Visualiseren van de effecten van een positieve vroege Experience, Tactiel Stimulatie, op dendritische morfologie en Synaptic Connectiviteit met Golgi-Cox kleuring
25 september 2013
Dit artikel beschrijft de procedures voor de tactiele stimulatie van pups rat en de daaropvolgende Golgi-Cox kleuring van neuronale morfologie. Tactiele stimulatie is een positieve ervaring die wordt toegediend in de perinatale periode door strelen pups met een huishouden stofdoek. Golgi-cox kleuring is een betrouwbare procedure waardoor de visualisatie van hele neuronen.
Het algemene doel van deze procedure is om goud G Cox-kleuringstechnieken te gebruiken om de morfologische veranderingen in neuronen te visualiseren die volgen op tactiele stimulatie in de vroege levensfase. Dit wordt bereikt door eerst de tactiele stimulatie drie keer per dag toe te dienen van postnatale dag drie tot postnatale dag 21. De tweede stap is om de dieren te perfunderen zodra ze de onderzoekleeftijd hebben bereikt en hun hersenen te bewaren in een Goldy cos-oplossing.
Vervolgens worden de hersenen in plakken gesneden met Aome. De laatste stap is het impregneren van de hersenen met de GOGI-cocleuringstechniek. Uiteindelijk wordt de GOGI-co-procedure gebruikt om individuele neuronen te visualiseren, wat de analyse van morfologische veranderingen mogelijk maakt.
De kracht van de Goy Cox-techniek is dat deze ons in staat stelt de structuur van neuronen te kwantificeren en dit te correleren met gedragsmatige resultaten. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot ontwikkelingsstoornissen, aangezien is aangetoond dat tactiele stimulatie effectief is voor zowel het gedragsmatige als het anatomische herstel bij deze stoornissen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de neuroanatomie van ratten, kan zij ook worden toegepast op andere modelorganismen en menselijk hersenweefsel.
Om ons begrip van ervaringsafhankelijke plasticiteit verder te vergroten, worden de dieren na de geboorte gehouden op een licht-donkercyclus van 12 uur met vrije toegang tot voedsel en water. Elke vrouwelijke rat wordt individueel gehuisvest met haar nakomelingen. Om extra stress door hantering te voorkomen, ontvangen de pups vanaf P3 tactiele stimulatie.
Nadat de pups vóór de ochtendsessie van tactiele stimulatie zijn gewogen, transporteert u de pups in hun thuiskooien naar een aparte testruimte. Plaats de thuiskooi op een warmtemat die is ingesteld op 24 °C. Wanneer u klaar bent voor de tactiele stimulatie, haalt u de moeders uit hun thuiskooi en plaatst u hen in een tijdelijke kooi met voedsel en water.
Houd de moeder en de tijdelijke kooi in de fokruimte. Gebruik vervolgens een stevig bord om de thuiskooi in twee helften te verdelen. Wijs daarna willekeurig de helft van de pups uit elk nest toe om tactiele stimulatie te ondergaan, waarbij de andere helft als controlegroep dient.
Markeer hun achterpoten en staart met een permanente marker om de groepen te onderscheiden en plaats de pups uit de tactiele stimulatiegroep aan één zijde van de kooi en de controlepups aan de andere zijde. Stel een timer in op 15 minuten en gebruik een zachte, veerachtige plumeau. Borstel alle pups in de tactiele stimulatiegroep gelijktijdig gedurende 15 opeenvolgende minuten.
De jonge ratpupjes kruipen gewoonlijk tegen elkaar aan en lijken in een diepe slaapcyclus te treden, waardoor het zeer eenvoudig is om alle pupjes tegelijkertijd te stimuleren. Naarmate de pupjes ouder worden, worden ze actiever en gaan sommige pupjes lopen en de omgeving verkennen. Verplaats tijdens de sessie alle dwalende pupjes terug naar de groep om ervoor te zorgen dat elk pupje een gelijke stimulatie ontvangt.
Plaats de moeder na 15 minuten tactiele stimulatie terug in de kooi en transporteer de kooi terug naar de fokruimte. Dit proces wordt drie keer per dag herhaald. Spen de jongen 19 dagen na de laatste tactiele stimulatiesessie af van hun moeders. De jongen worden gehuisvest in kooien met vijf of zes andere gespende dieren van hetzelfde geslacht; laat de ratten ongestoord onder standaard huisvestingscondities tot ze de leeftijd van onderzoek hebben bereikt.
Monsters worden verzameld wanneer de dieren 100 dagen oud zijn. Na euthanasie en intracardiale perfusie wordt het brein verwijderd, waarbij zorgvuldig wordt gewaakt over het intact houden van het cerebellum.
Plaats de hersenen in een ondoorzichtige Nalgene-fles gevuld met 20 milliliters Goldy Cox-oplossing, waar ze 14 dagen in blijven. Vervang na 14 dagen de oplossing door een 30%sucrose-oplossing. Bewaar de hersenen twee tot vijf dagen in de sucrose-oplossing voordat ze worden gesneden voor sectievorming.
Dep de hersenen droog voordat ze met Sano acryllijm aan een snijplateau worden bevestigd om scheuren of een ongelijkmatige doorsnede te voorkomen; zorg ervoor dat de gehele hersenen stevig aan het plateau zijn vastgezet. Vul vervolgens het Vibram-reservoir met een 6% sucrose-oplossing totdat het snijmes is bedekt. Stel de snelheid en amplitude van de Vibram in op vijf.
Snijd het brein in secties van 200 micron en plaats de secties op een met 2% gelatine behandeld microscopisch objectglas. Zorg ervoor dat de secties nat blijven tijdens het snijden totdat alle relevante secties zijn verzameld. Druk de secties op de objectglazen door druk uit te oefenen met vochtigig weefselpapier.
Plaats de objectglazen in een objectglasrek en bewaar deze in een vochtigheidskamer gedurende ten minste 12 uur, maar niet langer dan vier dagen. Om de kleuringsprocedure te starten, labelt en bereidt u 12 glazen kleuringsbakjes. Dompel de objectglazen vervolgens één minuut lang onder in gedestilleerd water.
Plaats de objectglazen vervolgens in ammoniumhydroxide en bewaar ze gedurende 30 minuten in het donker. Na nog een minuut in gedestilleerd water worden de objectglazen gedurende 30 minutes in Kodak Fix geplaatst met bescherming tegen licht. Plaats de objectglazen nogmaals in gedestilleerd water voordat ze worden gedehydrateerd in een reeks oplossingen van graduele alcoholconcentraties.
Plaats de objectglaasjes na de laatste alcoholwas gedurende 15 minuten in een een-derde oplossing. Plaats de objectglaasjes tot slot gedurende 15 minuten in hemo D. Gebruik, zodra ze klaar zijn, paramount om de dekglasjes op de objectglaasjes aan te brengen en laat de objectglaasjes aan de lucht drogen voordat ze met een microscoop worden onderzocht.
Hier is een representatieve foto van een met Golgi-Cox gekleurd parametaal neuron in een rat die tijdens de ontwikkeling tactiele stimulatie heeft ontvangen. Een vergrote foto toont dendritische stekels op de terminale dendrieten. De lichtere afbeelding links is van een rat uit de controlegroep en de donkerdere afbeelding is van een rat die tactiele stimulatie heeft ontvangen.
Deze grafiek geeft de gemiddelde apicale en basale dendritische complexiteit weer voor neuronen in het CG drie-gebied van volwassen ratten die tijdens de ontwikkeling wel of geen tactiele stimulatie ontvingen. Door deze procedure te volgen, hebben we het voordeel dat we, indien we aanvullende vragen willen stellen, het hele brein hebben gekleurd en dus hetzelfde hersenweefsel opnieuw kunnen gebruiken om die vragen te beantwoorden. Door deze technieken te ontwikkelen, hebben we de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om het nut van tactiele stimulatie te verkennen als therapie voor de behandeling van hoofdtrauma of andere vormen van neurologisch letsel na het ontstaan ervan.
Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor neurowetenschappelijke onderzoekers om het potentieel ervan te verkennen bij het behandelen van hersentrauma en ontwikkelingsstoornissen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u pups via een wikkelmethode de verrijkende ervaring van tactiele stimulatie kunt bieden, evenals van een methode om individuele neuronen en synapsen te visualiseren.
Overzicht
Deze studie beschrijft de procedures voor tactiele stimulatie van ratpups en de daaropvolgende Golgi-Cox-kleuring van de neuronale morfologie. Tactiele stimulatie wordt toegediend tijdens de perinatale periode, en Golgi-Cox-kleuring maakt de visualisatie van volledige neuronen mogelijk.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Neuroanatomie
Achtergrond
- Tactiele stimulatie kan de neuronale ontwikkeling beïnvloeden.
- Golgi-Cox-kleuring is een methode om neuronale structuren te visualiseren.
- Inzicht in ervaringsafhankelijke plasticiteit is essentieel voor de ontwikkelingsneurowetenschap.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse modelorganismen.
Doel van de studie
- Om de effecten van tactiele stimulatie op de neuronale morfologie te onderzoeken.
- Om structurele veranderingen in neuronen te kwantificeren die verband houden met gedragsmatige resultaten.
- Om de implicaties voor ontwikkelingsstoornissen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Tactiele stimulatie drie keer per dag toegediend van postnatale dag 3 tot 21.
- Perfusie en bewaring van hersenen in Golgi-Cox-oplossing.
- Sectionering van hersenen in coupes van 200 micron voor kleuring.
- Kleuringsprocedures om neuronale morfologie te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Gevisualiseerde morfologische veranderingen in neuronen als gevolg van tactiele stimulatie.
- Gedemonstreerde verschillen in dendritische complexiteit tussen de gestimuleerde groep en de controlegroep.
- Inzichten geboden in de neuroanatomie van ratten en potentiële toepassingen op andere soorten.
Conclusies
- Tactiele stimulatie heeft een positieve invloed op de neuronale ontwikkeling.
- Golgi-Cox-kleuring is effectief voor het analyseren van de neuronale morfologie.
- De bevindingen kunnen bijdragen aan onderzoek naar ontwikkelingsstoornissen en plasticiteit.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Inzicht in hoe ervaringen in de vroege levensfase stabiele neuronale veranderingen teweegbrengen, is essentieel voor het verkleinen van de risico's bij het selecteren van farmacologische targets voor neuro-ontwikkeling. Tactiele stimulatie als gecontroleerde omgevingsvariabele maakt mechanistische analyse van ervaringsafhankelijke plasticiteit mogelijk, wat de validatie van targets bij aandoeningen van het centraal zenuwstelsel ondersteunt. Golgi-Cox-kleuring levert kwantitatieve morfologische resultaten die structurele veranderingen correleren met functionele uitkomsten, waardoor het voorspellend vermogen in preklinische modellen wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe omgevingsstimuli de neuronale morfologie moduleren om therapeutische hypothesen te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om target engagement te beoordelen via read-outs van structurele neuroplasticiteit.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door dendritische veranderingen geïnduceerd door tactiele stimulatie te koppelen aan gedragstherapeutisch herstel in modellen van ontwikkelingsstoornissen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Golgi-Cox-kleuring genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve morfologische gegevens die geschikt zijn voor high-content screening van neuroactieve verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: De techniek levert een consistente visualisatie van neuronen over verschillende nesten heen, wat experimentele ontwerpen over nesten mogelijk maakt voor een robuuste statistische power.
- Schaalbaarheid: Impregnatie van het gehele brein maakt archivering en retrospectieve analyse mogelijk, waardoor hergebruik van de assay voor meerdere onderzoeksvragen wordt ondersteund.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Tactiele stimulatie modelleert interventies in de vroege levensfase die relevant zijn voor neuro-ontwikkelingsstoornissen en trauma-gerelateerde stoornissen.
- Translationele continuïteit: Maakt directe vergelijking van de neuronale morfologie tussen gestimuleerde en controlegroepen mogelijk om de therapeutische effectiviteit te beoordelen.
- Mechanische risicoreductie: Visualiseert veranderingen in dendritische stekels en arborisatie die ten grond liggen aan de synaptische connectiviteit, waardoor ambiguïteit in het werkingsmechanisme wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze workflow ondersteunt vroege ontdekking via targetvalidatie, waarbij tactiele stimulatie dient als omgevingsmodulator en Golgi-Cox-kleuring structurele eindpunten levert voor assayontwikkeling en screeningscascades.
- Ontdekkingsbiologie: Test hoe sensorische input de neuronale architectuur vormt om targets te valideren die betrokken zijn bij ervaringsafhankelijke plasticiteit.
- Screening: Levert kwantificeerbare metrieken voor dendritische complexiteit en stekeldichtheid op om het effect van verschillende verbindingen te vergelijken.
- Analytica: Maakt statistische vergelijking van morfologische parameters tussen experimentele en controlecondities mogelijk.
- Translationeel onderzoek: Verbindt perinatale tactiele stimulatie aan langetermijn neuronale veranderingen die relevant zijn voor modellen van ontwikkelingsstoornissen.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Met Golgi-Cox gekleurde hersenen kunnen opnieuw worden geanalyseerd voor aanvullende targets, waardoor de efficiëntie van de middelen wordt gemaximaliseerd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door neuronale structurele veranderingen geïnduceerd door vroege ervaringen direct te visualiseren.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde kleurings- en snijprotocollen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdstippen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door structureel bewijs te leveren van doelwitmodulatie in preklinische modellen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van het vermogen om ervaringsafhankelijke neuroplasticiteit te herstellen of na te bootsen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neurowetenschappelijke histologie en de omgang met perinatale dieren.
- Afhankelijkheid van Golgi-Cox chemicaliën, apparatuur voor vibratoomsneden en gecontroleerde omgevingskamers.
- Vereist randomisatie over nesten en geblindeerde analyse om bias te minimaliseren.
- Aanpassing aan andere modelorganismen vereist validatie van de kleurefficiëntie en de timing van de ontwikkeling.
- Praktische beperkingen omvatten een langdurig kleuringsschema en technische gevoeligheid voor de bereiding van oplossingen en artefacten bij het snijden.
