray met behulp van de optimale materialen en wordt de mogelijkheid ervan om de assayoplossing over de vlek heen te spotten en een meetbare enzymatische respons te genereren getest. De laatste stap is om de materialen te evalueren op hun vermogen om zeer reproduceerbare assays te bieden met behulp van het enzym van belang en kwantitatieve gegevens te genereren. Het definitieve materiaal voor array-fabricage wordt vervolgens gekozen.
Uiteindelijk worden op soulgel gebaseerde eiwitmicroarrays gebruikt om kleine moleculen te identificeren die de enzymactiviteit verminderen. Het belangrijkste voordeel van deze methode boven bestaande methoden zoals plaatgebaseerde screening, is dat u grote aantallen materialen op een systematische manier zeer snel kunt screenen met behulp van lage volumes reagentia. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het mogelijk is dat materialen in de printpennen gelen.
Als deze vervolgens niet goed worden schoongemaakt, zal dit resulteren in gemiste vlekken die kunnen worden geïnterpreteerd als niet-afdrukbare materialen. Om te beginnen, bereid de talrijke additievoplossingen voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Veel van de oplossingen kunnen worden voorbereid en worden opgeslagen tot een maand of langer onder de juiste omstandigheden, maar sommige moeten op de dag van het experiment worden gemaakt.
Meng de natriumsilicaat-gebaseerde zagen direct voor gebruik en zorg ervoor dat ze op ijs worden bewaard. De SOS moet binnen een uur na het toevoegen van het water worden gebruikt, omdat langere wachttijden resulteren in verminderde en inconsistente DATION-tijden. Bereid vervolgens verschillende combinaties van buffers, salans-polymeren en organs-banen voor zoals aangegeven in het bijbehorende tekstprotocol om te identificeren welke combinaties kunnen worden gebruikt als afdrukbaar materiaal met dilatie-tijden groter dan 2,5 uur.
Zodra een aantal combinaties zijn geïdentificeerd, stelt u de luchtvochtigheid in de printkamer in op 80 tot 90% luchtvochtigheid van minder dan 80% kan leiden tot monsterevaporatie en inconsistenties in het afdrukken vanwege de kleine depositievolumes met de printer. Nu klaar, rangschik de arraypatronen om te worden afgedrukt met behulp van het Chip Writer Pro-programma. Stel de reis in de XY-richting in op 10 millimeter per seconde en de monstersnelheid in de Z-richting op twee millimeter per seconde met de 2,5 seconden monsterslaadtijd met behulp van de zaaggel-combinaties die eerder zijn geïdentificeerd.
Bereid 25 microliters van de basismaterialen door corresponderende polymeren, organo-banen en kleine molecuuladditieven te combineren die zijn geïdentificeerd tijdens het prescreeningproces. Gebruik 50 millimolaire hoopjes met een pH van 8,0 in individuele putjes van een 384-well microtiterplaat. Soniceer vervolgens tot vier gesleufde omhulselspelden van 100 micron diameter in twee keer gedestilleerd water.
Na 15 minuten, probeer ze onder een stroom stikstof. Gebruik vervolgens een pipe cleaner om restvocht uit de pinhouder te verwijderen en plaats de pin voorzichtig in de printkop van de contactpin-afdrukrobot. Het niet verwijderen van restvocht kan ertoe leiden dat de pin niet vrij kan bewegen met de houder, wat resulteert in gemiste vlekken.
Voeg vervolgens 25 microliters van de respectieve SA toe aan de put vlak voor het afdrukken. Meng de oplossing met behulp van een op en neer pipettenbeweging. Herhaal 50 keer bij het mengen met behulp van de pipet. Minimaliseer de hoeveelheid lucht die in de oplossing wordt opgenomen.
Luchtbellen voorkomen volledige belasting van het monster in de pin. Laad vervolgens de pin door deze in het monster te laten zakken. Zodra de pins zijn geladen, begint u met het afdrukproces en drukt u het monster af op een diaoppervlak.
Pauzeer het afdrukproces voordat u zout toevoegt aan de volgende bronplaat. Nou, met het proces gepauzeerd, verwijdert u de printpen met behulp van een magneet en plaatst u een pipe cleaner in de printkop om vochtophoping in de printkop te voorkomen. Spoel vervolgens de printpen met twee keer gedestilleerd water en soniceer hem gedurende 30 seconden in schoon, twee keer gedestilleerd water.
Droog vervolgens de printpen onder een stroom stikstof en plaats de pin terug in de printkop. Ga door met mixen, afdrukken en schoonmaken voor alle monsters die nog in de bronplaat aanwezig zijn. Tot 12.000 vlekken, 100 micron in diameter, kunnen op één dia worden gedeponeerd. Zodra het afdrukken is voltooid, laat u de array minimaal 30 minuten en maximaal 24 uur rijpen in de printkamer bij 80 tot 90% luchtvochtigheid.
Bereid 50 microliters van de positieve controle vlak voor gebruik door 25 microliters van één millimolair acetylcholinejodide en 0,14 microliters van vijf millimolair boai PI FIL cysteïne en 25 millimolair tris bij pH 7,0 met 4% glycerol in de put van een 384-well microtiterplaat te combineren. Pipet de oplossing langzaam op en neer om te mengen zonder bellen te maken. Bereid vervolgens de negatieve controles vlak voor gebruik door 0,14 microliters van vijf millimolair boai PI FIL cysteïne te combineren met 49,86 microliters van 25 millimolair tris bij pH 7,0 met 4% glycerol in een andere put van een 384-well microtiterplaat en meng ze voorzichtig. Druk de controles af op de verouderde microarrays met behulp van dezelfde processen die in het vorige gedeelte zijn beschreven. Echter, in plaats van de 100 micron diameter pins, gebruikt u gegroefde
Overzicht
Dit artikel beschrijft een begeleide materiaalscreeningsbenadering voor het ontwikkelen van sol-gel afgeleide, eiwit-gedopte microarrays met behulp van een pin-printing fabricagemethode. De methodologie wordt geïllustreerd door de creatie van acetylcholinesterase en multikinase microarrays voor efficiënte screenings van kleine moleculen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biotechnologie
- Microarray-technologie
Achtergrond
- Microarrays zijn essentieel voor high-throughput screening van biomoleculen.
- Sol-gel processen maken de ontwikkeling van nieuwe materialen voor microarray fabricage mogelijk.
- Pin-printing methoden maken een nauwkeurige depositie van monsters mogelijk.
- Het identificeren van geschikte materialen is cruciaal voor reproduceerbaarheid en assay prestaties.
Doel van het onderzoek
- Om een systematische benadering te ontwikkelen voor het screenen van sol-gel materialen voor microarray toepassingen.
- Om het printproces voor enzymassays te optimaliseren.
- Om de prestaties van eiwitmicroarrays te evalueren bij het identificeren van kleine moleculen.
Gebruikte methoden
- Materiaalscreening voor lange geleertijden om verstopping tijdens het printen te voorkomen.
- Beoordeling van materiaaleigenschappen voor reproduceerbaarheid en enzymactiviteit.
- Printen van enzymmicroarrays met behulp van geoptimaliseerde materialen.
- Evaluatie van assay prestaties en gegevens reproduceerbaarheid.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinase microarrays.
- Identificatie van materialen die hoge activiteit en reproduceerbaarheid bieden.
- Demonstratie van de efficiëntie van de methode bij het screenen van grote aantallen materialen.
- Totstandbrenging van protocollen voor het bereiden en printen van microarrays.
Conclusies
- De begeleide materiaalscreening benadering verbetert microarray fabricage.
- Sol-gel afgeleide eiwitmicroarrays zijn effectief voor het screenen van kleine moleculen.
- Deze methode biedt voordelen ten opzichte van traditionele plaat-gebaseerde screeningtechnieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This guided materials screening approach enables biopharma R&D teams to systematically evaluate sol-gel derived materials for high-density protein microarray fabrication, addressing a key bottleneck in assay development for enzyme-targeted small-molecule screening. By prioritizing materials that support both reproducible printing and retained enzymatic activity, the method enhances predictive confidence in target validation and lead identification campaigns. The approach directly supports early discovery workflows by generating quantitative, dose-dependent response data from nano-volume assays, reducing reagent consumption while increasing screening throughput.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of enzyme inhibition in a microarray format.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying materials that preserve enzyme function during array fabrication and assay execution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems ready for downstream compound screening with measurable enzymatic outputs.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled gelation times and humidity-dependent printing parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking of kinase and acetylcholinesterase targets through dose-response profiling of small-molecule inhibitors.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by generating IC50 data from array-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where array-based enzyme assays inform hit selection and optimization decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative assessment of enzyme activity modulation across material conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible microarray fabrication and stable enzyme entrapment in sol-gel matrices.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts that allow signal-to-noise ratio calculations and IC50 determination for inhibitor profiling.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating enzyme inhibition data relevant to cancer and neurodegenerative pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable material screening platform applicable to diverse enzyme targets beyond acetylcholinesterase and kinases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target modulation through quantitative, reproducible enzyme activity measurements.
- Operational Value: Standardization and scalability of microarray production via pin-printing with defined material compatibility thresholds.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in lead identification by reducing false negatives from material-induced assay failure.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of screening campaigns based on material-performance data linked to enzyme retention.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sol-gel chemistry, microarray printing, and enzyme assay optimization.
- Depends on contact pin printing robots, environmental chambers with humidity control, and fluorescence imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization of material preparation, printing protocols, and image analysis workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to new enzyme targets or alternative detection modalities.
- Includes practical limitations such as pin clogging from premature gelation and the need for precise humidity control to ensure spot uniformity.
