Name: Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer een ex vivo celmigratie-assay voor enterische neurale voorlopercellen in muizenembryo's met fluorescentiemicroscopie. Deze methode kwantificeert migratie in reactie op groeifactoren voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Denis Flipo voor beeldverwerking en analyse-advies, en David W. Silversides in wiens laboratorium het Gata4p [5kb]-GFP muis lijn werd gegenereerd. Onderzoek in het laboratorium Pilon wordt gefinancierd door CIHR, NSERC, FRQS en FRQNT.

Ethiek verklaring Experimenten met muizen werden uitgevoerd na Canadese Raad van Animal Care richtlijnen voor de zorg en de manipulatie van dieren die in het medisch onderzoek. Protocollen met betrekking tot de manipulatie van dieren werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van de Universiteit van Quebec in Montreal (Comite Institutionnel de Protection des Animaux; referentienummer 0512-R3-650-0513). 1. Bereiding van collageen Gels Werken in een steriele manier, onder een weefselkweek kap. <ol><li> Bereid compleet 5x DMEM (Eagle&#39;s gemodificeerd essentieel medium) inclusief standaard antibiotica. Los op 3,37 g DMEM poeder en 0,925 g NaHCO3 in 20 ml water. Steriliseren die door een 0,22 urn filter. Voeg 2,5 ml steriele 100x penicilline / streptomycine en 25 ml steriel warmte geïnactiveerd foetaal runderserum. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Op ijs, meng 800 ulCollageen I-oplossing (3,77 mg / ml in 0,02 N azijnzuur, filter-gesteriliseerd), 600 gl 5x volledige DMEM en 17 ui 1 N NaOH. Verdun met steriel water tot een eindvolume van 3 ml. Neem relevante groeifactoren in de mix. Wij gebruiken meestal GDNF bij 10 ng / ml tot enterische NCC migratie stimuleren. </li><li> Borg ongeveer 480 pl in elke well van een enkele rij in een 24-well plaat. Vermijd bubbels. De resterende rijen kan worden gebruikt om het effect van andere groeifactoren op celmigratie testen. </li><li> Laat het collageen polymeriseren ten minste 1 uur in een steriele incubator bij 37 ° C. </li></ol> 2. Dissectie van dieren 16 <ol><li> Opgezet paringen en controleer vaginale stekkers de volgende ochtend. Dag E0.5 zijnde uur op de dag van de vaginale plug wordt gevonden, te isoleren van de vrouwelijke en wacht 12 dagen tot E12.5. </li><li> Verdoven zwangere muizen met isofluraan en euthanaseren door CO 2 inhalatie. </li><li> Spuit de muis met 70% ethanol. Til de buik skin en open de buikholte met dissectieschaar. </li><li> Verwijder de baarmoeder in een glazen petrischaal gevuld met ijskoude PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). Snijd de baarmoeder dwarsrichting tussen afzonderlijke deciduum zwellingen elk embryo implantatie isoleren. </li><li> Werken op elke implantatie apart in een ander glas petrischaal gevuld met ijskoude PBS. Onder een microscoop ontleden, gebruik fijne tang om de spierlaag van de baarmoeder te verwijderen. </li><li> Open de viscerale dooierzak en amnion het embryo te onthullen. Wees voorzichtig bij het doorsnijden van de bloedvaten toetreding tot de embryo naar de placenta / viscerale dooierzak, als ze worden verweven met de ontwikkeling van darmen. </li><li> Sever hoofd van het embryo in de nek. </li><li> Plaats een gesloten forceps in de buikholte van een embryo, net boven de donkerrood gekleurde lever en laat de tang geopend zichzelf (langer dienen druk) een transversale opening in de buikholte maken. Trek de geopende tang naar beneden richtinghet achterste uiteinde van het embryo aan de buik volledig openen. </li><li> Pak het bindweefsel achter de lever en trek de ingewanden van de buik, zorg dat u de darmen breken (de dikke darm wordt aan de anus verbonden). </li><li> Snijd de dikke darm om de ingewanden te bevrijden van de rest van het embryo. De snede kan worden gemaakt op een locatie langs de colon. Reserveer de staart gedeelte voor later. </li><li> Plagen het bindweefsel van de blindedarm, dan de rest van de darmen. Wees voorzichtig de darmen niet te verwonden tijdens het doen. </li><li> Knip de lever en maag (de rostrale einde van de dunne darm), alsmede de mesonephros en genitale randen als sommige aanwezig zijn. </li><li> Isoleer de dunne darm. Nogmaals, wees voorzichtig de darm niet te smoren. Vanaf nu kan de rosrrocaudal oriëntatie van het darmweefsel worden gevolgd met behulp van de scherpe kromming aanwezig is op de rostrale einde. Laat de dunne darm in PBS bij kamertemperatuur gedurende zo kort mogelijk voor embeddengoed (zie stap 3.3). </li><li> Tenslotte registreren het aantal staart somieten voor elk embryo nauwkeurig te bepalen het stadium van de embryonale ontwikkeling. </li></ol> 3. Opdeling van Embryonale Darmen <ol><li> Alvorens embryo dissecties Smelt 1,5 g agarose in 100 ml PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) en houdt bij 50 ° C. </li><li> Giet gesmolten agarose in een inbedding vorm (bijv. een gesloten 2 ml microcentrifugebuis die is lengte gesneden tot ongeveer 1/4 van de buiswand te snijden). Laat de agarose afkoelen tot ongeveer 42-45 ° C, mag het alleen een beetje warm om aan te raken. </li><li> De embryonale darm insluiten vlak voor de agarose stolt (de tijd kan geëvalueerd worden met een pincet tips verschijnt rond optreden 36-38 ° C). Houd de darm met een tang door het gevouwen rostrale einde trek langzaam via agarose langs de lengte van de matrijs. Dit helpt om de darm recht te houden terwijl de agarose sets. Laat de tZodra hier het begint te weerstaan ​​verplaatst. Blijf op de hoogte van de rostrale-caudale oriëntatie van de darm. </li><li> Plaats de vorm in de koelkast 2-3 minuten, zorgen voor de agarose volledig ingesteld. </li><li> Haal de agarose uit de mal (door uit de geopende Eppendorf buis te schuiven). Met een mes, verwijder de overtollige agarose aan beide uiteinden, waardoor bezuinigingen loodrecht op de darm. </li><li> Lijm de rostrale einde van de darm / agarose blokkeren de metalen fase van een microtoom met trillend mesje. Knip de overtollige agarose aan de zijkanten van de darm / agarose blok. </li><li> Monteer de metalen trap op de trillende microtoom kamer. Indien nodig, stel de hoek van het podium, zodat de darm is zo verticaal mogelijk (dus loodrecht op het blad). Bedek het monster met ijskoude PBS. Breng de microtoom mes tot een paar millimeter onder de buffer oppervlak. </li><li> Maak 200 pm vibratome dwarssneden van de staartvin meest dunne darm, zodat eagarose slice ach bevat een volledige intestinale sectie. </li></ol> 4. Culture of intestinale explantaten <ol><li> Zachtjes deponeren de vers gesneden darm / agarose plakjes plat op de collageen gels met een pincet, het plaatsen van een snee in het midden van elk putje. </li><li> Incubeer 3 dagen bij 37 ° C in een vochtige 5% CO2 atmosfeer, migratie van NCC mogelijk uit het explantaat. </li><li> Neem de darm / agarose plakjes uit de collageen-gel heel voorzichtig met een pincet. Zorg ervoor dat u de gel hieronder beschadigen. </li><li> Vermijd de collageengel aan te raken tijdens het verdere incubatie en wasstappen om ervoor te zorgen dat de celmigratie patroon niet wordt verstoord. Bevestig met 500 ui 4% PFA (paraformaldehyde) (in PBS) per putje 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Vervang het fixeermiddel met 500 ui DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool) oplossing (5 ug / ml in PBS) per putje en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was elk putje 3xmet 500 ui PBS gedurende 5 minuten. </li><li> Fotografeer de fluorescerende cellen (GFP en DAPI kanalen) ingebed in de collageen-gel in elk putje. </li></ol> 5. Beeldanalyse We maakten uitgebreid gebruik van ImageJ 17 om de beelden gegenereerd nadat explantaatkweek verwerken en te kwantificeren. <ol><li> Begin met het afbeelden van een micrometer op dezelfde vergroting als de fluorescerende cel foto&#39;s. Meet de lengte van een micron in pixels (volgens de lineaire tool). </li><li> Zet de schaal (Analyseren / Set Schaal; ingang aantal pixels / micron). </li><li> Voor elk GFP-fluorescentie foto, wijzigt het beeld formaat naar 8-bits grijsschaal (Image/Type/8-bit). </li><li> Pas de intensiteit van het signaal (Afbeelding / Aanpassen / Helderheid / Contrast). </li><li> Trek het achtergrondgeluid indien nodig (Proces / Aftrekken Achtergrond; pas de rollende bal radius). </li><li> Stel een drempel naar de cellen en celklonten (Afbeelding / Aanpassen / Threshold), markeert den toepassing een keerpunt voor de klonten (Proces / Binary / Watershed) verdelen. </li><li> Analyseer deeltjes regio van belang (ROI) op te geven en het genereren van het aantal cellen statistieken (Analyze / Analyseer Deeltjes; vastgestelde grootte minimum om de resterende pixels uit te sluiten). </li><li> Stel meting opties om Feret de diameter (Analyseren / Set-metingen) omvatten. </li><li> Groep ROI en meet als geheel om de diameter van de Feret bepalen, een indicatie van de cel spread (Analyseren / Tools / ROI Manager / Meer / OR, dan ROI Manager / toevoegen, en ROI Manager / Measure). </li></ol>

<ol><li>Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Genet%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of Hirschsprung's disease.</a> Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).</li>
<li>Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+developmental+disorders+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development and developmental disorders of the enteric nervous system.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).</li>
<li>Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).</li>
<li>Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+agenesis+and+the+absence+of+enteric+neurons+in+mice+lacking+GDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF.</a> Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).</li>
<li>Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+endothelin-3+with+endothelin-B+receptor+is+essential+for+development+of+epidermal+melanocytes+and+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons.</a> Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).</li>
<li>Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+is+required+for+the+survival-differentiation+of+subsets+of+developing+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons.</a> J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).</li>
<li>Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+necessary+for+neural+crest+cell+migration+and+ganglion+formation+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system.</a> Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).</li>
<li>Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+and+DCC+in+the+guidance+of+migrating+neural+crest-derived+cells+in+the+developing+bowel+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas.</a> Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).</li>
<li>Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signals+regulate+multiple+aspects+of+gastrointestinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development.</a> Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).</li>
<li>Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+signaling+by+receptor+tyrosine+kinase+RET+for+the+directed+migration+of+enteric+nervous+system+progenitor+cells+during+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis.</a> Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).</li>
<li>Young, H. M., Hearn, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDNF+Is+a+chemoattractant+for+enteric+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells.</a> Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).</li>
<li>Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease%2C+associated+syndromes+and+genetics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review.</a> J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).</li>
<li>Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pre-+and+post-gastrulation+expression+of+Gata4+within+cells+of+the+inner+cell+mass+and+migratory+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells.</a> Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).</li>
<li>Nagy, N., Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-3+regulates+neural+crest+cell+proliferation+and+differentiation+in+the+hindgut+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system.</a> Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual</a>. , 3rd ed, CSH Press. Cold Spring Harbor. 209-250 (2003).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We tonen hoe onze ex vivo explantaatkweek techniek kan worden gebruikt om enterische NCC migratiepotentieel nauwkeurig te kwantificeren in aanwezigheid van GDNF. Dergelijke precieze kwantificering wordt sterk vergemakkelijkt door 200 urn dikke darm vibratome gedeelten plaats van grote stukken benaderende afmetingen, zoals eerder beschreven 11,12,15. Inderdaad, deze kunnen we met een redelijk aantal cellen in een zeer reproduceerbare instelling. Opmerkelijk, de uniforme verdeling van fluorescerende en...

Neurale cellen (NCC) is een voorbijgaande celtype uniek is voor gewervelde dieren dat veel derivaten maakt tijdens de ontwikkeling van het embryo. Deze celpopulatie ontstaat op de grens van de neurale plaat, naast niet-neurale ectoderm 1. Tijdens neurulatie, buigen van de neurale plaat plaatsen NCC langs de dorsale rand van de vorm neurale buis. NCC ondergaan dan een epitheliale-mesenchymale transitie, scheiden en migreren weg van de neurale buis. NCC koloniseren verschillende embryonale structuren, waaronder het spijsverteringskanaal waar zij vormen de gehele enterische zenuwstelsel (ENS), een onderling verbonden netwerk van neurale ganglia ingebed in de darmwand. Zoals onlangs beoordeeld 2,3, hebben vele genen betrokken bij de ontwikkeling van deze ingewikkelde structuur. De meeste ENS is afgeleid van een kleine pool van NCC afkomstig van de vagale neurale buis (dwz in de toekomstige achterhersenen / ruggenmerg grens) 4.Deze neurale voorlopercellen bereikt de voordarm rond embryonale dag (e) 9.0 in muizen en vervolgens migreren caudaal in de darm mesenchym tot ongeveer e15.0 om de hele embryonale darmen koloniseren. Een kleine subset van colon neurale voorlopercellen verschaft ook sacrale NCC, die de achterste darm tot de blindedarm 4 binnendringen in de tegenovergestelde richting. Zowel de vagale en sacrale NCC vereisen meerdere migratie-, proliferatie-, survival-en-differentiatie bevorderen signalen om volledige vorming van de ENS zorgen. In dit verband diermodellen - vooral genetisch gemodificeerde muizen - zijn geweest bij de identificatie van verschillende essentiële extracellulaire liganden opgeleverd GDNF (glial cel-afgeleide neurotrofe factor), endotheline-3, neurotrofine-3, BMP (bot morfogenetische eiwitten), Netrin , evenals Sonic en Indiase Hedgehog (Shh en Ihh) 5-10. Van deze, GDNF signalering door de tyrosine kinase transmembraanreceptor RET (Rearranged tijdens transfectie) wordt erkend als ee meest kritieke pad voor het aantrekken en begeleiden van NCC naar en binnen de embryonale darm. GDNF wordt afgescheiden door de darm mesenchym en vormt een spatiotemporeel gecontroleerde rosrrocaudal gradiënt die direct chemoattractive enterische NCC, die RET 11,12 expressie. Onder andere functies, de ENS regelt verkeer binnen het spijsverteringskanaal door de interactie met gladde spier in de darmwand. Afwezigheid van neurale ganglia in het terminale gebied van de darm leidt tot ziekte van Hirschsprung: tonische contractie van het aangetaste segment leidt tot verstopping stroomopwaarts accumulatie van verteerd materiaal en massale uitzetting van de darm en buik. Ziekte van Hirschsprung komt ongeveer een op 5000 levende geboorten. De rostro-caudale migratiepatroon van enterische NCC wordt beschouwd als de belangrijkste factor die bijdraagt ​​aan de etiologie van de ziekte van Hirschsprung zijn. De dikke darm, het verst van de bron van migrerende NCC en laatste portie bOwel te worden gekoloniseerd, is het meest gevoelig voor defecten in ENS formatie. In overeenstemming met haar cruciale rol in enterische NCC migratie, verstoring van GDNF / RET signalering is de belangrijkste bekende genetische oorzaak van de ziekte van Hirschsprung 13. Om beter te bestuderen NCC en ENS ontwikkeling genereerden wij een transgene muis lijn - vernoemd Gata4p [5kb]-GFP 14 - waarin trekkende NCC zijn gelabeld met Green Fluorescent Protein (GFP). We vervolgens geperfectioneerd een ex vivo cel migratie assay, aangepast van gepubliceerd werk van andere groepen 11,12,15, die nu zorgt voor een precieze kwantificering van enterische NCC migratie potentieel in de aanwezigheid van verschillende groeifactoren, zoals GDNF.

<table><tbody><tr><td>DMEM poeder</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>Biotechnologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Steriflip vacuümfiltratiesysteem (0,22 micron)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine oplossing, 100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>Hoge kwaliteitsgraad</td></tr><tr><td>Collageen I</td><td>BD biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>Verdund uit 10 N voorraad, vervolgens sterieel gefilterd</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Cedarlane</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 24-well Plate</td><td>BD biosciences</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glazen petrischaal</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Celcultuurkwaliteit</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001</td><td>Biotechnologiekwaliteit</td></tr><tr><td>Chirurgische mesjes</td><td>Feather</td><td>21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>All Purpose Instant Krazy Glue Pen</td><td>Krazy Glue</td><td>KG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V Trillende-blad Microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Tabel van specifieke reagentia en apparatuur.</td></tr></tbody></table>

een kwantitatieve cel-migratie test voor muriene enterisch neurale voorlopercellen

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neurale cellen (NCC) is een voorbijgaande en multipotent celpopulatie die afkomstig is van de dorsale neurale buis en migreert intensief rond de ontwikkeling van gewervelde embryo. Naast het leveren van perifere glia en neuronen, NCC genereren melanocyten evenals de meeste van de craniofaciale skelet. NCC migratie en differentiatie wordt door een combinatie van de axiale oorsprong langs de neurale buis en hun blootstelling aan regionaal verschillende extracellulaire signalen. Een dergelijke bijdrage van extracellulaire liganden is vooral duidelijk tijdens de vorming van het enterische zenuwstelsel (ENS), een complex netwerk van onderling verbonden neurale ganglia die lokaal regelt (onder andere) gut spierbewegingen en darmmotiliteit. Het merendeel van de ENS is afgeleid van een kleine initiële pool van NCC die een lange reis ondernemen om te koloniseren - in een rostrale om caudale mode - de gehele lengte van de aspirant-darm. Onder verschillende signaalwegen bekend bijbeïnvloeden enterische NCC kolonisatie, wordt GDNF / RET signalering erkend als de belangrijkste. Inderdaad, spatiotemporeel gecontroleerde afscheiding van de RET ligand GDNF door de darm mesenchym is voornamelijk verantwoordelijk voor het aantrekken en begeleiden van-RET uitdrukken enterische NCC naar en binnen de embryonale darm. Hier beschrijven we een ex vivo celmigratie assay gebruikmakend van een transgene muis lijn bezit fluorescerend gemerkte NCC, die nauwkeurige kwantificering van enterische NCC migratiepotentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren, waaronder GDNF maakt.

De volgende resultaten zijn representatief van wat kan worden bereikt met de hier beschreven (Figuur 1) techniek. Het gebruik van groeifactoren (bijv. GDNF) stimuleert de migratie van GFP-expressie enterische NCC uit de intestinale explantaat en in de collageengel (figuur 2). Hoewel sommige cellen uit het explantaat komen in de afwezigheid van groeifactoren, die meestal niet-GFP gemerkte en vormen passieve ingang. Het is noodzakelijk om de intestinale segment uit de collageenge...

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

Het algemene doel van deze procedure is om het migratiepotentieel van enterische neurale progenitorcellen te kwantificeren in de aanwezigheid van verschillende groeifactoren. Dit wordt bereikt door eerst embryonale dunne darmen van muizen te dissekeren die zijn bevolkt met fluorescente neurale crestcellen. De tweede stap is het gebruik van een vibrerende microtoom om coupes van de darm met een dikte van 200 micron te maken.Vervolgens worden deze coupes geïncubeerd bovenop een collageengel die groeifactoren bevat. De laatste stap is het afpellen van de coupes om de migrerende cellen eronder zichtbaar te maken. Ten slotte wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om het patroon van migrerende cellen binnen de collageengel aan te tonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag in de ontwikkelingsbiologie, zoals het verkrijgen van een beter begrip van de wisselwerking tussen verschillende signaleringsroutes die ten grondslag liggen aan de vorming van het perifere zenuwstelsel. Euthanaseer het vrouwelijke muis 12 dagen na het vinden van een vaginale prop en verwijder de baarmoeder; plaats de baarmoeder in een glazen petrischaal gevuld met ijs. Snijd de baarmoeder in koude PBS transversaal tussen de individuele zwellingen van het decidua om elke embryo-implantatieplaats onder een dissectiemicroscoop te isoleren, en gebruik fijne pincetten om de spierlaag van de baarmoeder te verwijderen.Open de viscerale dooierzak en het amnion om het embryo bloot te leggen. Wees voorzichtig bij het doorsnijden van de bloedvaten die het embryo met de dooierzak verbinden, aangezien deze verstrengeld zijn met de in ontwikkeling zijnde darmen. Plaats vervolgens gesloten pincetten in de buikholte, net boven de donkerrode lever, en open deze daar.Hiermee wordt een transversale opening in de buikholte gemaakt. Trek de geopende pincet naar het posterieure uiteinde van het embryo om de buik volledig te openen. Zodra deze geopend is, pakt u het bindweefsel achter de lever vast en trekt u de darmen eruit.Zorg dat de darmen niet beschadigen. Snijd de dikke darm op een willekeurige plaats door om de darmen te scheiden van de rest van het embryo. Bewaar het staartgedeelte voor later.Scheid het bindweefsel van het caecum en vervolgens de darmen, waarbij u voorzichtig te werk gaat om beschadigingen aan het rostrale uiteinde van de dunne darm te voorkomen. Verwijder de lever en de maag, evenals het meso, de nephros en de genital ridges indien aanwezig. Isoleer tot slot de dunne darm door het caecum en het colon, alsover het resterende bindweefsel, weg te snijden.Zorg er, zoals voorheen, voor dat de darm niet wordt ingesneden. Laat de dunne darm voor het inbedden zo kort mogelijk in PBS bij kamertemperatuur staan. Noteer na het doorsnijden van het embryo bij de nek het aantal staartsomieten om het stadium van de embryonale ontwikkeling nauwkeurig te bepalen.Voordat u overgaat tot de dissectie van de embryo's, lost u 1,5 gram agros op in 100 milliliter PBS en houdt u dit op 50 °C. Bereid de inbeddingsmal voor door een microcentrifugebuisje van twee milliliter in de lengte door te snijden om ongeveer een kwart van de wand van het buisje te verwijderen. Giet het gesmolten agros in de mal en laat het afkoelen tot het slechts licht warm aanvoelt.Wanneer u klaar bent, houdt u de darm met een pincet vast bij het gevouwen rostrale uiteinde en trekt u deze zeer langzaam door de agros, langs de lengte van de mal. Dit helpt om de darm recht te houden terwijl de agros uithardt; laat het weefsel los zodra het weerstand begint te bieden tegen beweging en houd de rostrale oriëntatie van de darm in de gaten. Plaats de mal vervolgens gedurende twee tot drie minuten in een koelkast om volledig te laten uitharden.Zodra deze zijn uitgehard, worden de agros uit de mal verwijderd en wordt het overtollige agros aan beide uiteinden afgesneden, waarbij de sneden loodrecht op de darm worden gemaakt. Lijm het rostrale uiteinde van het agrosblok aan de metalen tafel van een microtoom en trim het overtollige agros aan alle zijden. Monteer vervolgens de metalen tafel in de kamer van de vibrerende microtoom.Pas indien nodig de hoek van de tafel aan zodat de darm zo verticaal mogelijk ligt. Bedek het preparaat met ijskoud PBS voordat het mes van de microtoom naar een positie van enkele millimeters onder het bufferoppervlak wordt gebracht. Maak, wanneer u klaar bent, transversale coupes van 200 micron van de distale dunne darm.Zorg ervoor dat elke agro-slice een volledige darmsectie bevat. Plaats de vers gesneden slices voorzichtig op een vooraf bereide collageengel. Plaats één slice in het midden van elke well om de migratie van neurale kamcellen uit de slices mogelijk te maken en incubeer de slices gedurende drie dagen.Haal na deze tijd de plakjes voorzichtig met een pincet van de collageengel af, waarbij u er op let de onderliggende gel niet te beschadigen. Om te voorkomen dat het celmigratiepatroon wordt verstoord, is het belangrijk om direct contact met de collageengel te vermijden tijdens de daaropvolgende incubatie- en wasstappen. Fixeer de cellen vervolgens met 500 µL 4% PFA per putje gedurende één uur bij kamertemperatuur.Vervang vervolgens het fixatief door 500 µL DPI-oplossing per well en incubeer gedurende 10 minuten. Verwijder bij kamertemperatuur voorzichtig de DPI-oplossing en was elke well drie keer met 500 µL PBS gedurende vijf minuten. Fotografeer tot slot de fluorescerende cellen die zijn ingebed in de collageengel in elke well.In dit voorbeeld werden groeifactoren gebruikt om de migratie van GFP-expresserende enterische neurale crestcellen te stimuleren. De stippellijn geeft de geschatte grootte en locatie van het explantaat aan. Voordat het van de gel werd verwijderd, bleek het aantal en de verspreiding van GFP-expresserende cellen die uit het intestinale explantaat migreerden significant groter te zijn in behandelde vergeleken met onbehandelde condities.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het migratiepotentieel van enterische neurale progenitorcellen kan worden bepaald door darmcoupes te incuberen bovenop een collageengel die groeifactoren bevat.

a-quantitative-cell-migration-assay-for-murine-enteric-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

This video demonstrates the neural precursor cell neurosphere migration assay—an in vitro assay to study the migratory response of neural precursor cells from the neurosphere—via microscopic analysis.

NPC Neurosphere Assay: An In Vitro Assay to Assess the Migratory Response of Neural Precursor Cells from the Neurosphere

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Neuroblast migratie is een cruciale stap in postnatale neurogenese. Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt om de rol van de kandidaat regulatoren van neuroblast migratie door gebruik DNA / small hairpin RNA (shRNA) nucleofection en een 3D migratietestsysteem met neuroblasts geïsoleerd van het knaagdier postnatale rostrale migratiestroom onderzoeken.

Nucleofectie van knaagdieren neuroblasts om neuroblast Migratie Studie<em&gt; In vitro</em

De transplantatie van neurale stamcellen / progenitorcellen (NPC) houdt grote beloften in de regeneratieve neurologie. De systemische toediening van NPCs is in efficiënte, lage invasief en therapeutisch zeer effectief protocol om stamcellen te leveren in de hersenen en ruggenmerg van knaagdieren en niet-menselijke primaten die door experimentele chronische inflammatoire schade aan het centrale zenuwstelsel.

Systemische Injectie van neurale stamcellen / progenitorcellen in Muizen met chronische EAE

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC's. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.

Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer een ex vivo celmigratie-assay voor enterische neurale voorlopercellen in muizenembryo's met fluorescentiemicroscopie. Deze methode kwantificeert migratie in reactie op groeifactoren voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Meer video's verkennen