Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo's: Analyse van Spinal Cord Development

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren en monteren van zebravis-embryo's voor een optimale microscopische visualisatie van het ruggenmerg. Dit wordt bereikt door eerst de oogbal via microdissectie te verwijderen. De tweede stap bestaat uit het verwijderen van de oogresten en het pipetteren van de embryo's op een objectglas.

Vervolgens wordt het overtollige vloeistof voorzichtig verwijderd met een Kim wipe, waarna het montage medium wordt toegevoegd. De laatste stap is het oriënteren van de embryo's op het objectglas met een embryo-poker, gevolgd door het aanbrengen van het dekglas. Ten slotte wordt fluorescentie- of lichtveldmicroscopie gebruikt om de distributie van postmitotische cellichamen en het traject van ontwikkelende axonen aan te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neurobiologie, zoals de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor patroonvorming, differentiatie en axonale geleiding. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in vele aspecten van de ontwikkeling van het zenuwstelsel, kan zij ook worden toegepast op andere weefsels, zoals ontwikkelende spieren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien er voorafgaand aan het experiment dissectie onder een microscoop vereist is.

Maak een embryo-prikker door een pipetpunt aan een oude pipet te lijmen en vervolgens een vislijn aan de pipetpunt te lijmen. Om te beginnen met de dissectie van de embryo's, plaatst u maximaal 30 zebravisembryo's van 24 uur na bevruchting in een Petrischaal van 35 millimeter gevuld met PBS.

Zet de kop van een embryo onder een dissectiescoop vast met een pincet, terwijl u de dooier wegtrekt met een insectennaald. Gebruik vervolgens de embryo-poker om de embryo's naar een deel van de Petrischaal te verplaatsen waar weinig dooierresten aanwezig zijn. Aspireer daarna de embryo's in een glazen Pasteur-pipet, waarbij u zo min mogelijk vloeistof opzuigt.

Pipette vervolgens voorzichtig tot 21 embryo's op een objectglas. Absorbeer zorgvuldig het overtollige vloeistof met een laboratoriumdoekje, waarbij u voorkomt dat u de embryo's aanraakt, en voeg daarna één druppel monteermiddel toe aan de embryo's. Gebruik vervolgens de embryo-poker om de embryo's op hun zij in twee tot drie rijen te oriënteren.

Breng nu een kleine hoeveelheid vaseline aan op elke hoek van een dekglas. Draai het dekglas zodat de zijde met de vaseline naar beneden is gericht en plaats het dekglas bovenop de embryo's. De vaseline dient om beschadiging van de embryo's door overmatige compressie te voorkomen.

Tik indien nodig voorzichtig op elke hoek van het dekglas totdat het monteermedium het dekglas raakt, met behulp van een pipet in het bereik van 20 tot 100 µL. Voeg meer monteermedium toe naast het dekglas en laat het toegevoegde medium onder het dekglas trekken. Maak vervolgens met een laboratoriumdoekje de omgeving rondom het dekglas volledig schoon.

Oefen geen druk uit op het dekglas, omdat dit de embryo's kan beschadigen. Wanneer het gebied correct is gereinigd, is het droog en bevat het geen vaseline of inbedmedium. Werk af door nagellak te gebruiken om de randen van het dekglas af te dichten. Na het inbedden van de zebravis-embryo's werden verschillende HEMI-segmenten boven de uitbreiding van de eierzak gevisualiseerd.

Deze figuur toont de expressie van NK X 6.1 in het ventrale ruggenmerg van het zebravissenembryo. Het NK X 6.1 mRNA is 24 uur na bevruchting verdeeld over ruwweg de ventrale helft van het ruggenmerg. Binnen het progenitor-domein zijn progenitorcellen te onderscheiden van post-mitotische cellen door de aanwezigheid van de bodemplaat (floor plate), die zich in het mediale deel van het ruggenmerg bevindt.

Bekeken met DIC-optiek. Individuele cellen zijn duidelijk te onderscheiden en er is een duidelijke grens zichtbaar tussen cellen die expressie vertonen en cellen die dat niet doen. De uittreding van de progenitorcel uit de celcyclus gaat gepaard met veranderingen in genexpressie.

Deze afbeelding toont de expressie van robo three in postmitotische neuronen. De robo-familie van receptoren zijn axonleidingsreceptoren waarvan de expressie nauwkeurige tellingen van postmitotische neuronen mogelijk maakt. Let op dat de vloerplaat en de progenitorzone niet zichtbaar zijn in dit meer laterale brandvlak.

Confocale microscopie werd gebruikt voor beeldvorming van znp one immunofluorescentie, waarmee motorische axonen worden gelabeld, zoals getoond in dit zijwaarts gemonteerde embryo. De motorische neuronen verlaten het ruggenmerg ventraal 24 uur na bevruchting om de omliggende ontwikkelende musculatuur te innerveren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de integriteit van de weefsels te bewaren door middel van zorgvuldige microdissectie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u microdissectietechnieken gebruikt om de dooier van zebravissenembryo's te verwijderen voor montage en microscopische visualisatie.