Name: Facial Transplantaties in Xenopus laevis Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Leer EAD-weefseltransplantatie in Xenopus laevis embryo's voor craniofaciale ontwikkeling. Deze methode onthult signaleringsinteracties en helpt bij het begrijpen van aangezichtsdeformaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Radek Sindelka voor zijn hulp, en Cas Bresilla voor het assisteren met kikker veeteelt en embryo voorbereiding. Dit werk werd gefinancierd door de NIH via de subsidie ​​R01DE021109 om HLS Laura Jacox werd gefinancierd door de Herschel Smith Graduate Fellowship aan de Harvard University en een F30 individuele beurs subsidie ​​F30DE022989-01 via de NIDCR.

1. Voorbereiden van reagentia <ol><li> 10x MBS: Bereid 1 liter 10x gewijzigd Barth&#39;s Saline (MBS)-oplossing 17. Zie Tabel 1, reagentia, ingrediënten, en instructies. Gebruik gedestilleerd water voor alle oplossingen. Meng in een beker, met behulp van een roerstaafje, tot volledige ontbinding. Alle oplossingen moet worden bij kamertemperatuur. </li><li> 1x MBS: Verdun 100 ml 10x MBS opgelost in 900 ml gedestilleerd water tot 1 liter 1x MBS maken. Voeg 0,7 ml 1 M CaCl2-oplossing. </li><li> 0,1 x MBS: Verdun 1x MBS 1 L van 0,5 x MBS-oplossing en 2 L van 0,1 x MBS te bereiden. Tot 1 L van 0,1 x MBS oplossing, voeg 1 ml van 10 mg / ml gentamycine oplossing. De 0,1 x MBS oplossing met gentamycine zal gebruikt worden voor de lange termijn embryo cultuur. </li><li> Ficoll / MBS Voeg 15 g Ficoll 400 tot 500 ml 0,5 x MBS oplossing. Meng krachtig. Voeg een roerstaafje en meng tot Ficoll volledig is opgelost (enkele uren). </li><li> 70% ethanol: Verdun 100% ethanol 70% ethanol metgedestilleerd water. </li></ol> 2. Voorbereiden van Glass Operating Gereedschap <ol><li> Naald voorbereiding: Load capillaire slang in een naald trekker. <ol><li> Trek de naalden volgens de in tabel 2 instellingen: Naald trekker instellingen. De instellingen voor Sutter Instrument Co Model P-80/PC micropipet trekker en capillaire buizen, zoals beschreven in de tabel specifieke reagentia en apparatuur. Echter, deze instellingen zijn specifiek voor de Sutter naald trekker, en zal moeten worden aangepast voor andere machines. Instellingen kunnen worden bepaald met behulp van een hellingbaan test, zoals gespecificeerd door de fabrikant van de machine. </li><li> Trek 4-6 naalden ter voorbereiding van de procedure. De naald moet zo worden gebroken dat de flexibele, haar-achtige gedeelte van het glas topen volledig is verwijderd, die typisch 2-3 mm lang. De punt moet relatief stijf, maar smal genoeg om als een snij-instrument. Zie foto van een ideaal naald in figuur 1A. </li&gt; <li> Bewaar de naalden in een petrischaal met een strook van klei in het midden. Druk op de as van elke naald in de klei, om het op zijn plaats houden en de fragiele scherpe punt uit de buurt van de bodem en de zijkanten te houden. </li></ol></li><li> Voor extra gereedschap, verkrijgen glas dekglaasjes, een paar lange standaard patroon tang, een bunsenbrander, en 3-4 glazen pasteurpipetten (Grootte 5 ¾ in). </li><li> Pipet tool: Om een pipet tool, licht de bunsenbrander en plaats de punt van een glas Pasteur pipet in het blauwe deel van de vlam tijdens het draaien, zodat de tip smelt en het gat volledig zeehonden, die een gesloten, afgerond eind . De afgeronde, verzegelde tip wordt later gebruikt om depressies te maken in de klei gerecht dat de embryo&#39;s heeft tijdens de operatie. Zie Figuur 1B. </li><li> Glas bruggen: Om glas bruggen maken, gebruiken lange standaard patroon tang om zorgvuldig af te breken 3 mm bij 3 mm brokken van dekglas glas. Terwijl u het stuk van dekglas met tweezers, plaats het glas in de vlam totdat alle vier de randen verzachten en curve naar beneden, de vorming van een kleine glazen koepel. De randen moeten niet langer scherp. Zie figuur 1C. </li><li> Bewaar de glazen afdekplaat slip bruggen door ze, randen naar beneden in boetseerklei, langs de bodem van een petrischaal. Plaats de bruggen zodat de bovenzijde van de brug blijft boven het oppervlak klei. Niet te hard duwen zodanig dat de brug breekt, en niet volledig insluiten de brug in de klei, omdat het moeilijk te verwijderen zijn. Na sterilisatie met een vlam of 70% ethanol, kan de bruggen worden hergebruikt van experiment om te experimenteren. </li></ol> 3. Voorbereiding op de Embryo Operation <ol><li> Lijn een kleine 60 mm plastic petrischaal met boetseerklei. Tussen toepassingen wordt de schotel en klei oppervlak grondig gewassen met gedestilleerd water en daarna met 70% ethanol. OPMERKING: Gebruik rood, wit of geel, Van Aken Plastalina boetseerklei, die kunnen worden gekocht bij een lokale naary of Art Store. Zwarte klei wordt niet aanbevolen omdat het een residu releases. </li><li> Vul de schaal met 3% Ficoll 0.5x MBS oplossing. De hogere zoutconcentratie voorkomt weefsel dissociatie en het polysaccharide Ficoll helpt de oplossing, die helpt bij het houden van het gezicht in stand dikker. </li><li> Gebruik de gevlamde pasteurpipet gereedschap (zie figuur 1) te ondiep, 2-3 mm depressies te maken in de klei, over de diepte van een stadium 20 embryo lichaam. Voeg 20-30 depressies, 1-2 mm uit elkaar, aan weerszijden van de schotel, zodat er in totaal 40-60 depressies. Label ene kant LOF / GOF, en de andere kant wild type, door snijden initialen in de klei met een tang. </li></ol> 4. Preoperation Embryo Voorbereiding <ol><li> Verkrijgen en cultuur Xenopus laevis embryo&#39;s met behulp van standaard methoden 17. Voor een gedetailleerde beschrijving van de kikker veeteelt, zie Sive et al.. 17 <ol><li> Achtenveertig uur voor het experiment obtain eieren van vrouwelijke kikkers en uit te voeren in vitro fertilisatie. </li><li> Injecteer 0,5-1 ng bedekte membraan GFP mRNA plus gewenste mRNA of anti-sense-morfolino gemodificeerde antisense oligonucleotiden (&quot;morfolino&quot;) en de fase van een cel of in 2 cellen bij het stadium van 2 cellen. De ene cel fase duurt ongeveer 70-90 minuten. Injecteer een totaal volume van 1-3 nl. In plaats van RNA dat codeert voor een fluorescent eiwit (zoals GFP of RFP RNA) kan men FITC gemerkte morfolino of fluorescent gelabelde dextran injecteren. De fluorescentie is belangrijk te bepalen of de getransplanteerde weefsel geneest en blijft de weg. </li><li> Capped mRNA kan worden bereid uit een gelineariseerde plasmide met een mMessage mMachine SP6 of T7 kit. Morpholinos kunnen worden ontworpen en besteld via Gene Gereedschap LLC. De hoeveelheid morfolino die voor een gewenst effect moet worden vastgesteld voor elk gen 18. </li><li> Bewaar de geïnjecteerde embryo&#39;s bij 15 ° C gedurende 48 uur, totdat fase 19-20 bereiken. (Fof alle volgende stappen embryo&#39;s volgens de normale tabel van Xenopus laevis bij Nieuwkoop en Faber 19.) OPMERKING: Op de dag van de operatie, moeten zowel ontvanger als donor embryo&#39;s zich binnen een fase van elkaar voor de transplantaties om optimaal te werken. Echter, embryo geïnjecteerd met morpholinos (&quot;morphants&quot;) soms langzamer dan wild-type te ontwikkelen of te beheersen morphant embryo, waardoor het noodzakelijk is om experimenten te coördineren, zodat zowel morphant en wild-type embryo&#39;s zijn in hetzelfde stadium. Morphants moet bij een hogere temperatuur gedurende 12-24 uur voorafgaand aan de procedure te handhaven. Om de kans dat de embryo&#39;s kan worden gevonden op bijpassende fasen te verhogen, kunnen embryo&#39;s worden gehandhaafd op verschillende temperaturen. Vierentwintig uur voorafgaand aan het experiment, moet men de embryo verdelen in verschillende gerechten en morphants plaats bij 18-20 ° C en wildtype embryo bij 15-18 ° C. </li></ol></li><li> Op de dag van de transplantatie-experiment, remove de embryo&#39;s uit 15N ° C incubator en staged ze volgens Nieuwkoop en Faber 19. Als ze jonger zijn dan laat neurula (stadium 19), laat ze bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur, totdat ze het podium 19 bereiken. </li><li> Zeef de geïnjecteerde embryo onder een fluorescentiemicroscoop. Selecteer embryo&#39;s die uniforme, heldere fluorescentie voor het experiment laten zien. </li><li> Verwijder rommel en mogelijke verontreinigingen in de buurt van het werkgebied. Veeg de operationele oppervlakte, stereomicroscoop en alle gereedschappen met 70% ethanol. </li><li> Zodra de embryo&#39;s zijn in de eerste fase 19, verwijder de vitelline membraan met behulp van # 5/45 Dumont tang onder een stereomicroscoop. <ol><li> Verwijder de vitelline membraan van 20-30 voor elke van donor en gastheer embryo. </li><li> Voor de eerste paar gezichtstransplantatie experimenten, moet men oefenen met een paar embryo&#39;s voor elke conditie. De werkwijze is moeilijk en vereist een zorgvuldige oefenen voordat het kan worden gebruikt op een grotere schaal, snel en succesvol. Men kan uwerkp tot het doen van 20 transplantaties / experiment. </li></ol></li><li> Verplaats gastheer embryo&#39;s in de operationele schaal met een kunststof gegradueerde overdracht pipet met de punt afgesneden zodat de opening is veel breder dan een embryo (tenminste enkele millimeters). Wees voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken van embryo&#39;s om luchtbellen of het wateroppervlak, als embryo zal ontploffen in de oppervlaktespanning. </li><li> Gebruik # 5/45 tang om het embryo te voegen in de klei depressies, met de achterkant van het embryo in de klei. Sluit het klei rond de basis van de embryo met de tang, waarbij de bovenste kwart van het embryo, de kop, uitstekend uit de depressie. </li><li> Zodra alle ontvangende embryo zijn vastgezet in hun depressies, naar de andere zijde van de plaat en wordt dan de donor embryo voegen in hun depressies. Herhaal het proces ter waarborging van de embryo&#39;s in de putjes. </li></ol> 5. Het uitvoeren van het Gezicht Transplant Surgery <ol><li> Snijmes: Als een mes voor het verwijderenvan donor EAD weefsel, gebruik een geschikt gebroken glazen capillaire naald (zie stap 2.3 en figuur 1). OPMERKING: Men kan rechtstreeks houd de capillaire tussen de vingers (dit werkt goed voor mensen met kleine handen) of men kan de naald monteren in een insect penhouder. Electrosharpened wolfraam naalden 17 in een penhouder geladen kan worden gebruikt in plaats van een capillair naald. Zie stelde pinhouders en wolfraam naalden in de Tabel van specifieke reagentia en apparatuur. </li><li> Onder een stereomicroscoop, steek de naald in het hoofd van het embryo aan de linkerkant van het cement klier. De naald moet diep worden ingebracht, zodat het passeren van buiten het embryo door het hoofd en in de voordarm. Om het volledige EAD transplantatie dient sneden zich vanaf de buitenkant van de embryo de voordarm. Alleen voor-ectoderm transplantaties, moet bezuinigingen ondieper zijn en zich slechts door het ectoderm. <ol><li> Flick de naald van de linker naar de rechterkant van dehoofd, over de gehele breedte van het cement klier. Het tikken is belangrijk als de beweging geeft een zuivere snede. Raadpleeg Figuur 2A voor een overzicht van de techniek en figuur 2B voor een demonstratie van de bezuinigingen. Het cement klier en de ogen zijn belangrijke mijlpalen voor de bezuinigingen. De volgorde van de bezuinigingen heeft geen invloed op de uitkomst en kan variëren op basis van voorkeur of handigheid van de gebruiker. </li></ol></li><li> Plaats de naald aan het begin van de vorige snede, aan de linkerrand van het cement klier en flick de naald omhoog tot aan de onderkant van de linker oog bereikt. Dit zal een verticale snede van de linkerrand van het cement klier onderaan het linkeroog maken. </li><li> Plaats de naald aan de rechterrand van het cement klier en flick de naald omhoog tot aan de bodem van het rechteroog bereikt. Dit zal een verticale snede van de rechterrand van het cement klier onderaan het rechteroog maken. </li><li> Om volledig accijnzen het weefsel, flick de naald uit de bodem van het linkeroog onderaan het rechteroog, waardoor een horizontale snede dat het weefsel vrij. Cuts kan zich uitstrekken van de buitenkant van het embryo naar de voordarm, zowel ectoderm en endoderm in de EAD explantaat. Als alternatief kunt ondiepe sneden worden gebruikt voor ectoderm alleen-EAD transplantaties. Zodra de EAD weefsel wordt verwijderd, moet er een rechthoekig gat van de buitenkant van het embryo in de voordarm zijn, zich van het cement klier tot net onder de ogen (boven naar beneden). Het gat moet uitstrekken van de binnenrand van het linker oog naar de binnenrand van het rechter oog (links naar rechts). Zie afbeelding 2Bb. </li><li> Duw de weggesneden weefsel op de punt van de naald, en til het door de buffer naar het deel van het schaaltje met gastheer embryo&#39;s. Stel het weefsel niet bloot aan de oppervlakte lucht of het zal worden beschadigd. </li><li> Accijnzen hetzelfde weefsel van de gastheer embryo, als de donor. Gooi de gastheer EAD explant of opslaan op insertiet in de donor gezicht, voor wederzijdse transplantaties. </li><li> Plaats de donor explant in de resulterende gastheer gat met behulp van # 5/45 tang. </li><li> Zodra het donorweefsel correct geplaatst is en goed geplaatst, zorgvuldig plaats een glazen brug (zie Figuur 1 en Figuur 2BC) over het gezicht van de embryo&#39;s om de transplantatie plaats te houden. De uiteinden van de brug moet invoegen in de klei, die het op zijn plaats. De brug moet voorzichtig druk uitoefenen op het getransplanteerde weefsel, zodanig dat de transplantatie gelijk ligt met de gastheer hoofd, zonder het steken van het hoofd of liggen diep in het hoofd. Het hoofd kan enigszins worden afgevlakt door de cover slip, maar wees voorzichtig het embryo niet te beschadigen met te veel druk. Transplantaties worden uitgevoerd binnen 5 minuten. OPMERKING: Een ervaren onderzoeker kan ongeveer twintig transplantaties uit te voeren per experiment, meer dan 2-3 uur. Gedurende deze periode zal de embryo&#39;s de voortgang van fase 20-22. Het invullen van de gezichtstransplantaties in stap 21 of 22 heeft geen invloed op de resultaten. Later transplantaties (stadia 22-26) kan worden gedaan, maar zijn moeilijker als de-kuif gratis EAD middellijn regio wordt versmald als craniale neurale lijst beweegt in het gezicht. Consistentie in transplantaties is van cruciaal belang. </li></ol> 6. Gezicht Transplant Post-operatie Recovery <ol><li> Genezing duurt meestal 2-3 uur. Verlaat de embryo&#39;s bij kamertemperatuur ongestoord in hun klei depressies met de glazen bruggen die het donorweefsel op zijn plaats. </li><li> Zodra de transplantaties zijn genezen, verwijder voorzichtig de glazen bruggen, verwijder de klei uit rond de basis van de embryo&#39;s met behulp van een tang, en gebruik een plastic afgestudeerd transferpipet om voorzichtig stofzuigen de embryo&#39;s uit hun depressies. </li><li> Doe de embryo&#39;s in een geschikt gemerkte petrischaal, half gevuld met schoon 0.1x MBS met gentamycine. </li><li> Groeien de embryo&#39;s bij 15 ° C of 18 ° C gedurende enkele dagen totdat ze voeden kikkervisje stadium stadium 40, wduivin gezicht fenotypes kan worden gescoord. <ol><li> De 0,1 x MBS oplossing met gentamycine moet dagelijks worden veranderd, en eventuele dode embryo&#39;s moet onmiddellijk worden verwijderd om besmetting en de dood van andere embryo&#39;s te voorkomen. </li><li> De mond opent in fase 40. In fase 40-41, moet men controleren dat het getransplanteerde weefsel blijft genezen in plaats door het bekijken van de fluorescentie. Transplantaties af en toe vallen, dus moet men ervoor zorgen dat alle scoorde embryo&#39;s hebben het donorweefsel op zijn plaats. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGorlin%2C+RJ+%22Syndromes+of+the+head+and+neck%22">Syndromes of the head and neck</a>. , Oxford University Press. UK. (1990).</li>
<li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gen.+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+primary+mouth+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Development of the primary mouth in Xenopus laevis.</a> Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positioning+the+extreme+anterior+in+Xenopus%3A+cement+gland%2C+primary+mouth+and+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Cell+Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary.</a> Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).</li>
<li>Dickinson, A. J., Sive, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li>
<li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilbert%2C+SF+%22Developmental+Biology%22">Developmental Biology</a>. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li>
<li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm%3A+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li>
<li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeogenetic+neural+induction+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Homeogenetic neural induction in Xenopus.</a> Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).</li>
<li>Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triple+origin+of+skull+in+higher+vertebrates%3A+a+study+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras.</a> Dev. 117, 409-429 (1993).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+%3A+I%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+relationships+between+placodes%2C+facial+ectoderm%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li>
<li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds%3A+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li>
<li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li>
<li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis%3A+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Bio%22%5BJournal%5D)">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li>
<li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%22">Early Development of Xenopus laevis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino+injection+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , Garland Publishing. New York. (1994).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische stappen en beperkingen: De EAD gezicht transplantatie procedure is tijd en arbeidsintensief. Het vereist oefening, een vaste hand, en behendigheid te perfectioneren. Het gezicht transplantatie protocol is gebaseerd op het vermogen van de onderzoeker om efficiënt te verwijderen en de transplantatie weefsel. Als men te lang duurt om de transplantatie te voegen in het gezicht van de gastheer, zal de gastheer gezicht beginnen te contracteren en te genezen. Tang kan worden gebruikt om delicaat breiden het ge...

Naar onderliggende mechanismen van craniofaciale aangeboren afwijkingen 1-2, belangrijke weefsels en hun signalering bijdragen tijdens craniofaciale ontwikkeling te begrijpen moeten worden geïdentificeerd. In de kikker Xenopus laevis, een deel van het gezicht, zoals de mond en neus vorm van de &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), waarbij ectoderm en endoderm direct naast elkaar 3-4. De EAD fungeert ook als een signalering centrum omliggende weefsels, waaronder de craniale neurale lijst, die de kaken en andere gezichtgebied 5 vormt beïnvloeden. Om genen die bijdragen aan EAD functie te identificeren, werd een &#39;gezicht transplantatie-techniek ontwikkeld, waarbij weefsel wordt getransplanteerd van een donor in een gastheer embryo, na het verwijderen van de bijbehorende host-regio. Na de transplantatie, resulterende gezicht ontwikkeling wordt beoordeeld. Aldus worden de effecten van functieverlies (LOF) of overexpressie-(GOF) voor een specifiek gen in de EAD lokaal geanalyseerd waar de rest van de hEAD en lichaam is samengesteld uit wild-type weefsel. De wederzijdse transplantatie kan worden uitgevoerd, waarbij wild-type weefsel wordt getransplanteerd in embryo&#39;s met wereldwijde LOF of GOF in specifieke genen. Transplantatie is vaak gebruikt in Xenopus en chick bestudeert 6. Zo heeft Xenopus transplantatie gericht homogenetic neurale inductie, lens en neurale competentie, en de neurale lijst migratie 7-10. Kwartel-chick chimere enten heeft de ontwikkeling van de voorste neurale plaat, voorste neurale kam, neurale en schedelbeenderen 11-14 geanalyseerd. Dit is de eerste transplantatie techniek voor onderzoek van craniofaciale ontwikkeling in Xenopus. Deze techniek heeft een nieuwe rol voor de Wnt-remmers Frzb1 en Crescent in het reguleren van de basale membraan vorming in de vermoedelijke mond 5 aangetoond. Xenopus laevis is een ideaal model voor de studie van craniofaciale ontwikkeling als embryo&#39;s zijn groot, ontwikkelen extern, eennd het gezicht is goed zichtbaar, waardoor micromanipulatie en beeldvorming van ontwikkeling. Onderliggende mechanismen gezichtsontwikkeling verschijnen geconserveerd, wat aangeeft dat de bevindingen in de kikker geven inzicht in de menselijke ontwikkeling 4,15-16.

<table><tbody><tr><td>Pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>Lime Glass&nbsp;</td></tr><tr><td>Size 5 3/4 in</td><td>Cotton Plugged</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graduated Transfer Pipette</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td>Disposable&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools by Dupont medical</td><td>11251-35</td><td>Angled 45&deg;</td></tr><tr><td>Standard Pattern Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-20</td><td>Straight; serrated tip; stainless steel</td></tr><tr><td>Capillary Tubing (for needles)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber</td></tr><tr><td>Cover slip&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp;micro cover glass;</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td><td>The most similar, currently available&nbsp; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.</td></tr><tr><td>Model P-80</td><td>Flaming / Brown micropipette puller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope Lighting by Fostec</td><td>Fostec</td><td></td><td>Use a light box with 2 fiberoptic arms.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Jaw Opening Diameter: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Jaw opening Diameter: 0-1 mm</td></tr><tr><td>Tungsten Needles</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>0.125 mm Rod diameter</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr><tr><td>Modeling Clay- white, red, or yellow</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

facial transplantaties in<em&gt; xenopus laevis</em&gt; embryo&#39;s

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofaciale aangeboren afwijkingen voorkomen bij 1 op de 700 levendgeborenen, maar etiologie is zelden bekend vanwege de beperkte kennis van craniofaciale ontwikkeling. Om te bepalen waar signaalwegen en weefsels handelen tijdens patroonvorming van de zich ontwikkelende gezicht, heeft een &#39;gezicht transplantatie-techniek is ontwikkeld in embryo&#39;s van de kikker Xenopus laevis. Een gebied van vermoedelijke tissues (de &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD)) wordt verwijderd uit een donor embryo in tailbud stadium en getransplanteerd naar een gastheer embryo van dezelfde fase, waarvan de equivalente gebied is verwijderd. Dit kan worden gebruikt om een ​​chimeer gezicht waarbij de gastheer of donor weefsel heeft een verlies of winst van functie in een gen en / of omvat een geslacht label genereren. Na genezing is het resultaat van ontwikkeling gevolgd, en geeft aan rollen van de signalerende weg binnen de donor of de omliggende weefsels van de gastheer. Xenopus is een waardevol model voor gezicht ontwikkeling, zoals het gezicht regio is groot en gemakkelijk eenccessible voor micromanipulatie. Veel embryo&#39;s kunnen worden getest, gedurende een korte periode sinds de ontwikkeling snel optreedt. Bevindingen in de kikker zijn aan de menselijke ontwikkeling relevant, aangezien craniofaciale processen lijken geconserveerd tussen Xenopus en zoogdieren.

Getransplanteerde weefsel moeten volledig worden ingebracht in de gastheer kop na transplantatie zoals getoond in figuur 3A, en een glazen brug adequaat op het gezicht van de embryo&#39;s geplaatst, zie figuur 2BC. De getransplanteerde donorweefsel moet correct worden gedimensioneerd voor de host opening, voor de transplantatie succesvol te zijn. De EAD weefsel moet niet uitsteken van de kop, op enige wijze, zoals getoond in figuren 3B en 3C. Bovendien ...

Een techniek voor het transplanteren &quot;Extreme Voorste Domain&quot; tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Het algemene doel van deze procedure is om weefsel van het extreme anterieure domein (EAD) van het gezicht te transplanteren tussen Xenopus laevis-embryo's. Dit wordt bereikt door eerst het EAD-weefsel te verwijderen uit donor- en recipientembryo's met verschillende genetische achtergronden. Vervolgens worden de EAD-explantaten van de donorembryo's in de gezichten van de recipientembryo's geplaatst.In de laatste stap worden de getransplanteerde embryo's gedurende 60 tot 70 uur na de bevruchting in stand gehouden voor observatie. Uiteindelijk kan brightfield- en fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om veranderingen in de craniofaciale ontwikkeling van de getransplanteerde dieren waar te nemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de craniofaciale ontwikkeling om ons begrip van craniofaciale misvormingen te verbeteren, zoals nieuwe signalen die nodig zijn voor de ontwikkeling van de orale holte vanuit het uiterste anterieure domein. Laad vóór de operatie capillaire buisjes in een naaldtrekker en trek vervolgens vier tot zes naalden, waarbij elke naal wordt gebroken zodat het flexibele, haarachtige glasgedeelte van twee tot drie millimeter aan de tip volledig wordt verwijderd.De punt moet relatief stijf zijn, maar smal genoeg om als snijinstrument gebruikt te worden. Steek vervolgens een bunsenbrander aan en plaats de punt van een glazen pasteurpipet in het blauwe deel van de vlam; draai de pipet zodanig dat de punt smelt en de opening volledig wordt afgesloten, waardoor een gesloten afgerond uiteinde ontstaat. Om glazen bruggetjes te maken, gebruikt u lange standaard pincetten om voorzichtig stukjes dekglas van drie millimeter bij drie millimeter af te breken.Houd vervolgens het stukje dekglas met een pincet vast en plaats het glas in de vlam tot alle vier de randen zacht worden en naar beneden buigen, waardoor een kleine glazen koepel ontstaat. Bekleed daarna een plastic Petrischalen van 60 millimeter met rode, witte of gele boetseerklei. Vul de schaal vervolgens met 3%phi.Bereid een 0,5 XMBS-oplossing voor. Gebruik vervolgens het gevlamde weefsel, uw pipetpunt, om 40 tot 60 ondiepe inkepingen van twee tot drie millimeter, ter grootte van het lichaam van een embryo in stadium 20, in de klei te maken, 48 uur vóór het experiment. Verkrijg eitjes van vrouwelijke kikkers en bevucht deze in vitro.Sla de embryo's na injectie met gecapte membraan-GFP mRNA en eventuele andere boodschappers-RNA 48 uur lang op bij 15 °C totdat ze stadium 19 tot 20 bereiken. Gebruik op de dag van het transplantatie-experiment een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde embryo's te selecteren die een uniforme, heldere fluorescentie vertonen. Nadat het werkoppervlak, de stereomicroscoop en de instrumenten zijn gereinigd met 70% ethanol, wordt een Dumont nr. 5 45 pincet gebruikt om het vitelline membraan van elk geselecteerd embryo onder een stereomicroscoop te verwijderen.Gebruik vervolgens een plastic maatpipet met een afgeknipt uiteinde om de gastembryo's naar de operatieschaal te verplaatsen. Zorg ervoor dat de embryo's de overgang tussen lucht en water niet raken. Plaats de embryo's met de achterzijde naar beneden in de inkepingen van de klei en gebruik de pincet om de klei voorzichtig rond de basis van elk embryo te sluiten, zodat de kop uit de inkeping steekt. Om de donor eerst aan de voorzijde te verwijderen, steekt u een van de getrokken naalden in de kop van het embryo links van de cementklier, diep genoeg zodat deze van buitenaf door de kop en in het voor-darmkanaal gaat.Beweeg de naald met een snelle tik van de linker- naar de rechterzijde van de kop over de volledige breedte van de cementklier om een schone snede te maken. Plaats vervolgens de naald aan het begin van de snede bij de linkerzijde van de cementklier en tik de naald omhoog tot deze de onderkant van het linker oog bereikt, om zo een verticale snede te maken van de linkerzijde van de cementklier naar de onderkant van het linker oog. Plaats daarna de naald bij de rechterzijde van de cementklier en tik de naald omhoog tot deze de onderkant van het rechter oog bereikt, om een verticale snede te maken van de rechterzijde van de cementklier naar de onderkant van het rechter oog.Om het weefsel vervolgens volledig uit te snijden, beweegt u de naald met een korte tik van de onderkant van het linker- naar de onderkant van het rechteroog, waardoor een horizontale snede ontstaat die het weefsel losmaakt. Duw het uitgesneden weefsel nu voorzichtig tegen de punt van de naald en til het door de buffer naar het deel van de schaal met de gastembryo's. Snijd het weefsel uit het gastembryo zoals zojuist gedemonstreerd, waarbij de gast en het EAD-explant worden weggegooid en het donor-explant in het ontstane gat van de gast wordt geplaatst.Zodra het donorgeweefsel correct is gepositioneerd en voorzichtig volledig is ingebracht, plaatst u een van de eerder voorbereide glazen bruggetjes over het gezicht van het embryo om het transplantaat op zijn plaats te houden, waarbij de uiteinden van het bruggetje in de klei worden gestoken ter stabilisatie. Laat de embryo's na de operatie twee tot drie uur ongestoord rusten bij kamertemperatuur. Wanneer de transplantaten zijn genezen, verwijdert u vervolgens voorzichtig de glazen bruggetjes van de embryo's en de klei rond de basis van de embryo's.Gebruik vervolgens een plastic gegradueerde transferpipet om de embryo's voorzichtig met vacuüm uit hun uitsparingen te zuigen. Breng de embryo's over naar een passend gelabelde Petrischaal, half gevuld met schone 0,1 XMBS aangevuld met Gentamicine, en laat de embryo's gedurende enkele dagen bij 15 tot 18 °C groeien tot ze stadium 40 bereiken. Vervang de MBS-oplossing dagelijks en bekijk het getransplanteerde weefsel via fluorescentie om te bevestigen dat het explantaat goed is vastgeheeld.Getransplanteerde weefsels moeten na transplantatie volledig in de kop van de gastheer zijn ingevoegd, zoals zojuist gedemonstreerd, en moeten de juiste afmetingen hebben ten opzichte van de opening van de gastheer om de transplantatie succesvol te laten verlopen. Het EAD-weefsel mag op geen enkele wijze uit de kop steken, zoals te zien is op deze twee afbeeldingen van onjuist geplaatste explantaten. Daarnaast mag het gezichtstransplantat niet gedraaid zijn ten opzichte van de positie in het donorlichaam, zoals hier wordt getoond.Na enkele uren moeten het getransplanteerde weefsel en het omliggende gezicht zijn genezen, en tegen de volgende dag zou het embryo eruit moeten zien als het voorbeeld in deze afbeeldingen; zoals zojuist gedemonstreerd kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om te bevestigen dat het transplantaat op zijn plaats is gebleven tijdens het genezingsproces. In stadium 42 zal het getransplanteerde controleweefsel bijdragen aan de mond en fluorescent groen blijven. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u EAD-weefsel van het ene embryo naar het andere transplanteert.Het vergemakkelijken van het gebruik van deze methode om te identificeren welk kiemblad of welke regio van de EAD het meest cruciaal is voor de gezichtsontwikkeling.

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebravis celtransplantatie maakt de combinatie van genetica en embryologie aan het weefsel specifieke hersenschimmen te genereren. Deze video toont gastrula geënsceneerde cel transplantaties die hebben onze lab naar de rol van astroglial bevolking en de specifieke begeleiding signalen tijdens commissuur vorming in de voorhersenen te onderzoeken.

Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Animal caps overexpressie genproduct (s) worden getransplanteerd om de flank van de ontwikkeling...

Weefsel Bepaling Met behulp van de Animal Cap Transplantatie (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Deze video toont een protocol methode voor het genereren van...

De productie van transgene Xenopus laevis Door restrictie-enzym Mediated Integratie en nucleaire transplantatie

Craniofaciale kraakbeen te ontwikkelen in nauw contact met andere weefsels en zijn moeilijk te manipuleren in levende dieren. Wij maken gebruik van elektroporatie van moleculaire tools te leveren tijdens de groei van het craniofaciale skelet, terwijl het omzeilen van de vroege embryonale effecten. Deze aanpak stelt ons in staat om efficiënt te testen...

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

Werkwijze voor het orofaciale grootte en vorm van Xenopus laevis embryo kwantificeren ontwikkeld. In dit protocol worden metingen traditionele formaat gecombineerd met geometrische morfometrie te zorgen voor meer geavanceerde analyses van orofaciale ontwikkeling en defecten.

Kwantificering van Orofacial Phenotypes in Xenopus

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

Dit protocol is bedoeld om te laten zien hoe een DNA/DOTAP mengsel microinjecteert in de eyebuds van een dag oude Xenopus laevis embryo's, en hoe te beeld en reconstrueren individuele groene fluorescerende eiwitten (GFP) uitdrukken optische axonale Arbors in tectal midbrains van intact, levende Xenopus tadpoles.

Micro injectie van DNA in de Oogtoppen van Xenopus laevis embryo's en beeldvorming van GFP dat optische axonale Arbors uitdrukt in intact, levend Xenopus tadpoles

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

Embryologische manipulaties zoals uitroeiing en transplantatie van cellen zijn belangrijke hulpmiddelen om vroege ontwikkeling te bestuderen. Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat om deze manipulaties uit te voeren in zebravisembryo's.

Een eenvoudig en effectief transplantatieapparaat voor zebravisembryo's

Leer EAD-weefseltransplantatie in Xenopus laevis embryo's voor craniofaciale ontwikkeling. Deze methode onthult signaleringsinteracties en helpt bij het begrijpen van aangezichtsdeformaties.

Facial Transplantaties in

Meer video's verkennen