Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Het algemene doel van deze procedure is om door middel van naaldinjectie een USTA Lago maus celsuspensiecultuur te inoculeren en een ziekteresistentiereactiescherming uit te voeren van maze tete en maze teosinte kruislijnen. Dit wordt bereikt door eerst plantlijnen te selecteren voor inoculatie en screening. Vervolgens worden de zaden voor experimentele en controle naaldinjectie-inoculatie-experimenten geplant.

10 dagen later wordt de U gemaakte celsuspensie in de stengel van elke plant geïnjecteerd. Ten slotte worden de resistentiereacties van de experimentele en controleplanten vergeleken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een succesvolle naaldinjectie-inoculatie laten zien door het visualiseren van het fenotype van de plant geïnoculeerd met jou.Mais.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de ziekteverwekker direct tussen de bladeren afgeeft. Dit elimineert het probleem van ziekteverwekkerpenetratie. Om te beginnen selecteert men plantlijnen voor inoculatie en screening zoals hier getoond, werden twee maze-lijnen, vijf teosinte-lijnen en 40 maze Teosinte kruislijnen met ongekarakteriseerde resistentie tegen U Mais gebruikt voor deze studie voor experimentele en controle naaldinjectie-inoculatie-experimenten.

Plant vier zaden van elke plantlijn in kleine vlakke vakken door de zaden ongeveer een halve centimeter in de grond te duwen met een vinger en ze lichtjes te bedekken met aarde. Plaats vervolgens de planten in een groeikamer en geef de zaden water totdat ze doorweekt zijn, ervoor zorgen dat ze onder de grond blijven na het water geven. Laat de planten groeien met dag- en nachtomgevingen van respectievelijk 28 en 20 graden Celsius, en 14 en 10 uur licht- en donkercycli.

En ongeveer 500 micromolar per vierkante meter per seconde van fotosynthetisch actieve straling aan de top van de luifel. Houd de relatieve luchtvochtigheid overdag en 's nachts respectievelijk ongeveer 70% en 90% en houd alle planten in dezelfde groeikamer om een groeiomgeving te behouden die congruent is over het hele experiment. Acht dagen na het planten van de zaden, gebruik een steriele lus om huis van een bevroren glycerolvoorraad op aardappel dextrose agar of PDA platen te strijken, incubeer gedurende twee dagen bij 30 graden Celsius en bewaak het regelmatig om ervoor te zorgen dat het goed groeit onder een laminaire stroomkast.

Gebruik een steriele tandenstoker om een enkele kolonie voor elke stam te selecteren en plaats deze in drie milliliterbuisjes met PD-bouillon. Incubeer de culturen bij 30 graden Celsius en 200 RPM gedurende twee dagen, periodiek controleren op groei. Meet vervolgens de OD 600 van de culturen om ervoor te zorgen dat ze zijn gegroeid tot een OD van 1,0.

Breng de culturen met water naar een uiteindelijke concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter in een uiteindelijk volume van 30 milliliter. Deze concentratie van pathogene celsuspensie resulteert consistent in een goede infectie van de planten. Meng vervolgens gelijke volumes van de twee gemaakte stammen voor de inoculatie.

Voordat je een drie milliliter spuit vult met de celsuspensie, vul je de controlespuit met water om te injecteren met minimale schade aan de plant. Bevestig een hypodermische naald van nulpunt 457 millimeter bij 1,3 centimeter aan het uiteinde van elke spuit. Verwijder de planten uit de groeikamer en injecteer in een hoek van 90 graden net boven de grondlijn.

Breng voorzichtig de naald van de U maus in de stengel van een experimentele plant tot deze zich in het midden van de stengel bevindt. Injecteer ongeveer 100 microliter van de celsuspensie. Het zal door de stengel duwen en zichtbaar worden terwijl het zich in de wervel van de plant beweegt.

Ga door met het injecteren van extra experimentele planten totdat de spuiten leeg zijn. Vul vervolgens met water om de naald van elk plantweefsel te reinigen en vul de spuit opnieuw totdat alle planten zijn geïnjecteerd. Gebruik de waterspuit om de controleplanten op een vergelijkbare manier te injecteren.

Wanneer de injecties voltooid zijn. Plaats de planten dagelijks terug in de groeikamer. Geef alleen water aan de grond en controleer op ontwikkeling van de ziekteverwekker en plantresistentiereacties.

Gebruik een resistentiereactie-beoordelingsschaal van één tot vijf, schaal, score en noteer de resistentiereacties voor elke plant 7, 10, 14 en 21 dagen na inoculatie of DPI. De numerieke waarden op de beoordelingsschaal nemen toe met toenemende ziekteseveriteit. Bijvoorbeeld, A1C een A of twee weerstandsreactie geeft weerstand aan.

Een drie, vier of vijf weerstandsreactie geeft vatbaarheid aan. Vergelijk de weerstandsreacties van de experimentele en controleplanten en selecteer experimentele planten met een A1C een a of twee weerstandsreactiebeoordeling. Deze planten worden beschouwd als resistent tegen matis.

In dit experiment waren de meeste geïnfecteerde geïnoculeerde planten gevoelig voor infectie. Planten vertoonden ernstige ziekteontwikkeling, aangetoond door stengel en basale gallevorming met zwarte teliosporen. Verschillende planten stierven na inoculatie vanwege de ernst van de ziekte.

In tegenstelling daarmee waren de controleplanten zeer schoon en vertoonden ze geen ontwikkeling van de ziekteverwekker op enig deel van de plant, wat aangeeft dat de ontwikkeling van de ziekteverwekker op de experimentele planten te wijten was aan de naaldinjectie-inoculatie met U Mais. Drie Mais Teosinte kruislijnen die resistent waren tegen U Mais werden geïdentificeerd, en een succesvolle inoculatie werd geverifieerd door lichte sclerose, cyaanproductie of lichte bladgallevorming. Deze techniek kan op een zeer efficiënte manier worden uitgevoerd met reproduceerbaarheid. Dit helpt bij het inoculeren en fenotyperen van een groot aantal planten.