Grootschalige Gene Knockdown in C. elegans Met behulp van dsRNA Feeding bibliotheken Robuuste verlies-van-functie Fenotypes Genereer

Het algemene doel van deze procedure is om grootschalige RNA-interferentiescreens uit te voeren in C. elegans met behulp van een bacteriële DS RNA-voedingsbibliotheek om genexpressie te onderdrukken. Dit wordt bereikt door eerst bacteriële klonen uit een DS RNA-bibliotheek te kweken. Onder groeiomstandigheden die plasmidverlies voorkomen, begint u met het dupliceren van elke primaire bibliotheekplaat en gebruikt u vervolgens de 96-well duplicaatbibliotheekplaat om tijdelijke stammen bacteriën op agar omni-platen te genereren.

Bacteriën van deze omni-platen worden overnacht in vloeibaar cultuurmedium gekweekt en vervolgens overgebracht naar het oppervlak van wormvoedingsplaten. Elke bacteriële klon uit de bibliotheek draagt een uniek D-S-R-N-A-encoderend plasmide dat één C. elegans-gen voor knockdown target. De tweede stap is om gesynchroniseerde wormen op de voedingsplaten te plaatsen.

Vervolgens worden de wormen gedurende enkele dagen gekweekt in een bevochtigde kamer bij 20 graden Celsius. Terwijl de wormen zich voeden met de bacteriën, worden de geïnduceerde DS RNA's vrijgegeven in de darm van het dier, waar ze zich verspreiden naar de omliggende weefsels om systemische knockdown-effecten te veroorzaken. De laatste stap is om de gevoede dieren te onderzoeken op fenotypische effecten veroorzaakt door genspecifiek knockdown.

Deze fenotypische tests worden gebruikt om genen te identificeren die belangrijk zijn voor het biologische proces dat wordt bestudeerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals micro-injectie van dubbelstrengs RNA's in de wormgonade is dat het een hoge doorvoer heeft. Met behulp van voedingsbibliotheken kunnen we de biologische functie van bijna alle genen van C. elegans in slechts enkele weken onderzoeken.

Veel laboratoria hebben met deze knockdown-aanpak te kampen omdat de meeste genen en C. elegans haplo-sufficiënt zijn. RNA-knockdown moet daarom de genexpressie met meer dan 50% verminderen om functieverliesfenotypen te produceren. Om een robuuste genknockdown te garanderen, is het van cruciaal belang dat alle bacteriën die aan de wormen worden gevoerd, het dubbelstrengs RNA-plasmide tot expressie brengen.

Om de procedure voor het bepalen van plasmideverlies te beginnen, verwijdert u een kleine monster bacteriën zoals beschreven bij elke relevante stap en voegt u deze toe aan 450 microliter steriel water. Gebruik 100 microliter van dit verdunde monster om verdere seriële verdunningen te maken met behulp van steriel water. Meng de oplossingen grondig tussen verdunningsstappen.

Spreid 100 microliter van elke verdunning uit op LB en LB AMP-platen en incubeer ze overnacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag identificeert u de LB-plaat die tussen 100 en 500 bacteriekoloniën bevat. Tel het aantal koloniën op deze plaat en op de corresponderende lb amp-plaat met dezelfde verdunning van bacteriën. Bepaal het plasmideverlies met behulp van deze vergelijking.

Het percentage bacteriën dat het plasmide niet bevat, wordt berekend door het aantal koloniën op de LB amp-plaat af te trekken van het aantal koloniën op de LB-plaat, te delen door het aantal koloniën op de LB-plaat en te vermenigvuldigen met 100. Plasmideverlies wordt voorkomen door bacteriën te kweken in hoge concentraties carbonic sellin Voor effectieve knockdown. Controleer op plasmideverlies voordat u dieren voedt en ga alleen verder als het plasmideverlies minder is dan 15%. Begin deze procedure door dubbele bibliotheekplaten te verwijderen uit de negatieve 80 graden Celsius vriezer. Verwijder het foliezegel terwijl de culturen nog bevroren zijn.

Vervang het plastic deksel van de platen en zet de dubbele bibliotheekplaten op een vlakke ondergrond om gedurende maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur te ontdooien. Steriliseer de buccale 96-pin replicator. Plaats hem in een ethanolbad en verbrand vervolgens de ethanol.

Bedek de pennen door ze uit te slaan met behulp van een bun en brander. Laat de vlam uitdoven en herhaal dit. De pennen van een schone replicator moeten worden gespoeld met gedestilleerd water en vervolgens worden gesteriliseerd voor elke gebruik.

Plaats de gesteriliseerde replicator in de putjes van de ontdooide dubbele plaat en gebruik hem om voorzichtig de culturen te roeren. Kleine volumes van de cultuur zullen zich hechten aan de pennen van de replicator. Verwijder voorzichtig de replicator uit de putjes van de dubbele plaat en plaats hem voorzichtig met de pennen omlaag op het oppervlak van de omni-plaat.

Zorg ervoor dat u het agaroppervlak niet doorboort. Laat de replicator drie tot vier seconden op het oppervlak van de omni-plaat liggen zodat bacteriën van de pennen van de replicator worden overgebracht naar het agaroppervlak. Om plasmideverlies op vaste media te voorkomen, bevat het medium twee milligram per milliliter.

Carbonic sellin. Verwijder de replicator en laat het kleine volume bacteriecultuur absorberen in de agar. Nadat beide platen zijn gedupliceerd.

Incubeer de omni-platen omgekeerd gedurende 15 tot 18 uur bij 37 graden Celsius. Deze omni-platen kunnen worden gebruikt om 96-well vloeibare culturen te inoculeren of worden opgeslagen tot zeven dagen bij vier graden Celsius. Bacteriën voor het voeren van wormen worden bereid als vloeibare culturen met behulp van bacteriën van de omni-platen met behulp van een herhaalde pipetteerder en een 50 milliliter combi-tip, doseer één milliliter bacteriegroeimedium in elke twee milliliter.

Diep wel van een 96-well plaat steriliseer de replicator en plaats hem op het oppervlak van een omni-plaat met bacteriekoloniën, zorg ervoor dat de pennen in contact zijn met elk van de 96 bacteriekoloniën. Verplaats voorzichtig de replicator van het oppervlak van de omni-plaat naar de diep wel plaat, zorg ervoor dat de pennen de zijden van de diepe putjes niet schrapen tot ze ondergedompeld zijn in groeimedium. Om de bacteriën in het groeimedium los te maken.

Beweeg de replicator langzaam in een vierkante beweging langs de binnenwand van de diep wel plaat. Wees voorzichtig om niet te spetteren en elkaar te besmetten. Voor elke 96