Name: Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer een naaldinjectiemethode voor het inoculeren van maïs en teosinte met Ustilago maydis. Deze techniek maakt gecontroleerde pathogeenafgifte mogelijk en vergemakkelijkt het bestuderen van ziekteresistentie in planten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Dr. Emir Islamovic voor laboratorium- en kashulp. We danken ook Dr. Sherry Flint-Garcia voor het leveren van de maïs x teosinte introgressie lijnen.

1. Groei van plantaardig materiaal
<ol><li>Selecteer plantlijnen voor inenting en screening. Voor dit werk werden twee maïslijnen, vijf teosintelijnen en veertig maïs x teosintelijnen met een niet-gekarakteriseerde weerstand tegen U. maydis gebruikt (tabel 1).</li>
	<li>Plant zaden voor experimentele(U. maydis injectie) en controle (water injectie) naald injectie inenting experimenten. Doe dit voor elke plantenlijn.</li>
	<li>Plant vier zaden (repliceert) voor elke plantenlijn in kleine platten door de zaden ongeveer 1/2 inch met de vinger in de grond te duwen en lichtjes met aarde te bedekken (figuren 1A en 1B). Verpak de grond niet over het zaad. Het dieper planten van het zaad of het verpakken van de grond over het zaad kan problemen veroorzaken met het ontstaan van zaailingen.</li>
	<li>Geef de zaden water in de grond. Zorg ervoor dat de grond doorweekt is en dat de zaden na het water geven onder de grond blijven.</li>
	<li>Plaats planten na het water geven in een groeikamer met dag- en nachtomgevingen van respectievelijk 28/20 °C temperatuur en 14/10 uur fotoperiode en ongeveer 500 μmol/m2 sec   fotosynthetisch actieve stralingen aan de bovenkant van de luifel. Houd de relatieve luchtvochtigheid overdag en 's nachts op respectievelijk ongeveer 70% en 90%.</li>
	<li>Houd alle planten in dezelfde groeikamer om een groeiomgeving te behouden die congruent is tijdens het experiment.</li>
	<li>Verwijder na 10 dagen de planten uit de groeikamer en enteculleer de planten met de U. maydis celsuspensiecultuur met behulp van een naaldinjectie-inentingsmethode. Opmerking: Maïsplanten kunnen 7 dagen na het planten8-10worden ingeënt. De teosinteplanten zijn echter na 7 dagen te klein. Inenteer daarom zowel maïs- als teosinteplanten 10 dagen na het planten op consistentie binnen het experiment (zie stap 2.12).</li>
</ol>2. Naald injectie inenting
<ol><li>Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Verwijder U. maydis glycerolvoorraden uit de diepvriesopslag. Gebruik een steriele lus en streepglycerolbestanden van U. maydis wild-type stammen 1/2 (paringstype a1b1) en 2/9 (paringstype a2b2, bijna isogeen tot 1/2) op aardappel dextrose agar (PDA) platen. Houd stammen apart.</li>
	<li>Plaats PDA-platen met U. maydis gedurende twee dagen in een incubator van 30 °C. Gebruik bij gebruik van een andere biotrofe ziekteverwekker de juiste stam-, media- en groeiomstandigheden. Controleer de groei van de ziekteverwekker gedurende de periode van twee dagen om ervoor te zorgen dat de U. maydis-stam goed groeit.</li>
	<li>Verwijder de PDA-platen na twee dagen uit de incubator. De platen moeten een goede pathogene groei hebben en enkele kolonies bevatten (figuur 2A). Het is belangrijk om enkele kolonies te verkrijgen. Als er geen enkele kolonies aanwezig zijn, restreak de platen in een lagere concentratie.</li>
	<li>Doe al het werk in een laminaire stromingskap. Gebruik een steriele tandenstoker om een enkele kolonie voor elke soort uit de PDA-platen te selecteren. Plaats de tandenstoker met een enkele kolonie in een aardappeldextrosebouillon (PDB) van 3 ml. Het wordt aangeraden om 2-3 culturen te hebben.</li>
	<li>Plaats de 3 ml PDB-culturen gedurende twee dagen bij 200 tpm in een incubator/shaker van 30 °C. Monitor de groei van de cultuur over de periode van twee dagen om de groei van de cultuur te garanderen. De cultuur zou erg bewolkt moeten lijken.</li>
	<li>Verwijder de vloeibare culturen uit de incubator/shaker en meet de concentratie op OD600 om ervoor te zorgen dat de cellen werden gekweekt tot een OD van 1,0 (~1 x 107 cellen/ml)17.</li>
	<li>Breng de U. maydis celsuspensieculturen in een uiteindelijke concentratie van 1 x 106 cellen/ml, met water in een laatste kweekvolume van 30 ml. Deze concentratie resulteert consequent in een goede infectie van de planten met de pathogene celsuspensiecultuur. 17 
</li>
</ol>Opmerking: Verschillende celsuspensieconcentraties moeten worden getest bij het gebruik van verschillende pathogene stammen om de juiste celtiter te bepalen die nodig is voor inenting18,19. De gegeven eindconcentratie voor de celsuspensiecultuur kan worden gebruikt als uitgangspunt voor tittering. De juiste concentratie van de pathogene celsuspensiecultuur moet worden geverifieerd door de fenotypen van de plant met een goede infectie te visualiseren (figuren 3A-E).
<ol start="8"><li>Meng gelijke volumes van de twee U. maydis stammen voorafgaand aan de inenting. Als u één ziekteverwekkerstam gebruikt, gaat u verder met stap 2.9. Bereid verse U. maydis celsuspensieculturen voor elk inentingsexperiment voor en gooi celsuspensieculturen na twee dagen weg.</li>
	<li>Vul voor de experimentele naaldinjectie-inenting een spuit van 3 ml met de U. maydis-celsuspensiecultuur door de celsuspensiecultuur in de spuit te trekken. </li>
	<li>Vul voor de injectie-inenting van de controlenaald een spuit van 3 ml met water17. Gebruik dezelfde procedure voor de experimentele naaldinjectie-inenting.</li>
	<li>Bevestig een injectienaald van 0,457 mm x 1,3 cm aan het uiteinde van elke spuit van 3 ml. De geselecteerde naaldgrootte levert de celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren met minimale schade aan het plantenweefsel.</li>
	<li>Verwijder de experimentele en controleplanten 10 dagen na het planten uit de groeikamer ter voorbereiding op naaldinjectie-inentingen (figuur 2B) (zie stap 1.7).</li>
	<li>Steek voorzichtig de injectienaald met de U. maydis celsuspensiecultuur in de stengel van een experimentele plant onder een hoek van 90° net boven de grondlijn. Steek de naald in het midden van de steel. Duw de naald niet door de steel (figuur 2C).</li>
	<li>Injecteer de experimentele plant met ongeveer 100 μl van de U. maydis cel suspensie cultuur18,19. Dit zal enigszins variëren, afhankelijk van de hoogte van de zaailing. De celsuspensiecultuur duwt door de stengel en beweegt in de werveling van de plant. De celsuspensiecultuur zal zichtbaar zijn in de werveling van de plant. Blijf 100 μl van de celsuspensiekweek in elke afzonderlijke plant injecteren totdat de spuit van 3 ml leeg is.</li>
	<li>Verwijder na de injectie voorzichtig de naald van de plantenstam. Verwijder de naald uit de nu lege spuit van 3 ml en vul met water. Bevestig de naald terug aan de spuit en duw het water door de naald om eventueel plantenweefsel te verwijderen dat in de naaldpunt kan worden gevangen.</li>
	<li>Herhaal stap 2.9-2.15 voor elke experimentele installatie. Volg hetzelfde protocol voor de controle-installaties door water te injecteren.</li>
	<li>Plaats de ingeënte experimentele en controleplanten terug in de groeikamer. Geef de planten dagelijks water door de grond nat te maken, niet het plantenweefsel.</li>
	<li>Controleer de planten dagelijks om de ontwikkeling van ziekteverwekkers en resistentiereacties van planten te detecteren.</li>
</ol>3. Screening van weerstandsreacties
<ol><li>Scoor en registreer de weerstandsreacties voor elke plant 7, 10, 14 en 21 dagen na inenting (dpi) met behulp van een 1 tot 5 weerstandsreactiebeoordelingsschaal. De ernst van de ziekte neemt toe naarmate de numerieke waarden op de beoordelingsschaal toenemen (tabel 2). Een weerstandsreactie van 1C (Bladchlorsis), 1A (Productie van anthocyanine van het blad) of 2 (kleine bladgalen) duidt op weerstand. Een weerstandsreactie van 3 (stengelgalen), 4 (basale gal) of 5 (plantensterfte) duidt op gevoeligheid (figuren 3A-E en tabel 2)18,19.</li>
	<li>Scoor zowel experimentele als controle-installaties en noteer weerstandsreacties.</li>
	<li>Vergelijk de weerstandsreacties van de experimentele en controle-installaties. Selecteer experimentele planten met een weerstandsreactie van 1C, 1A of 2. Deze planten worden geacht resistent te zijn tegen U. maydis18,19.</li>
	<li>Herhaal het hele experiment om de fenotypes van de plant te verifiëren.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , ISB News. report 
 
 <a target="_blank" href="http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf">http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSher%2C+AF+%22Vegetable+diseases+and+their+control%22">Vegetable diseases and their control</a>. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).</li>
<li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li>
<li>Iltis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+evolution+and+agricultural+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Grass+systematic+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Maize evolution and agricultural origins.</a> Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).</li>
<li>Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+corn.+III.+Modern+races%2C+the+product+of+tesonite%5BTitle%5D)+AND+%22Bot.+Mus.+Leafl.%22%5BJournal%5D)">The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite.</a> Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).</li>
<li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , Academic Press. New York. (1997).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+beteen+Fusarium+verticillioides%2C+Ustilago+maydis%2C+and+Zea+mays%3A+An+endophyte%2C+a+pathogen%2C+and+their+shared+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host.</a> Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).</li>
<li>Freeman, S., Rodriguez, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+assessing+pathogenicity+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp+niveum+and+F.+o.+melonis+on+cucrbits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits.</a> Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).</li>
<li>Gottwald, T. R., Graham, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+precise+and+nondisruptive+stomatal+inoculation+of+leaf+tissue+with+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens.</a> Phytopathol. 82, 930-935 (1992).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Asomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycolog.+Res%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales).</a> Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+pathogenicity+genes+in+Ustilago+maydis+by+restriction+enzyme-mediated+intergratior+%28REMI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI).</a> Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corn+smut+caused+by+Ustilago+maydis.+Monograph+number+2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2.</a> , The American Phytopathological Society. (1963).</li>
<li>Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.%22%5BJournal%5D)">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li>
<li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein%2C+KP4%2C+are+highly+resistant+to+corn+smut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li>
<li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li>
<li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li>
<li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis+as+a+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li>
<li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole-3-acetic+acid+%28IAA%29+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li>
<li>Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Ustilago+maydis%2C+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li>
<li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+plant+pathology%3A+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie was de naaldinjectie-inentingsmethode die werd gebruikt om een stam U. maydis in de stengel van 700 maïs- en teosinteplanten af te leveren succesvol. Bovendien werd een herziene ziekteresistentiebeoordelingsschaal gebruikt om de planten te screenen en de ontwikkeling van pathogenen te detecteren. Als gevolg van het gebruik van beide methoden werden plantenlijnen geïdentificeerd die resistent zijn tegen U. maydis onder 700 maïs- en teosinteplanten die nu kunnen worden gecombineerd en getes...

Schimmelziekten van planten vormen een van de meest vooraanstaande bedreigingen voor de landbouw. De noodzaak om gewassen te ontwikkelen met een betere ziekteresistentie neemt toe als gevolg van de voedselbehoeften van een groeiende wereldbevolking. Plantenpathogenen infecteren van nature gewasplanten in het veld en veroorzaken ziekten die de gewasopbrengst negatief beïnvloeden6. Het is aangetoond dat het identificeren en gebruiken van resistente planten de weerstand kan verbeteren en het opbrengstverlies kan verminderen. Resistente cultivars zijn geïdentificeerd in veel plantensoorten, waaronder maïs, tarwe, rijst en sorghum door de planten te enten met een plantenpathogenen en te selecteren voor resistente lijnen7. Daarom zou de ontwikkeling en het gebruik van een efficiënte inentingsmethode het mogelijk maken om veel planten te enten en te screenen op resistentie. Verschillende inentingsmethoden zijn gebruikt, waaronder dip-inenting, het pipetten van de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plant en naaldinjectie-inenting8-11. Bij elke methode moet de ziekteverwekker betrouwbaar worden geïntroduceerd tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria om de ontwikkeling van pathogenen en planteninfectie te garanderen12,13.
De dip-inentingsmethode omvat het onderdompelen van een plantenzaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur, terwijl de pipetteermethode vereist dat de pathogene celsuspensiecultuur in de werveling van de plantenzaailingen wordt geplaatst. Er zijn echter problemen met beide methoden. Ten eerste zijn beide methoden afhankelijk van de natuurlijke beweging van de ziekteverwekker van het bladoppervlak naar het plantenweefsel, wat zeer variabel is. De meeste ziekteverwekkers komen van nature de plant binnen via stomatale openingen of wonden op het bladoppervlak van de plant. Er is echter een aanzienlijke variabiliteit in het vermogen van de pathogenen om het bladoppervlak van de plant door de huidmondjes en/of wonden op het bladoppervlak te penetreren. Daarom kan de penetratie van ziekteverwekkers niet worden gecontroleerd met een van beide inentingsmethodes die mogelijk leiden tot inconsistente gegevens. Ten tweede, bij het screenen van een groot aantal planten, kan het onderdompelen van de zaailingen in een pathogene celsuspensiecultuur tijdrovend zijn en het aantal planten beperken dat kan worden gescreend. Omgekeerd levert het hierin beschreven inentingsprotocol voor naaldinjectie de pathogene celsuspensiecultuur tussen de plantenbladeren die de vorming van appressoriavergemakkelijken 14. De ziekteverwekker gebruikt vervolgens de nieuw ontwikkelde appressoria om de plant binnen te komen en het probleem van de penetratie van pathogenen te elimineren. Bovendien biedt het inentingsprotocol voor naaldinjectie een reeks fenotypes voor maïs- en teosinteplanten die zijn ingeënt met U. maydis en een goede infectie aantonen. De fenotypes kunnen worden gebruikt als een marker om de beste concentratie te bepalen voor de pathogene celsuspensiecultuur, wat resulteert in consistente plantenfenotypes binnen en tussen verschillende experimenten.
Na inenting van de plant met een pathogene celsuspensiecultuur worden planten meestal gescreend om een resistent of gevoelig fenotype8-11,15te detecteren. Hoewel ziektebeoordelingsschalen op grote schaal worden gebruikt om plantenfenotypen te screenen en te classificeren, verschillen de beoordelingsschalen afhankelijk van de ziekteverwekker die wordt geanalyseerd. Daarom kan een protocol voor de beoordeling van ziekten voor U. maydis en maïsinteracties worden gebruikt voor vergelijkbare schimmelpathogenen16.
De huidige reeks protocollen beschrijft de inenting van naaldinjecties met een U. maydis celsuspensiecultuur en ziekteresistentiereactiescreening van maïs,teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen. De huidige protocollen zijn niet beperkt tot naaldinjectie-inenting van U. maydis in maïsplanten, maar kunnen worden gebruikt voor relatief elke schimmelpathogene ziekteverwekker en plantensoort. Daarom zullen onderzoekers, door de details van beide methoden in hetzelfde protocol op te nemen, de protocollen voor inenting en screening direct kunnen gebruiken of de oorspronkelijke protocollen kunnen manipuleren om beter te passen bij de pathogene en plantensoorten van belang.

<table><tbody><tr><td>Zaad voor planten</td><td></td><td></td><td>Verzameld uit originele kruisingen</td></tr><tr><td>Groeikamer</td><td>Conviron</td><td>PGR14 REACH-IN</td><td></td></tr><tr><td>Plantenbakken</td><td>Hummert International</td><td>14-3385-2</td><td></td></tr><tr><td>Grond (3 delen dennebast; 1 deel veenmos met perliet)</td><td>Hummert International</td><td>10-1059-2</td><td></td></tr><tr><td>Laminare stromingskast</td><td>Lab Conoco</td><td>70875372</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol voorraad van pathogeen (U. maydis) of schimmelpathogeen van belang</td><td></td><td></td><td>Voorraden werden gekweekt uit originele cultuur</td></tr><tr><td>Steriele lus</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17356A</td><td></td></tr><tr><td>Aardappeldextrose agar (PDA) platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>R454311</td><td></td></tr><tr><td>Incubator ingesteld op 30 &deg;C</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650F</td><td></td></tr><tr><td>Steriele tandenstokers</td><td>Walmart</td><td></td><td>Gekocht bij Walmart en gesteriliseerd door autoclaaf</td></tr><tr><td>Aardappeldextrose bouillon (PDB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN1008617</td><td></td></tr><tr><td>Incubator-schudler ingesteld op 30 &deg;C</td><td>New Brunswick</td><td>14-278-179</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>4001000</td><td></td></tr><tr><td>U. maydis&nbsp;celsuspensiecultuur (1 x 106 cellen/ml)</td><td></td><td></td><td>Gegroeid uit glycerol voorraad zoals beschreven in de methoden</td></tr><tr><td>3 ml Spuiten</td><td>Becton Dickinson</td><td>309606</td><td></td></tr><tr><td>.457 mm x 1.3 cm Hypodermische naalden</td><td>Kendall Brands</td><td>8881250321</td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Maïs is wereldwijd een belangrijk graangewas. Gevoeligheid voor biotrofe pathogenen is echter de primaire beperking om de productiviteit te verhogen. U. maydis is een biotrofe schimmelpathogene ziekteverwekker en het oorzakelijk agens van maïssmut op maïs. Deze ziekte is verantwoordelijk voor aanzienlijke opbrengstverliezen van ongeveer $ 1,0 miljard per jaar in de VS1 Verschillende methoden, waaronder vruchtwisseling, fungicidetoepassing en zaadbehandelingen, worden momenteel gebruikt om maïssmut2te beheersen. Gastheerresistentie is echter de enige praktische methode voor het beheren van maïssmut. Identificatie van gewasgewassen, waaronder maïs, tarwe en rijst die resistent zijn tegen verschillende biotrofe pathogenen, heeft de opbrengstverliezen per jaar aanzienlijk verminderdmet 3-5. Daarom zou het gebruik van een pathogene inentingsmethode die de ziekteverwekker efficiënt en reproduceerbaar tussen de plantenbladeren levert, de snelle identificatie van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydisvergemakkelijken. Als, een eerste stap naar het identificeren van maïslijnen die resistent zijn tegen U. maydis, werd een naaldinjectie-inentingsmethode en een resistentiereactiescreeningsmethode gebruikt om maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen te enten te selecteren met een U. maydis-stam en om resistente planten te selecteren.
Maïs, teosinte en maïs x teosinte introgressielijnen, bestaande uit ongeveer 700 planten, werden geplant, ingeënt met een stam van U. maydis, en gescreend op resistentie. De inentings - en screeningsmethoden identificeerden met succes drie teosintelijnen die resistent zijn tegen U. maydis. Hier wordt een gedetailleerd naaldinjectie-inentings- en resistentiereactiescreeningsprotocol voor maïs-, teosinte- en maïs x teosinte-introgressielijnen gepresenteerd. Deze studie toont aan dat naaldinjectie-inenting een onschatbaar hulpmiddel in de landbouw is dat U. maydis efficiënt tussen de plantenbladeren kan leveren en plantenlijnen heeft geleverd die resistent zijn tegen U. maydis die nu kunnen worden gecombineerd en getest in fokprogramma's voor verbeterde ziekteresistentie.

Een succesvolle naaldinjectie-inenting kan worden bepaald door het fenotype van de met U. maydis ingeënte planten (experimenteel) te visualiseren. De meeste experimentele planten waren vatbaar voor U. maydis-infectie. De vatbare planten vertoonden een zeer ernstige ziekteontwikkeling die werd aangetoond door stam- en basale galvorming met zwarte teliosporen (figuren 3D en 3E, tabel 2). Verschillende planten waren dood na inenting vanwege de ernst van de...

Het gebruik van een naaldinjectiemethode om maïs- en teosinteplanten te enten met de biotrofe ziekteverwekker Ustilago maydis wordt beschreven. De inentingsmethode voor naaldinjectie vergemakkelijkt de gecontroleerde afgifte van de schimmelpathogenese tussen de bladeren van de plant waar de ziekteverwekker de plant binnenkomt door de vorming van appresoria. Deze methode is zeer efficiënt, waardoor reproduceerbare inentingen met U. maydis mogelijk zijn.

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Het algemene doel van deze procedure is om een USTA Lago-muiscel-suspensiecultuur via naaldinjectie te inoculeren en een screening van de ziekteresistentiereactie van maize tete- en maize teosinte-kruisingslijnen uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst plantlijnen te selecteren voor inoculatie en screening. Vervolgens worden de zaden voor de experimentele en controle-naaldinjectie-inoculatie-experimenten geplant.10 dagen later wordt de cellusie met U geïnjecteerd in de stengel van elke plant. Ten slotte worden de resistentiereacties van de experimentele planten en de controleplanten vergeleken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle inoculatie via naaldinjectie aantonen door het fenotype van de met U.mais geïnoculeerde plant te visualiseren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het pathogeen direct tussen de bladeren wordt afgeleverd. Dit elimineert het probleem van de penetratie van het pathogeen. Selecteer om te beginnen plantlijnen voor inoculatie en screening; zoals hier wordt getoond, werden voor deze studie twee maïslijnen, vijf teosintelijnen en 40 maïs-teosinte kruisingslijnen met niet-gekarakteriseerde resistentie tegen U Mais

a-rapid-efficient-method-for-assessing-pathogenicity-ustilago-maydis

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

Hier presenteren we een protocol om te testen van de virulentie van de plant met de plant pathogen Magnaporthe grisea. Dit verslag zal bijdragen tot de grootschalige screening van de biotypen van schimmels isolaten en dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het begrijpen van de resistente mechanismen van planten tijdens de moleculaire veredeling.

De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.

Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Dit is een eenvoudig protocol van een gerstbladschedetest met minimale reagentia en gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur (inclusief een basissmartphone). Het doel is om het vroege infectieproces van blastziekte in laboratoria te visualiseren zonder toegang tot geavanceerde microscopieapparatuur.

Visualisatie van vroege infectieplaatsen van rijstontploffingsziekte (Magnaporthe oryzae) op gerst (Hordeum vulgare) met behulp van een basismicroscoop en een smartphone

Dit manuscript beschrijft een geoptimaliseerd inoculatieprotocol dat gebruik maakt van losse maïsbladomhulsels voor reproduceerbare cytologische, fysiologische en moleculaire studies van maïsinteracties met schimmelpathogenen van planten. De bladomhulsels vergemakkelijken real-time observatie van cellulaire interacties tussen de levende plant en de schimmel in niet-gefixeerde weefsels.

Losse maïsomhulsels voor levende beeldvorming van infectie door schimmelpathogenen van bladmaïs

Snelle biobeoordelingsprotocollen met behulp van benthische macro-invertebraten worden vaak gebruikt om de waterkwaliteit te controleren en te beoordelen. Een efficiënt protocol omvat het verzamelen van Chironomidae oppervlaktedrijvende poppenhuiden (SFPE). Hier worden technieken beschreven voor het verzamelen in het veld, laboratoriumverwerking, het monteren op dia's en de identificatie van Chironomidae SFPE.

Gebruik van Chironomidae (Diptera)-Surface Drijvende Pupal Exuviae als Rapid Protocol Bioassessment voor Water Bodies

Accuraatheid en precisie van de technieken die worden gebruikt om methaanemissies van herkauwende dieren te meten, zijn van cruciaal belang voor het succes van inspanningen om broeikasgasemissies te verminderen. Dit manuscript beschrijft de principes en werking van een geautomatiseerd systeem om methaan- en kooldioxidemassastroom uit de adem van herkauwende dieren te bewaken.

Het gebruik van een Automated System (GreenFeed) naar Enterisch methaan en kooldioxide emissies van herkauwers Monitor

Leer een naaldinjectiemethode voor het inoculeren van maïs en teosinte met Ustilago maydis. Deze techniek maakt gecontroleerde pathogeenafgifte mogelijk en vergemakkelijkt het bestuderen van ziekteresistentie in planten.

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Meer video's verkennen