Name: Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryos: Analyse van Spinal Cord Development (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het prepareren en horizontaal monteren van zebrafishembryo's om het ruggenmerg te visualiseren. Deze techniek optimaliseert fluorescente en lichtmicroscopie voor neurobiologisch onderzoek naar axonleiding en differentiatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Skidmore Faculty Development Grant financierde de voorbereiding en publicatie van dit manuscript.

1. Montage Embryo&#39;s (na voltooiing van Selected Visualisatie Techniek, zoals Immunocytochemie, in situ hybridisatie, enz.) <ol><li> Plaats embryo&#39;s in een schotel 35 mm Petri gevuld met buffer keuze (figuur 1A). De keuze van buffer is gebaseerd op de labelingsprocedure. Typisch PBS-gebaseerde buffers geschikt. </li><li> Onder een microscoop ontleden, en met behulp van een tang, zet de kop met een pincet en trek de dooier weg met het andere paar (Figuur 1B). U kunt ook een insect pin in een insect penhouder om zachtjes weg te trekken van de dooier. </li><li> Met behulp van de embryo poker (vislijn (0,41 mm diameter) gelijmd om ofwel een capillaire buis of een Pasteur pipet) bewegen de embryo&#39;s om een deel van de petrischaal die niet beschikt over veel dooier puin (Figuren 1C-D). </li><li> Met behulp van een glas Pasteur pipet, zuig het embryo in zo weinig mogelijk vocht, en gze ently pipet op een dia (figuur 1E). </li><li> Zachtjes lont overtollige vloeistof met behulp van een laboratorium doekje. Vermijd contact met embryo&#39;s. </li><li> Voeg een druppel montage medium om embryo&#39;s. Voor fluorescente labels, gebruik een antifade reagens keuze. Voor colorimetrische signalen kan 70% glycerol gebruikt als een fixeermiddel. </li><li> Met behulp van de embryo poker, oriënteren de embryo&#39;s op hun kant in rijen (Figuur 1F). </li><li> Voeg een &quot;schar&quot; vaseline of hoog vacuüm vet aan elke hoek van een dekglaasje (figuur 1G). Dit voorkomt beschadiging van het embryo van overmatige compressie. </li><li> Plaats dekglaasje (vaseline naar beneden) bovenop embryo (Figuur 1H). </li><li> Tik op de dekglaasje op elke hoek zachtjes tot de montage media (70% glycerol of anti-fade montage reagens) raakt het dekglaasje (Figuur 1H). </li><li> , Voeg meer montage media door pipetteren direct naast de cov indien nodigerslip behulp van een pipet in het traject van 20-200 ml. Het zal onder lont. </li><li> Met behulp van een laboratorium te vegen, helemaal schoon rond het dekglaasje. Wees zeker niet druk op het dekglaasje, omdat deze embryo beschadigen. Dit gebied moet droog zijn en geen vaseline of montage media op. </li><li> Gebruik nagellak voor afdichting rond de rand van het dekglaasje (Figuur 1I). </li></ol>

<ol><li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li>
<li>Ross, A. B. J. Activation of Wnt signaling using Lithium Chloride: Inquiry-Based Undergraduate Laboratory Exercises. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoss%2C+ABJ+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , In Press. (2012).</li>
<li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+patterning+are+mediated+independently+in+the+dorsal+spinal+cord+downstream+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proliferation and patterning are mediated independently in the dorsal spinal cord downstream of canonical Wnt signaling.</a> Dev. Biol. 313 (1), 398-407 (2008).</li>
<li>Gribble, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf3+inhibits+spinal+cord+neurogenesis+by+regulating+sox4a+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tcf3 inhibits spinal cord neurogenesis by regulating sox4a expression.</a> Development. 136 (5), 781-789 (2009).</li>
<li>England, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Hedgehog+pathway+components+and+retinoic+acid+signalling+in+specifying+zebrafish+ventral+spinal+cord+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Roles of Hedgehog pathway components and retinoic acid signalling in specifying zebrafish ventral spinal cord neurons.</a> Development. 138 (23), 5121-5134 (2011).</li>
<li>Challa, A. K., Beattie, C. E., Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+roundabout+orthologs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of roundabout orthologs in zebrafish.</a> Mech Dev. (1-2), 101-101 (2001).</li>
<li>Lee, J. S., Ray, R., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+three+zebrafish+roundabout+homologs+suggest+roles+in+axon+guidance+and+cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of three zebrafish roundabout homologs suggest roles in axon guidance and cell.</a> 221 (2), 216-230 (2001).</li>
<li>Downes, G. B., Waterbury, J. A., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+labeling+of+identified+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo labeling of identified zebrafish neurons.</a> Genesis. 34 (3), 196-202 (2002).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-regulated+oligodendrocyte+specification+from+radial+glia+in+the+spinal+cord+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Notch-regulated oligodendrocyte specification from radial glia in the spinal cord of zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 237 (8), 2081-2089 (2008).</li>
<li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li>
<li>de Soysa, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macondo+crude+oil+from+the+Deepwater+Horizon+oil+spill+disrupts+specific+developmental+processes+during+zebrafish+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Macondo crude oil from the Deepwater Horizon oil spill disrupts specific developmental processes during zebrafish embryogenesis.</a> BMC Biol. 10 (40), (2012).</li>
<li>Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li>
<li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras%3A+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li>
</ol>

Geen concurrerende financiële belangen bestaan ​​voor zowel auteur.

Laterale montage van vaste zebravis embryo steun visualisatie van ruggenmerg ontwikkeling. Door het verwijderen van de dooier bal, is de werkafstand nodig is voor uitzonderlijke microscopische beeldvorming gereduceerd. De representatieve resultaten zijn beperkt tot de 24 HPF stadium echter kan deze techniek al 18 HPF worden gebruikt, maar eerder embryo zijn moeilijker te ontleden vanwege de grootte van de embryo en de kwetsbaarheid van het weefsel. Deze techniek is ook toepasbaar op embryo&#39;s ouder dan 24 HPF. Geholpen door de optische helderheid van de embryonale zebravis, de mogelijkheid om voorwaartse genetische screens uitvoeren reverse genetica en transgene benaderingen kunnen diverse ontwikkelingsprocessen onderzocht. Dit omvat mitotische indexen van neuronale voorlopercellen met markers zoals BrdU en anti-fosfo-histon 04-06 maart en patroonvorming door expressie van neuronale en gliale voorlopercellen markers in de pax, NKX, dbx, en olig families 1,4-6. Reagentia die gliale en neuronale bepaling (zoals gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en HuC / D) bericht 1,4,5,10 worden gebruikt. Neuronale subtype differentiatie kan worden geanalyseerd door middel van expressie van eilandje, VSX, engrailed en gata genen 1,4-6. Tenslotte analyse van axon begeleiding mogelijk door antilichamen zoals anti-geacetyleerd tubuline, 3A10 en ZNP-1 2,11,12. Hoewel andere vertebrate modelsystemen (muis en kuiken) worden gebruikt ruggenmerg ontwikkeling bestuderen, alleen de zebravis toelaat gelijktijdig bekijken van alle ontwikkelings assen in het intacte embryo. De duidelijke beperking van deze benadering is dat de embryo&#39;s worden vastgesteld met live imaging uitsluit. In feite, verwijderen (of beschadiging) van de dooier resulteert in een snelle embryonale sterfte, dus is het niet mogelijk de werkafstand in levende embryo&#39;s met deze techniek te verminderen. Echter, een hoge vergrotingsfactor spinale cord beeldvorming in levende embryo&#39;s is mogelijk. Om de dooier in levende beeldvorming sparen, embryo depressie dia, die een grotere ruimte tussen het monster en het dekglaasje voorzien worden geplaatst. Als alternatief kan een aantal 22 mm x 22 mm dekglaasjes worden gelijmd aan elke dia van een 3 in 1 x in microscopisch preparaat. De dekglaasjes dienen als een &quot;brug&quot; voor de bovenliggende dekglaasje. Als embryo&#39;s ouder dan 18 HPF, wordt tricaïne gebruikt om embryo&#39;s te verdoven om verplaatsing te voorkomen. Terwijl een werkafstand van 0,288 mm is vereist voor deyolked embryo&#39;s in 24 HPF, bij het werken met levende embryo&#39;s ingebed in agarose, met intacte dooiers, een microscopische lens met een werkafstand van 3,3 mm is voldoende. Alternatief kan explantkweken ontleend deyolked embryo worden gevisualiseerd met behulp van een plasma stolsel immobilisatietechniek 13. Verschillende populaties van cellen kan worden waargenomen door het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals GFP, mCherry of de photoconconverteerbare kleurstof Kaede (om een ​​paar te noemen). Verder kan fluorescent gelabelde cellen in chimère embryo ook gezien met deze benadering 14. Een consistente montage techniek die is stabiel gedurende maanden is een essentieel instrument voor de ontwikkelingsbiologie en celbiologen. Deze eenvoudige techniek is reproduceerbaar, zodat u gemakkelijk de vergelijking tussen verschillende experimentele studies. Bovendien is de uitlijning van embryo&#39;s in rijen gemakkelijk maakt dat specifieke embryo voor latere analyse.

Visualisatie van het ruggenmerg in zebravis wordt geremd door een aantal factoren. Door de dikte van de bovenliggende somieten en interne locatie van het ruggenmerg, wordt een aanzienlijk lange werkafstand vereist voor hoge cellulaire resolutie. De dooier bal (die nog steeds aanwezig is tijdens de vroege stadia van neurogenese) verhoogt verder de werkafstand nodig, en kan gemakkelijk beschadigd raken door de druk van een dekglaasje. Daarnaast puin van beschadigde dooier verbiedt duidelijke visualisatie van weefsels. Hoewel dwarsdoorsneden in de dorso-ventrale (DV)-as zijn mogelijk, ze niet gemakkelijk toestaan ​​gelijktijdige visualisatie in de anterior-posterior (AP) as 1. Om deze hindernissen te overwinnen, worden embryo&#39;s ontleed en gemonteerd op dia&#39;s. Deze procedure biedt een aantal voordelen. Eerste, zebravis embryo gemakkelijk liggen met de zijkant naar boven, die AP as visualisatie vergemakkelijkt. Ten tweede, het verwijderen van de dooier ball vermindert de vereiste werkafstand, en beperkt puin. Ten derde, deze montage procedure kan zowel voor TL-en helderveld microscopie. Vierde gemonteerde embryo stabiel maanden bij 4 ° C, waardoor langdurige specimen visualisatie. Tenslotte, de progressie van de ontwikkeling vindt plaats in die voorste segmenten zijn volwassener dan achterste segmenten. Om ervoor te zorgen dat afgestemd spinale hemisegments geënsceneerd worden vergeleken tussen embryo&#39;s, wordt bovenliggende somiet weefsel als leidraad gebruikt. Bijvoorbeeld, de tiende meest achterste somite ligt over de tiende spinale hemisegment, wat ontwikkelingsgebied gelijkwaardig stadium embryo afgestemd. Deze montage procedure van intacte embryo maakt een eenvoudige identificatie van de somieten. We maken gebruik van genetica en gen knock-down technologieën om de mechanismen van axon begeleiding studeren in de ontwikkeling van het ruggenmerg. In het bijzonder, hebben wij vastgesteld dat robo2, robo3 en DCC zijn vereist voor commissurale Primaire AsceNding (COPA) axon pathfinding. Met behulp van de montage-procedure hier beschreven, konden we ventrale groei, middellijn kruising, commissuur breedte-, rug-en anterieure groei 2,3 onderzoeken. Deze montageprocedure kan ook worden toegepast op DV of AP patroonvorming van het ruggenmerg. Wij hebben deze procedure gebruikt om uiteenlopende rollen van stroomafwaartse effectoren Wnt DV patroonvorming van het ruggenmerg bepalen. Met behulp van deze bevestiging, waren we in staat om de resolutie van DV markers te verkrijgen bij de enkele cel niveau, en bepalen minuut patronen verschuivingen als gevolg van veranderde Wnt signaalontvangst 4,5. Deze montage-procedure maakt het ook voor de mitotische index berekening door middel van anti-phosphohistone 3 of BrdU etikettering (voorlopercellen proliferatie) differentiatie 5.

<table><tbody><tr><td>Petrischalen 35 mm x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td> Dumont Pincetten #3 </td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9839169</td><td></td></tr><tr><td> Dekglazen </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B22X22-1.5</td><td></td></tr><tr><td> Glijschuiven </td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td> SlowFade Gold </td><td>Fisher Scientific</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold </td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td> Petroleum Jelly </td><td>elke supermarkt</td><td> </td><td></td></tr><tr><td> Loop Houders </td><td>VWR</td><td>80094-482</td><td></td></tr><tr><td> Insectenpinnen </td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td> Vernikkelde Pinnen Houders </td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12 </td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: analyse van spinal cord development

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

De zebravis ruggenmerg is een effectieve onderzoeksjournalistiek model voor zenuwstelsel onderzoek om verschillende redenen. Ten eerste kan de genetische, transgene en gen knock-down benaderingen worden gebruikt om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Ten tweede, grote klauwen van ontwikkelingsgebied gesynchroniseerde embryo&#39;s bieden grote experimentele steekproeven. Ten derde, de optische helderheid van de zebravis embryo laat onderzoekers voorlopercellen, gliale en neuronale populaties te visualiseren. Hoewel de zebravis embryo&#39;s zijn transparant, kan monsterdikte effectieve microscopische visualisatie belemmeren. Een reden hiervoor is de tandem ontwikkeling van het ruggenmerg en overliggende somiet weefsel. Een andere reden is de grote dooier bal, die nog steeds aanwezig tijdens periodes van vroege neurogenese. In dit artikel tonen we aan microdissection en het verwijderen van de dooier in vaste embryo&#39;s, die microscopische visualisatie mogelijk maakt met behoud van omliggende somiet weefsel. We ALSo tonen semi-permanente montage van zebravis embryo&#39;s. Dit maakt observatie van neurodevelopment in de dorso-ventrale en anterior-posterior assen, en vrijwaart het drie-dimensionaliteit van het weefsel.

Wanneer ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen diverse ontwikkelingsprocessen zoals cellulaire patroon, differentiatie en axon begeleiding is belangrijk om cellen te visualiseren in de context van hun weefsels. Dorsoventral patroonvorming gebreken meestal aanwezig als een ventrale of dorsale verschuiving in de expressie domein van transcriptiefactoren in de pax, NKX of dbx gezinnen 4. Soms kunnen veranderingen subtiel zijn, omvattende enkele cel diameters 4. Dwarsdoorsnede analyse mogelijk dit type analyse. Echter, reagentia zwakkere signalen of dwarsdoorsneden die niet loodrecht op de as staan ​​AP interpretatie beperkt. Verder heeft dwarsdoorsnede analyse niet direct rekening gehouden met de vraag of veranderingen volharden in het AP-as, en is gebaseerd op de beschikbaarheid van een cryostaat. Deze beperking wordt omzeild door een zijdelings uitzicht op het ruggenmerg. Zoals te zien in figuur 2B, Nkx6.1 mRNA distributed in ruwweg de ventrale helft van het ruggenmerg bij 24 uur na de bevruchting (HPF), binnen de stamvader domein. Progenitorcellen worden onderscheiden ontslag mitotische cellen door de aanwezigheid van de vloerplaat, die is gevonden in het mediale deel van het ruggenmerg. Bekeken met DIC optiek, individuele cellen zijn duidelijk te onderscheiden, en een gedefinieerde grens tussen het uiten en niet tot expressie brengende cellen is evident. Progenitor celcyclus uitgang is gekenmerkt door veranderingen in genexpressie. Bijvoorbeeld, alle post-mitotische neuronen uiten HuC / D die detecteerbaar is met immunocytochemie 1,5. mRNA probes voor eilandje, gata, en VSX families label specifieke post-mitotische neuronen van consistente positie en het aantal binnen elk ruggenmerg hemisegment 6. Daarnaast worden axon begeleiding receptoren zoals in de Robo familie uitgedrukt in beperkte populaties van postmitotische neuronen (figuur 2C) <sup&gt; 2,7,8. Horizontale bevestiging van embryo maakt nauwkeurige tellingen van post-mitotische neuronen. Ook kunnen voorlopers die blijven delen worden gekwantificeerd met anti-fosfo-histon 3 immunocytochemie en BrdU labeling. Bovendien kan celdood worden beoordeeld met TUNEL etikettering 4-6. Op 24 HPF, kunnen axonen van de volgende postmitotische neuronen worden gevisualiseerd met verschillende methoden, en zijn te onderscheiden op de enkele cel niveau: Dorsale Lateral oplopend (Dola), commissural Primaire Oplopend (COPA), commissural Secundaire Oplopend (COSA), Ventral Longitudinale Aflopend (veld), Kolmer-Agdur (KA), commissural bifurcating / Longitudinale (COB / L), Circumferential Oplopend (CIA), Circumferential Aflopend (CID), en unipolaire commissural Aflopend (UCoD), Rohon-Beard (RB), motoneuronen ( M) 9. Axonen strekken zich uit van deze neuronen in de dorsale, ventrale, anterieure en posterieure richtingen. Ze tak, steek de middellijn, en sluit zowel de dorsaleen ventrale ruggenmerg. In combinatie met confocale laser scanning microscopie, die verschillende cellulaire gedragingen zijn duidelijk zijdelings gemonteerde embryo, met immunocytochemie en genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals GFP 2. In figuur 2D, is ZNP-1 immunocytochemie gebruikt voor het ontwikkelen motoneuronen label. Motoneuronen verlaten het ruggenmerg ventraal naar de omliggende ontwikkelen van spiermassa innerveren. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figuur 1. Dissection en lateraal monteren van zebravis embryo. (A) na verwerking voor immunofluorescentie, in situ hybridisatie, enz., worden embryo&#39;s in een schotel 35 mm Petri gevuld met PBT (PBS met 0,5% Triton X-100) of PTW (PBS met geplaatste 0,1% Tween-20). De dooierbal (YB) is evident. (B) De dooier verwijderd geplaatst door de kop van het embryo, gevolgd door zorgvuldige dissectie. (C) Een embryo poker (vislijn verlijmd op een Pasteur pipet) wordt gebruikt om afzonderlijke embryo&#39;s en dooier puin (D). Gereinigde embryo gepipetteerd op een objectglaasje (E) en lijn (F). (G) Vaseline wordt toegepast op de hoeken van het dekglaasje. (H) Het dekglaasje wordt voorzichtig bovenop de embryo&#39;s fixeermiddel. (I) Nagellak wordt gebruikt om de randen van het dekglaasje te dichten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figuur 2. Analyse van genexpressie patronen en axon pathfinding zijdelings gemonteerd zebravis embryo&#39;s. (A) Tekening van een zebravis embryo op 24 hpf. BD, zijn ruwweg vier hemisegments boven de dooierzak uitbreiding gevisualiseerd (boxed gebied). (B) Nkx6.1 wordt uitgedrukt in de ventrale ruggenmerg, inclusief de bodemplaat (FP). (C) robo3 wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen (PMN). De vloerplaat en voorlopercellen zone is niet duidelijk in deze meer zijdelingse focal plane. In B, C, het ruggenmerg wordt begrensd door een beugel aan de linkerkant van het beeld. (D) confocale microscopie werd gebruikt om beelden ZNP-1 immunofluorescentie, welke motor axonen ventraal verlaten van het ruggenmerg labels. In alle afbeeldingen, anterior naar links en dorsale up. Een 40X lange werkafstand, werd onderdompeling in water (NA 0,8) gebruikte lens (3.3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klik hier voor grotere afbeelding.

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo&#39;s die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren en monteren van zebravis-embryo's voor een optimale microscopische visualisatie van het ruggenmerg. Dit wordt bereikt door eerst de oogbal via microdissectie te verwijderen. De tweede stap bestaat uit het verwijderen van de oogresten en het pipetteren van de embryo's op een objectglas.Vervolgens wordt het overtollige vloeistof voorzichtig verwijderd met een Kim wipe, waarna het montage medium wordt toegevoegd. De laatste stap is het oriënteren van de embryo's op het objectglas met een embryo-poker, gevolgd door het aanbrengen van het dekglas. Ten slotte wordt fluorescentie- of lichtveldmicroscopie gebruikt om de distributie van postmitotische cellichamen en het traject van ontwikkelende axonen aan te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie, zoals de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor patroonvorming, differentiatie en axonale geleiding. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in vele aspecten van de ontwikkeling van het zenuwstelsel, kan zij ook worden toegepast op andere weefsels, zoals ontwikkelende spieren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien er voorafgaand aan het experiment dissectie onder een microscoop vereist is.Maak een embryo-prikker door een pipetpunt aan een oude pipet te lijmen en vervolgens een vislijn aan de pipetpunt te lijmen. Om te beginnen met de dissectie van de embryo's, plaatst u maximaal 30 zebravisembryo's van 24 uur na bevruchting in een Petrischaal van 35 millimeter gevuld met PBS.Zet de kop van een embryo onder een dissectiescoop vast met een pincet, terwijl u de dooier wegtrekt met een insectennaald. Gebruik vervolgens de embryo-poker om de embryo's naar een deel van de Petrischaal te verplaatsen waar weinig dooierresten aanwezig zijn. Aspireer daarna de embryo's in een glazen Pasteur-pipet, waarbij u zo min mogelijk vloeistof opzuigt.Pipette vervolgens voorzichtig tot 21 embryo's op een objectglas. Absorbeer zorgvuldig het overtollige vloeistof met een laboratoriumdoekje, waarbij u voorkomt dat u de embryo's aanraakt, en voeg daarna één druppel monteermiddel toe aan de embryo's. Gebruik vervolgens de embryo-poker om de embryo's op hun zij in twee tot drie rijen te oriënteren.Breng nu een kleine hoeveelheid vaseline aan op elke hoek van een dekglas. Draai het dekglas zodat de zijde met de vaseline naar beneden is gericht en plaats het dekglas bovenop de embryo's. De vaseline dient om beschadiging van de embryo's door overmatige compressie te voorkomen.Tik indien nodig voorzichtig op elke hoek van het dekglas totdat het monteermedium het dekglas raakt, met behulp van een pipet in het bereik van 20 tot 100 µL. Voeg meer monteermedium toe naast het dekglas en laat het toegevoegde medium onder het dekglas trekken. Maak vervolgens met een laboratoriumdoekje de omgeving rondom het dekglas volledig schoon.Oefen geen druk uit op het dekglas, omdat dit de embryo's kan beschadigen. Wanneer het gebied correct is gereinigd, is het droog en bevat het geen vaseline of inbedmedium. Werk af door nagellak te gebruiken om de randen van het dekglas af te dichten. Na het inbedden van de zebravis-embryo's werden verschillende HEMI-segmenten boven de uitbreiding van de eierzak gevisualiseerd.Deze figuur toont de expressie van NK X 6.1 in het ventrale ruggenmerg van het zebravissenembryo. Het NK X 6.1 mRNA is 24 uur na bevruchting verdeeld over ruwweg de ventrale helft van het ruggenmerg. Binnen het progenitor-domein zijn progenitorcellen te onderscheiden van post-mitotische cellen door de aanwezigheid van de bodemplaat (floor plate), die zich in het mediale deel van het ruggenmerg bevindt.Bekeken met DIC-optiek. Individuele cellen zijn duidelijk te onderscheiden en er is een duidelijke grens zichtbaar tussen cellen die expressie vertonen en cellen die dat niet doen. De uittreding van de progenitorcel uit de celcyclus gaat gepaard met veranderingen in genexpressie.Deze afbeelding toont de expressie van robo three in postmitotische neuronen. De robo-familie van receptoren zijn axonleidingsreceptoren waarvan de expressie nauwkeurige tellingen van postmitotische neuronen mogelijk maakt. Let op dat de vloerplaat en de progenitorzone niet zichtbaar zijn in dit meer laterale brandvlak.Confocale microscopie werd gebruikt voor beeldvorming van znp one immunofluorescentie, waarmee motorische axonen worden gelabeld, zoals getoond in dit zijwaarts gemonteerde embryo. De motorische neuronen verlaten het ruggenmerg ventraal 24 uur na bevruchting om de omliggende ontwikkelende musculatuur te innerveren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de integriteit van de weefsels te bewaren door middel van zorgvuldige microdissectie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u microdissectietechnieken gebruikt om de dooier van zebravissenembryo's te verwijderen voor montage en microscopische visualisatie.

dissection-lateral-mounting-zebrafish-embryos-analysis-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo's te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.

Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Hier presenteren we het protocol voor 3D-weefselkweek van de achterste lichaamsas van zebravissen, waardoor live studie van gewervelde segmentatie mogelijk is. Dit explantmodel biedt controle over de verlenging van de as, wijziging van morfogene bronnen en live beeldvorming op weefselniveau op subcellulair resolutieniveau.

Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Hier presenteren we een methode voor het uitlijnen en cryosectieren van meerdere zebravislarvenmonsters (Danio rerio) en het verzamelen ervan op een enkel glaasje voor ruimtelijke transcriptomische analyse.

Ruimtelijk compacte opstelling van larvale zebravissecties voor ruimtelijke transcriptomische analyse

Leer een betrouwbare methode voor het prepareren en horizontaal monteren van zebrafishembryo's om het ruggenmerg te visualiseren. Deze techniek optimaliseert fluorescente en lichtmicroscopie voor neurobiologisch onderzoek naar axonleiding en differentiatie.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo's: Analyse van Spinal Cord Development

Meer video's verkennen