Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

Het algemene doel van deze procedure is om het migratiepotentieel van enterische neuro-progenitors te kwantificeren in aanwezigheid van verschillende groeifactoren. Dit wordt bereikt door eerst muis embryonale, kleine darmen te dissecteren die zijn bevolkt door fluorescerende neuro-crustcellen. De tweede stap is het gebruik van een vibrerend microtoom om 200 micron dikke plakken darm te maken.

Vervolgens worden deze plakken geïncubeerd op een collageengel die groeifactoren bevat. De laatste stap is het verwijderen van de plakken om de onderliggende migreren cellen zichtbaar te maken. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om het patroon van de migreren cellen in de collageengel te tonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een belangrijke vraag in de ontwikkelingsbiologie, zoals het beter begrijpen van de interactie tussen verschillende signaalroutes die ten grondslag liggen aan de vorming van het perifere zenuwstelsel. 12 dagen nadat een vaginale plug is gevonden, moet de vrouwelijke muis worden gedood en de baarmoeder worden verwijderd, de baarmoeder in een glazen petrischaal gevuld met ijs worden geplaatst. Koude PBS snijdt de baarmoeder dwars tussen individuele deum-zwellingen om elke embryo-implantatieplaats onder een dissectiemicroscoop te isoleren, gebruikt fijne pincetten om de spierlaag van de baarmoeder te verwijderen.

Open de viscerale dooierzak en amnion om het embryo zichtbaar te maken. Wees voorzichtig bij het doorknippen van de bloedvaten die het embryo met de dooierzak verbinden, omdat ze verweven zijn met de zich ontwikkelende darmen. Plaats vervolgens gesloten pincetten in de buikholte net boven de donkerrode lever en laat ze openen.

Dit creëert een transversale opening in de buikholte. Trek de geopende pincetten naar het achterste uiteinde van het embryo om de buik volledig te openen. Eenmaal geopend, grijpt u het bindweefsel achter de lever en trekt u de ingewanden eruit.

Zorg ervoor dat u de darmen niet breekt. Snijd de dikke darm op elke locatie om de ingewanden te bevrijden van de rest van het embryo. Bewaar het staartgedeelte voor later.

Trek het bindweefsel voorzichtig los van het blinddarm en vervolgens van de darmen, zonder ze te beschadigen op het rostrale uiteinde van de dunne darm. Snijd de lever en maag af, evenals de meso, nephros en genitale richels indien aanwezig. Isoleer ten slotte de dunne darm door het blinddarm en de dikke darm te verwijderen, evenals het overgebleven bindweefsel.

Zoals eerder, wees voorzichtig om de darm niet te snijden. Laat de dunne darm in PBS op kamertemperatuur zo kort mogelijk liggen voordat u het inbedt. Nadat u het embryo bij de nek hebt doorgesneden, noteert u het aantal staartsegmenten om het stadium van embryonale ontwikkeling nauwkeurig te bepalen.

Voordat u doorgaat met het dissecteren van het embryo, smelt u 1,5 gram agros in 100 milliliter PBS en bewaart u het op 50 graden Celsius. Bereid de inbeddingsvorm voor door een microcentrifugebuisje van twee milliliter in de lengte door te snijden om ongeveer een kwart van de buiswand te verwijderen. Giet de gesmolten agros in de vorm en laat het afkoelen tot het slechts licht warm aanvoelt.

Wanneer u klaar bent, houdt u de darm met pincetten bij de gevouwen rostrale uiteinden vast en trekt u deze heel langzaam door de agros, langs de lengte van de vorm. Dit helpt om de darm recht te houden terwijl de agros vaststelt, laat het weefsel los zodra het begint te weerstaan en houd rekening met de rostrale richting van de darm. Plaats vervolgens de vorm twee tot drie minuten in de koelkast om volledig uit te harden.

Eenmaal uitgehard, verwijdert u de agros uit de vorm en snijdt u het overtollige agros aan beide uiteinden af, door sneden te maken loodrecht op de darm. Lijmt u het rostrale uiteinde van de agros-blok aan de metalen tafel van een microtoom en snijdt u het overtollige aros aan alle kanten bij. Monteer vervolgens de metalen tafel op de vibrerende microtoomkamer.

Indien nodig, pas de hoek van de tafel aan zodat de darm zo verticaal mogelijk staat. Bedek het monster met ijskoud PBS voordat u het microtoomblad naar een paar millimeter onder het bufferoppervlak brengt. Wanneer u klaar bent, maakt u 200 micron transversale sneden van de meest kleine darm.

Zorg ervoor dat elke agros-snede een volledige darmsectie bevat. Leg de vers gesneden plakken voorzichtig op een eerder bereide collageengel. Plaats één plakje in het midden van elke put om de migratie van neuro-crustcellen uit de aubergines mogelijk te maken, en incubeer de plakken gedurende drie dagen.

Na deze tijd verwijdert u de plakken voorzichtig van de collageengel met pincetten, zorg ervoor dat u het gel eronder niet beschadigt. Om ervoor te zorgen dat het celmigratiepatroon niet wordt verstoord, is het belangrijk om het collageengel niet direct aan te raken tijdens de daaropvolgende incubatie- en wasstappen. Fixeer eerst de cellen met 500 microliters 4% PFA per put gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Vervolgens vervangt u het fixeermiddel door 500 microliters DPI-oplossing per put en incubeert u gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur verwijdert u voorzichtig de DPI-oplossing en wast u elke put drie keer met 500 microliters PBS gedurende vijf minuten. Ten slotte fotografeert u de fluorescerende cellen die in de collageengel zijn ingebed in elke put.

In dit voorbeeld werden groeifactoren gebruikt om de migratie van GFP-expresserende enterische neuro-crustcellen te stimuleren. De gestippelde lijn geeft de geschatte grootte en locatie van de explan weer. Voordat het van het gel werd verwijderd, werd vastgesteld dat het aantal en de verspreiding van GFP-expresserende cellen die uit de intestinale explan migreerden, significant groter was in behandelde versus onbehandelde omstandigheden.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebb