Name: Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Leer hoe je de tijdcursus van glutamaatklaring afleidt uit astrocyten-transportstroommetingen met deconvolutie-analyse. Deze methode biedt inzicht in synaptische transmissie en glutamaatdynamiek in de hersenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke Intramurale Research Program (NS002986). AS schreef het manuscript en geïmplementeerd de deconvolutie analyse. JSD ontwikkelde de eerste versie van de deconvolutie analyse en commentaar op de tekst.

<ol><li>Ventura, R., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+relationships+between+hippocampal+synapses+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes.</a> J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).</li>
<li>Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+perisynaptic+astroglia+during+synaptogenesis+in+the+mature+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus.</a> Glia. 55, 13-23 (2007).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>Herman, M. A., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glutamate+concentration+in+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice.</a> J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).</li>
<li>Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+independent+hippocampal+synapses+is+controlled+by+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake.</a> Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).</li>
<li>Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+synapse+independence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An evaluation of synapse independence.</a> J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).</li>
<li>Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+glutamate+diffusion+in+the+hippocampus%3A+ultrastructural+constraints%2C+uptake%2C+and+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation.</a> J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).</li>
<li>Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flux+coupling+in+a+neuronal+glutamate+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flux coupling in a neuronal glutamate transporter.</a> Nature. 383, 634-637 (1038).</li>
<li>Eliasof, S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+cell+glutamate+transporter+is+coupled+to+an+anionic+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).</li>
<li>Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+associated+with+excitatory+amino+acid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport.</a> Neuron. 15, 721-728 (1995).</li>
<li>Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+and+microscopic+properties+of+a+cloned+glutamate+transporter%2Fchloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel.</a> J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).</li>
<li>Bergles, D. E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activation+of+glutamate+transporters+in+hippocampal+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes.</a> Neuron. 19, 1297-1308 (1997).</li>
<li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes%3A+transmitter+uptake+gets+faster+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).</li>
<li>Scimemi, A., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+transporters+regulate+glutamate+clearance%2C+NMDA+receptor+activation%2C+and+synaptic+plasticity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus.</a> J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).</li>
<li>Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+enhances+glutamate+uptake+via+glutamate+transporters+in+rat+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells.</a> Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).</li>
<li>Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+uptake+of+glutamate+and+aspartate+into+glial+cells+isolated+from+the+salamander+%28Ambystoma%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina.</a> J. Physiol. 436, 169-193 (1991).</li>
<li>Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+coupled+and+uncoupled+currents+during+glutamate+uptake+by+GLT-1+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters.</a> J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).</li>
<li>Diamond, J. S., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+does+not+overwhelm+transporters+on+hippocampal+astrocytes+during+high-frequency+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation.</a> J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).</li>
<li>Benediktsson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+glutamate+transporter+dynamics+in+developing+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes.</a> Glia. 60, 175-188 (2012).</li>
<li>Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+synaptic+glutamate+spillover+and+reuptake+by+linker+optimized+glutamate-sensitive+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).</li>
<li>Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid%CE%B21-42+slows+clearance+of+synaptically-released+glutamate+by+mislocalizing+astrocytic+GLT-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1.</a> J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Een experimentele benadering voor elektrofysiologische opnames te verkrijgen van astrocyten Hier beschrijven wij, een analytisch protocol om glutamaattransporter stromingen isoleren in astrocyten en een wiskundige methode voor het afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocytische transporter stromingen. Het succes van de analyse is gebaseerd op de mogelijkheid om hoge-kwaliteit patch clamp verkrijgen van astrocyten en de nauwkeurigheid van de fitting algoritme gebruikt om...

Astrocyten een van de meest voorkomende soorten cellen in de hersenen met stervormige morfologie en fijne membraan uitsteeksels die zich uitstrekken over de hele neuropil en bereiken naburige synaptische contacten 1,2. Celmembraan van de astrocyten &#39;is boordevol glutamaat transporter moleculen 3. Onder fysiologische omstandigheden glutmaattransporters snel glutamaat binden aan de extracellulaire zijde van het membraan en overbrengen naar het cel cytoplasma. Door dit te doen, de vervoerders te handhaven lage de basale concentratie van glutamaat in de extracellulaire ruimte 4. Glutamaat transporters in fine astrocytaire processen grenzend aan synapsen prikkelende zijn ideaal gepositioneerd om glutamaat vrijkomt tijdens synaptische gebeurtenissen als het verspreidt weg van de synaptische spleet te binden. Door dit te doen, de vervoerders beperken ook glutamaat spillover naar peri-en extra-synaptische regio&#39;s en op naburige synapsen, het verminderen van de ruimtelijke verspreiding van prikkelende signaals in de hersenen 5-7. Glutamaat transport is een elektrogene proces stoichiometrisch gekoppeld met de beweging van 3 Na + en H + 1 langs hun elektrochemische gradiënt en de contra-transport van 1 K + 8. Glutamaat transport wordt geassocieerd met (maar niet stoichiometrisch gekoppeld aan) een anionisch geleidbaarheid permeabel voor SCN - (thiocyanaat)&gt; NO 3 - (nitraat) ≈ ClO 4 - (perchloraat)&gt; I -&gt; Br -&gt; Cl -&gt; F -, niet tot CH 3 SO 3 - (methaansulfonaat) en C 6 H 11 O 7 - (gluconaat) 9-11. Beide stromingen (stoichiometrische en niet-stoichiometrische) kan worden opgenomen door het verkrijgen van whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten, visueel geïdentificeerd onder Dodt verlichting of voor infrarode differentieel interferentie contrast (IR-DIC) in acute hersenplakjes 12. De stoichiometrische component van de huidige in verband met glutamaat transport over het membraan kan worden geïsoleerd door CH 3 SO 3 -, of C 6 H 11 O 7 - gebaseerde intracellulaire oplossingen en kunnen worden opgeroepen door flash-uncaging glutamaat op astrocyten 13,14, of door het activeren van glutamaat afgifte van naburige synapsen, die elektrisch 12 of met een gerichte optogenetic controle. Het tijdsverloop van de stoichiometrische component van de huidige transporteur wordt gevormd door de levensduur van de glutamaatconcentratie profiel op astrocyten membranen (bijvoorbeeld glutamaat klaring), de kinetiek van glutmaattransporters, passief membraan eigenschappen van astrocyten en tijdens synaptische stimulaties de synchroniciteit van de afgifte van glutamaat in de geactiveerde synapsen 13. Hier beschrijven we in detail: (1) een experimentele approach de stoichiometrische component van glutamaattransporter stromen van whole-cell patch-clamp van astrocyten in acute muis hippocampale plakken als voorbeeld experimenteel isolaat preparaat, (2) een benadering tot de tijdsduur van glutamaat klaring ontlenen deze opnamen 13, 14. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het opnemen en analyseren glutamaattransporter stromen van astrocyten in gebieden van het centrale zenuwstelsel.

<table><tbody><tr><td>CGP52432</td><td>Tocris</td><td>1246</td><td></td></tr><tr><td>(R,S)-CPP</td><td>Tocris</td><td>173</td><td></td></tr><tr><td>DPCPX</td><td>Tocris</td><td>439</td><td></td></tr><tr><td>LY341495 disodium zout</td><td>Tocris</td><td>4062</td><td></td></tr><tr><td>MSOP</td><td>Tocris</td><td>803</td><td></td></tr><tr><td>NBQX disodium zout</td><td>Tocris</td><td>1044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-TBOA</td><td>Tocis</td><td>1223</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>MNI-L-glutamaat</td><td>Tocris</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A10438</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Matrix elektroden</td><td>Frederick Haer Company</td><td>MX21AES(JD3)</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaatglas capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>Dubbele glazen micro-pipet trekker</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 404 instant kleefstof</td><td>Ted Pella</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>Xe lamp</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>FlashMic</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

afleiden van de time cursus van glutamaat clearance met een deconvolutie analyse van astrocyten transporter currents

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

De hoogste dichtheid van glutamaat transporters in de hersenen wordt gevonden in astrocyten. Glutmaattransporters paar de beweging van glutamaat door het membraan met de co-transport van 3 Na + en 1 H + en de contra-transport van 1 K +. De stoichiometrische huidige gegenereerd door het transport proces kan worden bewaakt met whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten. Het tijdsverloop van de opgenomen stroom wordt gevormd door het tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel die astrocyten worden blootgesteld, de kinetiek van glutamaattransporters en de passieve eigenschappen van elektrotone astrocytaire membranen. Hier beschrijven we de experimentele en analytische methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaattransporter stromen in astrocyten registreren en isoleren het tijdsverloop van glutamaat toestemming van alle andere factoren die de vorm van de golfvorm van astrocytaire transporter stromen. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om een ​​schatting van de levensduur of flash-Uncaged en synaptically-uitgebracht glutamaat bij astrocytaire membranen in elke regio van het centrale zenuwstelsel tijdens gezondheid en ziekte.

Het succes van de analytische benadering hier beschreven kritisch is afhankelijk van het verkrijgen van hoge kwaliteit elektrofysiologische opnames van transporter stromen van astrocyten in elke regio van het centrale zenuwstelsel. In acute muis hippocampale plakken, kan astrocyten gemakkelijk worden geïdentificeerd onder Dodt verlichting of IR-DIC vanwege hun kleine cellichaam (Ø = 10 micrometer) en prominente nucleus (Figuur 1). De onderscheidende stervormige morfologie worden gesteld met epifluoresce...

We beschrijven een analysemethode om de levensduur van glutamaat schatten op astrocytaire membranen van elektrofysiologische opnames van glutamaat transporter stromingen in astrocyten.

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Het algemene doel van het experiment is om het tijdsverloop van de glutamaatklaring vanuit astrocytaire membranen te schatten na de afgifte ervan vanuit excitatoire synapsen. De eerste stap in dit proces is het registreren van het optreden van synaptisch geactiveerd glutamaattransport vanuit astrocyten in acute hersenplakjes, in afwezigheid en aanwezigheid van een subsaturerende concentratie van de breedspectrum glutamaattransportantagonist, TBOA. De tweede stap is het analyseren van de registraties om de synaptisch geactiveerde glutamaattransportstroomen te isoleren van alle andere componenten van de opgewekte respons.Vervolgens wordt het tijdsverloop van de filter geschat door de transporterstromen die zijn geregistreerd in aanwezigheid van TBOA te analyseren door de filter af te trekken van de transportgebeurtenis die is geregistreerd onder gecontroleerde omstandigheden. Het tijdsverloop van de glutamaatklaring uit astrocytaire membranen wordt zo bepaald. De resultaten tonen aan dat astrocyten in de hippocampus van de muis slechts enkele milliseconden nodig hebben om synaptisch vrijgekomen glutamaat uit de extracellulaire ruimte te verwijderen.Deze aanpak biedt een gevoelig instrument om veranderingen in de astrocytaire opnamecapaciteit in verschillende hersengebieden tijdens fysiologische en pathologische omstandigheden te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak ten opzichte van andere methoden die bijvoorbeeld gebaseerd zijn op verplaatsingsanalyse van snel dissociërende glutamaatreceptorantagonisten op fluorescente glutamaatindicatoren of op computersimulaties van diffusiereacties, is dat het een hoge temporele resolutie biedt en een directe experimentele uitlezing geeft van de glutamaatklaring door astrocyten. Deze methode stelt ons in staat om de ruimtelijke en temporele dynamiek van synaptische transmissie in de hersenen te begrijpen.Het kan ons helpen bij het interpreteren van pathofysiologische veranderingen in glutamaat, diffusie en opname die kunnen optreden bij bepaalde neurologische aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer. Begin deze procedure door met een scalpel vijf sneden te maken in een geprepareerde muizenhersenen. Verwijder eerst de bulbi olfactorii en de frontale cortex.Verwijder vervolgens het cerebellum. Verwijder daarna de linker- en rechter temporale kwabben. Scheid vervolgens de twee hersenhelften met een mediane sagittale snede.Lijm vervolgens het laterale oppervlak van elke hersensectie op de koude vibram-basisplaat. De dorsale zijde van de hersenen moet naar het vibram-mes gericht zijn en de ventrale zijde van de hersenen moet in contact staan met het agarbees, weg van het vibram-mes. Bevestig daarna de vibram-basisplaat aan de dissectiekamer.Stel de snijdikte in op 250 micrometers en pas de breedte van het mes aan voordat u gaat snijden. Zodra het mes door de cortex en hippocampus is gegaan, gebruikt u een scalpel om de cortex hippocampus van de middenhersenen te scheiden. Plaats vervolgens een plakje in de dompelkamer bij 34 degrees Celsius, nadat de plakjes gedurende 30 minuten op 34 degrees Celsius zijn gehouden.Laat ze 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat ze in deze procedure worden gebruikt voor de elektrofysiologische opnamen, en breng vervolgens een slice over naar de opnamekamer. Inspecteer de slice visueel onder de stipverlichting of I-R-D-I-C. Astrocyten kunnen worden geïdentificeerd aan hun kleine cellichaam en prominente nucleus voor synaptische stimulatie.Plaats een bipolaire roestvrijstalen elektrode op ongeveer 100 micrometers afstand van de astrocyt die u wilt patchen. Patch de astrocyt en doorbreek de membraan voor de whole cell-configuratie door een zeer zachte zuiging toe te passen. Wissel vervolgens elke 10 tot 20 seconden af tussen enkelvoudige en gepaarde stimuli om de gefaciliteerde delen van het synaptisch geactiveerde transport te isoleren.Bereken eerst het gemiddelde van ten minste 20 sweeps die zijn verkregen met gepaarde stimulaties onder gecontroleerde omstandigheden en in de aanwezigheid van 10 µM breedspectrum glutamaattransporterantagonist TBOA. Bereken vervolgens het gemiddelde van een gelijk aantal sweeps verkregen met enkelvoudige stimulaties onder controlecondities en in 10 µM TBOA. Trek het gemiddelde spoor verkregen met enkelvoudige stimulaties af van het gemiddelde spoor verkregen met gepaarde stimulaties. Deze stap maakt het mogelijk om de STO-geometrie en de aanhoudende kaliumstroom opgewekt door de tweede stimulus te isoleren.Verschuif vervolgens de gemiddelde trace die verkregen is met enkelvoudige stimulaties over een tijdsinterval dat overeenkomt met het PUL-interval dat is gebruikt voor het afgeven van gepaarde pulsen; trek de tijdverschoven, gemiddelde respons die met enkelvoudige stimulaties is verkregen, af van de gemiddelde respons op de tweede stimulus die eerder is verkregen. Deze stap isoleert een gefaciliteerd deel van de transporterstroom die door de tweede stimulus is opgewekt. In de meeste gevallen verwijdert deze stap de aanhoudende kaliumstroom volledig.Als dit het geval is, is de isolatie van de FSTC voltooid en kunt u doorgaan met de deconvolutieanalyse om het tijdsverloop van de glutamaatklaring uit astrocyten te bepalen. In sommige gevallen is er echter nog steeds een kleine, aanhoudende kaliumstroom aanwezig en is verdere analyse vereist. Meet de amplitude van de aanhoudende kaliumstroom die overblijft na uitvoering.De eerder beschreven analyse schaalt de amplitude van de mono-exponentiële functie naar de amplitude van de resterende aanhoudende kaliumstroom door de amplitude van de gemeten aanhoudende kaliumstroom als a in deze vergelijking in te stellen. De stijgtijdconstante vertegenwoordigt echter de gemiddelde waarde van de stijging, geschat in afzonderlijke experimenten waarin een aanhoudende kaliumstroom is geïsoleerd. Door farmacologisch gebruik te maken van een hoge verzadigingsconcentratie van TBOA, wordt de resulterende mono-exponentiële functie vervolgens afgetrokken van de FSTC en de aanhoudende kaliumstroom.Om de isolatie van de FSTC te voltooien. Om het door flitsen geactiveerde transportverschijnsel te isoleren. Bereken het gemiddelde van ten minste 20 sweeps verkregen met een open lichtpad onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA; bereken vervolgens het gemiddelde van hetzelfde aantal sweeps verkregen met een gesloten lichtpad onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA. Trek het gemiddelde spoor verkregen met een geblokkeerd lichtpad af van het gemiddelde spoor verkregen met een open lichtpad.Deze stap maakt het mogelijk om het stimulusartefact te verwijderen en de FTC's te isoleren. Pas in deze stap de transportstroom, ofwel FSTC of FTC, die is geregistreerd onder controlecondities en in 10 micromolar TBOA, aan met een multi-exponentiële functie; creëer een onmiddellijk stijgende functie die mono-exponentieel afneemt volgens deze functie en die de afnemende fase van de transportstroom geregistreerd bij 10 micromolar TBOA het best beschrijft. Ontwikkel vervolgens de mono-exponentiële functie uit de fit van de transportstroom geregistreerd in 10 micromolar TBOA om het filter af te leiden. Leid vervolgens het filter af uit de fit van de transportstroom onder controlecondities.Om een kwantitatieve schatting van het totale tijdsverloop van de glutamaatklaring te verkrijgen, berekent u de OID van de golfvorm. Tijdens deze procedure is het belangrijk om te bevestigen dat de transportgebeurtenissen worden geregistreerd onder experimentele omstandigheden waarbij het filter in een lineair regime werkt en slechts lineaire vervormingen van het transport introduceert. De huidige golfvorm kan worden gecontroleerd door de manipulaties te toetsen die de grootte van de transportstroom veranderen.Wijzig het verloop van de stempel niet. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe astrocytische opnames kunnen worden gebruikt om informatie te extraheren over glutamaat, diffusie en opname in de hersenen.

deriving-time-course-glutamate-clearance-with-deconvolution-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven hoe te meten in de buurt van membraan en de wereldwijde intracellulair calcium dynamiek in gekweekte astrocyten met behulp van totale interne reflectie en epifluorescentie microscopie.

Het meten van de buurt plasmamembraan en Global intracellulair calcium Dynamics in Astrocyten

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

This video demonstrates evaluating glutamate release and clearance at single corticostriatal synapses in a mouse brain slice. Electrical stimulation facilitates glutamate release at the synapse. The released glutamate alters sensor protein's fluorescence, which decays over time, indicating release and clearance efficiency.

Analyzing the Glutamate Release and Clearance at a Single Neuron Synapse in a Mouse Brain Slice

Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren...

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Hier beschrijven we de setup, softwarenavigatie en gegevensanalyse voor een ruimte en tijd nauwkeurige werkwijze voor het meten tonische en fasische extracellulair glutamaat veranderingen in vivo middels enzymgekoppelde micro-elektrode arrays (MEA).

Met behulp van Enzyme-gebaseerde biosensoren te meten Tonic en Fasische glutamaat in de ziekte van Alzheimer muismodellen

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

We presenteren een protocol om de balans te evalueren tussen glutamaatafgifte en klaring bij enkele corticostriatale glutamatge synapsen in acute plakjes van volwassen muizen. Dit protocol maakt gebruik van de fluorescerende sensor iGluu voor glutamaat detectie, een sCMOS camera voor signaal verwerving en een apparaat voor brandpuntslaser verlichting.

Enkele Synapse indicatoren van glutamaat release en opname in acute hersenen plakjes van normale en Huntington muizen

Hier beschrijven we een in vitro Live-imaging methode om intracellulair transport van organellen en de handel in plasma membraan eiwitten in muriene astrocyten te visualiseren. Dit protocol presenteert ook een analysemethode voor het vrachtvervoer en kinetiek.

Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Leer hoe je de tijdcursus van glutamaatklaring afleidt uit astrocyten-transportstroommetingen met deconvolutie-analyse. Deze methode biedt inzicht in synaptische transmissie en glutamaatdynamiek in de hersenen.

Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents

Meer video's verkennen