Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

Het algemene doel van het experiment is om het tijdsverloop van de glutamaatklaring vanuit astrocytaire membranen te schatten na de afgifte ervan vanuit excitatoire synapsen. De eerste stap in dit proces is het registreren van het optreden van synaptisch geactiveerd glutamaattransport vanuit astrocyten in acute hersenplakjes, in afwezigheid en aanwezigheid van een subsaturerende concentratie van de breedspectrum glutamaattransportantagonist, TBOA. De tweede stap is het analyseren van de registraties om de synaptisch geactiveerde glutamaattransportstroomen te isoleren van alle andere componenten van de opgewekte respons.

Vervolgens wordt het tijdsverloop van de filter geschat door de transporterstromen die zijn geregistreerd in aanwezigheid van TBOA te analyseren door de filter af te trekken van de transportgebeurtenis die is geregistreerd onder gecontroleerde omstandigheden. Het tijdsverloop van de glutamaatklaring uit astrocytaire membranen wordt zo bepaald. De resultaten tonen aan dat astrocyten in de hippocampus van de muis slechts enkele milliseconden nodig hebben om synaptisch vrijgekomen glutamaat uit de extracellulaire ruimte te verwijderen.

Deze aanpak biedt een gevoelig instrument om veranderingen in de astrocytaire opnamecapaciteit in verschillende hersengebieden tijdens fysiologische en pathologische omstandigheden te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak ten opzichte van andere methoden die bijvoorbeeld gebaseerd zijn op verplaatsingsanalyse van snel dissociërende glutamaatreceptorantagonisten op fluorescente glutamaatindicatoren of op computersimulaties van diffusiereacties, is dat het een hoge temporele resolutie biedt en een directe experimentele uitlezing geeft van de glutamaatklaring door astrocyten. Deze methode stelt ons in staat om de ruimtelijke en temporele dynamiek van synaptische transmissie in de hersenen te begrijpen.

Het kan ons helpen bij het interpreteren van pathofysiologische veranderingen in glutamaat, diffusie en opname die kunnen optreden bij bepaalde neurologische aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer. Begin deze procedure door met een scalpel vijf sneden te maken in een geprepareerde muizenhersenen. Verwijder eerst de bulbi olfactorii en de frontale cortex.

Verwijder vervolgens het cerebellum. Verwijder daarna de linker- en rechter temporale kwabben. Scheid vervolgens de twee hersenhelften met een mediane sagittale snede.

Lijm vervolgens het laterale oppervlak van elke hersensectie op de koude vibram-basisplaat. De dorsale zijde van de hersenen moet naar het vibram-mes gericht zijn en de ventrale zijde van de hersenen moet in contact staan met het agarbees, weg van het vibram-mes. Bevestig daarna de vibram-basisplaat aan de dissectiekamer.

Stel de snijdikte in op 250 micrometers en pas de breedte van het mes aan voordat u gaat snijden. Zodra het mes door de cortex en hippocampus is gegaan, gebruikt u een scalpel om de cortex hippocampus van de middenhersenen te scheiden. Plaats vervolgens een plakje in de dompelkamer bij 34 degrees Celsius, nadat de plakjes gedurende 30 minuten op 34 degrees Celsius zijn gehouden.

Laat ze 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat ze in deze procedure worden gebruikt voor de elektrofysiologische opnamen, en breng vervolgens een slice over naar de opnamekamer. Inspecteer de slice visueel onder de stipverlichting of I-R-D-I-C. Astrocyten kunnen worden geïdentificeerd aan hun kleine cellichaam en prominente nucleus voor synaptische stimulatie.

Plaats een bipolaire roestvrijstalen elektrode op ongeveer 100 micrometers afstand van de astrocyt die u wilt patchen. Patch de astrocyt en doorbreek de membraan voor de whole cell-configuratie door een zeer zachte zuiging toe te passen. Wissel vervolgens elke 10 tot 20 seconden af tussen enkelvoudige en gepaarde stimuli om de gefaciliteerde delen van het synaptisch geactiveerde transport te isoleren.

Bereken eerst het gemiddelde van ten minste 20 sweeps die zijn verkregen met gepaarde stimulaties onder gecontroleerde omstandigheden en in de aanwezigheid van 10 µM breedspectrum glutamaattransporterantagonist TBOA. Bereken vervolgens het gemiddelde van een gelijk aantal sweeps verkregen met enkelvoudige stimulaties onder controlecondities en in 10 µM TBOA. Trek het gemiddelde spoor verkregen met enkelvoudige stimulaties af van het gemiddelde spoor verkregen met gepaarde stimulaties. Deze stap maakt het mogelijk om de STO-geometrie en de aanhoudende kaliumstroom opgewekt door de tweede stimulus te isoleren.

Verschuif vervolgens de gemiddelde trace die verkregen is met enkelvoudige stimulaties over een tijdsinterval dat overeenkomt met het PUL-interval dat is gebruikt voor het afgeven van gepaarde pulsen; trek de tijdverschoven, gemiddelde respons die met enkelvoudige stimulaties is verkregen, af van de gemiddelde respons op de tweede stimulus die eerder is verkregen. Deze stap isoleert een gefaciliteerd deel van de transporterstroom die door de tweede stimulus is opgewekt. In de meeste gevallen verwijdert deze stap de aanhoudende kaliumstroom volledig.

Als dit het geval is, is de isolatie van de FSTC voltooid en kunt u doorgaan met de deconvolutieanalyse om het tijdsverloop van de glutamaatklaring uit astrocyten te bepalen. In sommige gevallen is er echter nog steeds een kleine, aanhoudende kaliumstroom aanwezig en is verdere analyse vereist. Meet de amplitude van de aanhoudende kaliumstroom die overblijft na uitvoering.

De eerder beschreven analyse schaalt de amplitude van de mono-exponentiële functie naar de amplitude van de resterende aanhoudende kaliumstroom door de amplitude van de gemeten aanhoudende kaliumstroom als a in deze vergelijking in te stellen. De stijgtijdconstante vertegenwoordigt echter de gemiddelde waarde van de stijging, geschat in afzonderlijke experimenten waarin een aanhoudende kaliumstroom is geïsoleerd. Door farmacologisch gebruik te maken van een hoge verzadigingsconcentratie van TBOA, wordt de resulterende mono-exponentiële functie vervolgens afgetrokken van de FSTC en de aanhoudende kaliumstroom.

Om de isolatie van de FSTC te voltooien. Om het door flitsen geactiveerde transportverschijnsel te isoleren. Bereken het gemiddelde van ten minste 20 sweeps verkregen met een open lichtpad onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA; bereken vervolgens het gemiddelde van hetzelfde aantal sweeps verkregen met een gesloten lichtpad onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA. Trek het gemiddelde spoor verkregen met een geblokkeerd lichtpad af van het gemiddelde spoor verkregen met een open lichtpad.

Deze stap maakt het mogelijk om het stimulusartefact te verwijderen en de FTC's te isoleren. Pas in deze stap de transportstroom, ofwel FSTC of FTC, die is geregistreerd onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA, aan met een multi-exponentiële functie; creëer een onmiddellijk stijgende functie die mono-exponentieel afneemt volgens deze functie en die de afnemende fase van de transportstroom geregistreerd bij 10 micromolar TBOA het best beschrijft. Ontwikkel vervolgens de mono-exponentiële functie uit de fit van de transportstroom geregistreerd in 10 micromolar TBOA om het filter af te leiden. Leid vervolgens het filter af uit de fit van de transportstroom onder controlecondities.

Om een kwantitatieve schatting van het totale tijdsverloop van de glutamaatklaring te verkrijgen, berekent u de OID van de golfvorm. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te bevestigen dat de transportgebeurtenissen worden geregistreerd onder experimentele omstandigheden waarbij het filter in een lineair regime werkt en slechts lineaire vervormingen van het transport introduceert. De huidige golfvorm kan worden gecontroleerd door de manipulaties te toetsen die de grootte van de transportstroom veranderen.

Wijzig het verloop van de stempel niet. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe astrocytische opnames kunnen worden gebruikt om informatie te extraheren over glutamaat, diffusie en opname in de hersenen.