Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing
18 oktober 2013
We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.
Het algemene doel van deze procedure is om somatische mutaties in kanker geassocieerde genen van cellen uit tumorweefsel te identificeren door gebruik te maken van gebarcodeerde, multiplexe DNA-bibliotheken, gevolgd door massief parallel sequencing. Dit wordt bereikt door eerst gebarcodeerde sequencing adapters aan DNA-fragmenten te binden die geïsoleerd zijn uit bewaarde tumoren. De tweede stap van de procedure is hybridisatie met aangepaste biotinyleerde oligonucleotiden, complementair aan alle eiwit coatende exonen van 279 oncogenen en tumorsuppressorgenen.
De derde stap is het uitvoeren van massief parallel sequencing van de gebarcodeerde pools van de gevangen bibliotheken. De laatste stap is het zoeken naar kanker geassocieerde veranderingen voor de 279 doelwitten genen in de sequentiegegevens. Deze procedure kan sequentiemutaties, kleine inserties, kleine deleties, kopienummer veranderingen en geselecteerde structurele veranderingen onthullen.
Dus de belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zijn dat het mogelijk maakt om hele exonen te onderzoeken voor zowel de veelvoorkomende als zeldzame mutaties, evenals het identificeren van aanvullende genomische veranderingen zoals kopienummer verliezen en winst, en grotere gevoeligheid in heterogene monsters te bereiken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het kankergenomica veld te beantwoorden, zoals wat zijn de belangrijkste drivermutaties in verschillende kankertypen, en correleren deze mutaties in klinische monsters met uitkomsten of respons op gerichte therapieën? De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de diagnose en behandeling van kanker omdat mutaties prospectief kunnen worden geïdentificeerd en kunnen worden gebruikt om patiënten te begeleiden naar geschikte therapieën en klinische onderzoeken.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat een bee clean stap moeilijk te leren is vanwege een voorzichtige techniek die nodig is tijdens het wassen en het losmaken van DNA van kralen. Bereid het end repair master mix voor. Meng de juiste volumes om 50 microliter per monster te hebben. Verdeel de 50 microliter van elk sheer DNA in afzonderlijke wells van een ID zes well plate.
Voeg vervolgens 50 microliter van de bereide end repair master mix toe aan elke reactie en incubeer de plaat in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius om de reactie schoon te maken. Voeg eerst 200 microliter AMP pure XP kralen toe aan elk monster en pipet de volledige volume 10 keer voorzichtig op en neer met behulp van een multikanaals pipet. Volg dit door de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
Vervolgens breng de platen naar de magnetische stand en laat ze 15 minuten bij kamertemperatuur klaren. Eenmaal opgehelderd, verwijder en gooi voorzichtig het grootste deel van het supernatant weg en zorg ervoor dat de kralen niet worden verstoord. Er kan wat vloeistof in de wells achterblijven.
Voeg vervolgens voorzichtig 200 microliter vers bereide 80% ethanol toe aan elk monster en incubeer de plaat gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur. Pipetteer voorzichtig het ethanol weg en herhaal de wasbeurt nogmaals. Laat de plaat vervolgens bij kamertemperatuur drogen totdat al het alcohol ontsnapt is.
Resuspendeer nu de gedroogde kralen in 44,5 microliter steriel water. Stroom elk monster voorzichtig door de pipetteer 10 keer met de laatste uitwerping. Spoel eventuele kralen die aan de zijkant van de well vastzitten weg.
Incubeer nu de in water gesuspendeerde kralen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, en verplaats ze vervolgens gedurende vijf minuten naar de magnetische stand totdat de wells helder zijn. Overbreng ten slotte voorzichtig 42 microliter van het heldere supernatant in elk well, dat het monster bevat, naar een nieuwe well. De monsters kunnen nu tot een week worden bewaard bij min 20 graden Celsius.
Begin met het bereiden van de D tailing master mix in een steriele micro centrifugeerbuis. Voeg acht microliter van de bereide DA tailing master mix toe aan elk well met end gerepareerd DNA. Incubeer vervolgens de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een thermocycler om de reactie op te schonen.
Gebruik hetzelfde proces dat in het vorige gedeelte is beschreven bij tweemaal het volume en eindig met het opnieuw suspenderen van de kralen in 33,75 microliter steriel water. Op dit punt kunnen de monsters vervolgens tot een week worden bewaard bij min 20 graden Celsius. Om door te gaan, bereid een ligatie master mix voor voor 15 microliter per reactie.
Voeg 15 microliter van de ligatie master mix toe aan elk well dat het D tail DNA bevat. Voeg vervolgens 1,25 microliter van de juiste 25 micromolar toe. Volgende flex gebarcodeerde adapter.
Aan elk well moet elk monster een afzonderlijk gebarcodeerde adapter ontvangen. Zodra de adapters zijn geladen, incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 20 graden Celsius. Gebruik nu 50 microliter kralen om een post-adapter ligatie opruiming uit te voeren en suspendeer het monster in steriel water tot 50 microliter.
Voer vervolgens het opruimingsproces een tweede keer uit en eindig met 23 microliter water. Op dit punt kunnen de monsters vervolgens tot een week worden bewaard bij min 20 graden Celsius. De volgende stap is het versterken van elke bibliotheek, wat gedetailleerd is in het tekstprotocol op ijs ontdooien, de universele en index oligonucleotide blokkers, de CCAP easy bibliotheek en de nimble gen capture componenten, die de con TNA two X hybridisatie buffer en hybridisatie component bevatten.
A.Bereid nu een één millimolar pool van index oligonucleotide blokkers voor die overeenkomt met de specifieke gebarcodeerde adaptersequenties die in de bibliotheekvoorbereiding worden gebruikt. Combineer één microliter van elke blokker en vortex ze gedurende 10 seconden. Bereid in een nieuwe 1,5 milliliter buis de opvangmix voor die bestaat uit vijf microliter van conte A bij één milligram per milliliter, twee microliter van universele blokker en twee microliter van de blokkerpool. Pool 24 gebarcodeerde bibliotheken in één enkele reactie.
Voeg een totaal van één tot drie microgram van de gepoolde gebarcodeerde sequentiebibliotheek toe aan de opvangmix. Prik 15 tot 20 gaten in de dop met een 20 gauge of kleinere naald. Vacuüm het mengsel in een A DNA vacuüm concentrator bij 60 graden Celsius totdat het volle
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het identificeren van somatische mutaties in kanker-geassocieerde genen uit tumorweefsel met behulp van gebarcodeerde gemultiplexte DNA-bibliotheken en massaal parallelle sequencing. De methode maakt gebruik van hybridisatie-gebaseerde exon-capture om belangrijke mutaties in klinische monsters te detecteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Kankeronderzoek
- Next Generation Sequencing
Achtergrond
- Somatische mutaties spelen een kritieke rol bij de ontwikkeling van kanker.
- Gerichte exonsequencing biedt een hoge sensitiviteit voor mutaties met een lage frequentie.
- Massively parallel sequencing maakt een high-throughput en kostenefficiënte analyse mogelijk.
- Op maat gemaakte gebiotineerde oligonucleotiden verbeteren de specificiteit van de mutatiedetectie.
Doel van de studie
- Om kankergerelateerde mutaties in klinische tumorstalen te detecteren.
- Om barcode-DNA-bibliotheken te gebruiken voor efficiënte sequencing.
- Om de sensitiviteit en specificiteit van de mutatieidentificatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Ligatie van gebarcodede sequentiesadapters aan DNA-fragmenten van geconserveerde tumoren.
- Hybridisatie met gebiotinyleerde oligonucleotiden die gericht zijn op exonen van oncogenen en tumorsuppressorgenen.
- Massaal parallelle sequencing van de gecapteerde libraries.
- Analyse van sequentiedata op kanker-geassocieerde alteraties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van sequentiemutaties en kleine inserties/deleties.
- Detectie van kopie-aantalvariaties en specifieke structurele veranderingen.
- Hoge gevoeligheid bereikt voor mutaties met een lage frequentie.
- Uitgebreide analyse van 279 doelgenen.
Conclusies
- De methode biedt een robuust kader voor mutatiedetectie in kankeronderzoek.
- Gebarcodeerde multiplex sequencing verhoogt de efficiëntie van genetische analyse.
- Deze benadering kan een significante bijdrage leveren aan strategieën voor gepersonaliseerde geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Gerichte exonsequenering stelt biofarmaceutische R&D in staat om laagfrequente somatische mutaties in heterogene tumorstalen te detecteren, wat bijdraagt aan targetvalidatie in een vroeg stadium en mechanistische risicoreductie. Door een diepe dekking van oncogenen en tumorsuppressorgenen te bieden, verhoogt deze methode het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen en informeert ze strategieën voor lead-identificatie. De compatibiliteit met FFPE-monsters vergemakkelijkt de translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het identificeren van sequentiemutaties, inserties, deleties en kopie-aantalvariaties in 279 kankergerelateerde genen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door hooggevoelige detectie van laagfrequente varianten in heterogene monsters.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden door het detecteren van specifieke structurele herschikkingen naast puntmutaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve sequentiegegevens op exon-niveau, waardoor een gestandaardiseerde beoordeling van de mutatielast en allelfrequentie mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Barcoded multiplexing maakt parallelle verwerking van tumor-normaalparen mogelijk, wat de reproduceerbaarheid en doorvoer van de assay verbetert.
- Wetenschappelijke waarde: Diepe dekking verhoogt de gevoeligheid voor het detecteren van subklonale mutaties, wat betrouwbare compoundscreening in ziekterelevante modellen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Detecteert kopie-aantalstoenames en -afnames tussen tumor- en normale paren, wat bijdraagt aan mechanistische modellen van oncogen-amplificatie of verlies van tumorsuppressors.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van genetische alteraties in preklinische modellen mogelijk, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Wetenschappelijke waarde: Levert mutatiedata die correleren met fenotypische responsen, wat helpt bij de afstemming van translationele biomarkers.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm door hypothese-gestuurde targetvalidatie mogelijk te maken, wat bijdraagt aan de identificatie van lead-verbindingen via mutatieprofilering, en ondersteunt preklinisch werk via longitudinale genetische monitoring.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verhelderen van signaalpaden door het detecteren van somatische veranderingen in kankergeassocieerde genen.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten die essentieel zijn voor assay-standaardisatie en de evaluatie van verbindingen in gemultiplexte formats.
- Analytica: Biedt allelspecifieke read-counts en kopiegetalinferenties die statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt bevindingen uit fundamenteel onderzoek met preklinische continuïteit door de detectie van mutaties die correleren met de respons op geneesmiddelen.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Barcoded library-preparatie maakt hergebruik over meerdere projecten en tumortypen mogelijk, waardoor de benutting van het platform wordt gemaximaliseerd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door laagfrequente mutaties en kopiegetalvariaties te detecteren die door methoden met een lage diepte worden gemist.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerde workflow met barcodering en multiplexing verbetert de reproduceerbaarheid en verlaagt de kosten per monster.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door oncogene drivers en resistentiemechanismen vroeg in de ontdekkingsfase te onthullen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van mutatieprevalentie en functionele impact.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van nucleïnezure bibliotheken, hybridisatiegebaseerde capture en analyse van next-generation sequencing-gegevens.
- Afhankelijk van toegang tot massively parallel sequencing-platforms en gebiotineerde oligonucleotidesondes voor target-verrijking.
- Noodzaak van gestandaardiseerde protocollen voor de verwerking van FFPE- en vers ingevroren weefsel om DNA-kwaliteit en bibliotheekopbrengst te garanderen.
- Vereist bio-informatische infrastructuur voor alignment, variant calling en kopie-aantalinferentie vanuit sequencing-gegevens.
- Prestaties beperkt door de kwantiteit en kwaliteit van het input-DNA, in het bijzonder bij gedegradeerde FFPE-monsters die de capture-efficiëntie beïnvloeden.
