Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker
November 2nd, 2013
Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.
Deze transcriptomische analyse van menselijk prostaatkankerweefsel identificeert individuele humane endogene retrovirusexpressieloci om een aangepaste hoogwaardige microarray als screeningsinstrument voor biomarkerontdekking te evalueren. Nadat de chirurg het prostaatorgaan uit de patiënt heeft verwijderd, bereidt de patholoog tumorale en aangrenzende normale weefsels afzonderlijk voor in het laboratorium, extract, zuivert en kwalificeert MR.NA uit de normale en tumorale weefsels, amplificeert mRNA's met behulp van een volledig transcriptoom ovation-kit en kleef en label vervolgens de resulterende geamplificeerde producten. Vervolgens verwerkt u de H-E-R-V-V twee microarray door sequentieel hybridisatie, wassen en scannen.
Uiteindelijk kunnen met behulp van biocomputingmethoden sets met sondes die significant signaal en differentiële expressie vertonen worden gevolgd, wat leidt tot de identificatie van transcriptioneel actieve individuele loci. Vele jaren geleden onderzochten we het gedrag van de IRV W-familie in verschillende contexten, inclusief multiple sclerose monsters. Placenta, testis.
Ik had voor het eerst het idee voor deze methode toen we begonnen te begrijpen dat overlappende of niet-overlappende subgroepen van IRV-elementen binnen een familie werden uitgedrukt. Afhankelijk van de context. Het gebruik van ship-technologie maakt gecoördineerde exploratie van verschillende her-families en gelijktijdige analyse van verschillende regio's voor elke locus mogelijk.
Bijvoorbeeld, US drie en UF-domein voor LTR, wat een directe rol in de pathologie kan ondersteunen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het kankerveld, zoals voor de diagnose van prostaatkanker, waarbij de bestaande eiwitbiomarkers zoals PSA, gebrek aan specificiteit en gevoeligheid hebben. Ondertussen lijken niet-coderende RNA's zoals PCA drie veelbelovender te zijn, wat aantoont dat de prostaatbehandelingsprocedure wordt verkocht door Michel, een technicus uit de pathologieafdeling.
Philippe per zal de RNA-extractie, doelvoorbereiding en analyse demonstreren, terwijl een technicus van het John Unit-laboratorium de ship-procedure zal demonstreren. Monteer het bevroren weefselcursus verticaal op een kleine hoeveelheid OCT in de cryostaat. Neem een enkele vijf micrometersectie, kleur het met Blu udine en voer vervolgens een snelle histologische onderzoek uit om de aard van het weefsel voor tumoraal weefsel te onderzoeken.
Schat de hoeveelheid tural-cellen en selecteer alleen cores met meer dan 80% tumoraalcellen. Snijd een andere vijf micrometersectie en kleur met hematine, eoin en saffraan. Snijd nu 15 secties van 30 micron dikte en breng ze over naar een RNA's vrije eend orph-buis.
Neem vervolgens een laatste vijf micrometersectie voor kleuring met hematine, eoin en saffraan om de hoeveelheid tumoraalcellen te controleren. Aan het einde van de procedure, overbreng de monsters op droogijs naar het moleculair biologielaboratorium. Homogeniseer het weefsel in Triol-oplossing op ijs, met behulp van een handbediende grinder totdat het weefsel volledig is opgelost.
Incubeer de monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 300 microliters chloroform toe en vortex gedurende 15 seconden. Na twee minuten bij kamertemperatuur centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 G bij twee tot acht graden Celsius.
Voor het RNA, breng voorzichtig de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg 750 microliters isopropanol toe, meng door inversie en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters om het geprecipiteerde RNA te pellen, was de RNA-pellet met één milliliter 80% ethanol.
Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 7.500 G bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant met behulp van P 1000 en P 10 tips. Laat de resterende ethanol aan de lucht drogen.
Voeg vervolgens 100 microliters RNA-vrij water toe. Breng de monsters over naar een 70 graden Celsius warmteblok. Om het pellet op te lossen, controleer de kwaliteit van RNA en de RNA-integriteit met behulp van een bioanalyzer en een NanoDrop volgens de instructies van de fabrikant.
Bij een ideale RNA-extractie is het RNA-integriteitsnummer typisch zeven of hoger. Ga verder met de volledige transcriptoom ovation, RNA-amplificatiekit volgens de instructies van de leverancier. Zuiver vervolgens het resulterende enkelstrengse CD NA-product.
Controleer de opbrengst en grootteverdeling van het enkelstrengse CDNA met behulp van een bioanalyzer en een NanoDrop volgens de instructies van de fabrikant. De grootteverdeling van geamplificeerde CD NA zou typisch tussen de 101 en 500 basen lang moeten zijn met een piek rond de 600 basen en een algemene klokvormige verdeling hebben. Om het CDNA te fragmenteren, voegt u 6,6 microliter fragmentatiemix toe aan twee microgram CD NA in 30 microliter spin en incubeert u gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius.
Deactiveer vervolgens de DNA's een bij 95 graden Celsius gedurende 10 minuten en houd het op ijs. Doe een microliter van het gefragmenteerde CDNA in een buisje voor verificatie van de grootteverdeling op basis van Agilent. DNA's een-behandeling homogeniseert de CD NA-grootteverdeling tot ongeveer 100 nucleotiden vóór hybridisatie.
Controleer de grootteverdeling van het enkelstrengse CD NA met behulp van een bioanalyzer Pfizer pre-wet. De HERV-genchip met 200 microliter pre-hybridisatie. Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij 50 graden Celsius, 60 RPM.
Voeg 131 microliter hybridisatiemix toe aan de 69 microliter gefragmenteerde en gelabelde CD NA bij kamertemperatuur, meng en incubeer gedurende twee minuten bij 95 graden Celsius. Incubeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 50 graden Celsius en centrifugeer gedurende vijf minuten met maximale snelheid. Leg nu de voorgewette HERV-genchip leeg en laad de 200 microliter doelvoorbereiding.
Breng moeilijke plekken aan op de twee SEPTA's, hybridiseer gedurende 18 uur bij 50 graden Celsius, 60 RPM. Leg de HERV-genchip leeg en vul de sonde. Wees array met 250 microliter wasbuffer, plaats 600 microliter SAPE-oplossingsmix en 600 micro
Overzicht
Deze studie onderzoekt de expressie van menselijke endogene retrovirussen (HERV) in prostaatkankerweefsels met behulp van een op maat gemaakte high-density microarray. De bevindingen zijn bedoeld om de ontdekking van biomarkers voor de diagnose van prostaatkanker te verbeteren.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Genomics
Achtergrond
- Menselijke endogene retrovirussen (HERV) omvatten 8% van het menselijk genoom.
- HERVs hebben beperkte coderingscapaciteiten maar talrijke lange terminale herhalingen (LTRs).
- Bestaande biomarkers voor prostaatkanker, zoals PSA, ontberen specificiteit en gevoeligheid.
- Non-coderend RNA zoals PCA3 belooft verbeterde diagnostiek.
Doel van de studie
- Om individuele HERV expressie loci in prostaatkankerweefsels te identificeren.
- Om een op maat gemaakte microarray te evalueren als een potentieel screeningsinstrument voor biomarkerontdekking.
- Om de rol van HERVs in de pathologie van prostaatkanker te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- RNA-extractie uit tumoraal en aangrenzend normaal prostaatweefsel.
- Amplificatie van mRNA's met behulp van een whole transcriptome kit.
- Hybridisatie van gelabeld cDNA op een op maat gemaakte HERV microarray.
- Biocomputing methoden om differentiële expressie van HERV loci te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van transcriptioneel actieve individuele HERV loci in prostaatkankerweefsels.
- Demonstratie van de capaciteit van de microarray om significante expressiesignalen te detecteren.
- Inzichten in de expressiepatronen van HERVs in relatie tot kankerpathologie.
Conclusies
- De op maat gemaakte microarray identificeert effectief HERV expressie in prostaatkanker.
- Bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van specifiekere biomarkers voor prostaatkanker.
- Verdere studies zijn nodig om de klinische implicaties van HERV expressie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Prostate cancer biomarker discovery faces challenges due to the limited specificity and sensitivity of current clinical markers like PSA. This study introduces a high-density microarray platform designed to characterize individual HERV loci expression, offering a novel approach to identify transcriptionally active elements that may serve as disease-specific biomarkers. By enabling systematic detection of HERV-driven ncRNA transcription and coding gene modulation, the method supports mechanistic de-risking and target validation in oncology discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying individual HERV loci with differential expression in tumor versus normal prostate tissues.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through functional analysis of HERV loci, including LTR, gag, and pol regions, to assess regulatory potential in cancer pathways.
- Operational Value: Provides a standardized microarray workflow for reproducible detection of HERV expression across matched tumor-normal sample pairs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative expression data from fragmented and labeled cDNA hybridized to HERV-specific probe sets, enabling biomarker screening.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via biocomputing normalization, hierarchical clustering, and false discovery rate correction for differential expression analysis.
- Operational Value: Supports scalability through processing of multiple match pair samples (initial 5, expanded to 35) to identify prostate-specific HERV signatures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links HERV expression patterns to cancer pathology by focusing on LTR subdomains (U3, U5) with potential roles in transcriptional regulation.
- Scientific Value: Enables follow-up validation via RT-PCR primer design targeting functionally annotated HERV structures identified on the microarray.
- Operational Value: Promotes translational continuity by connecting discovery-phase HERV locus identification to downstream functional and diagnostic applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, particularly in ncRNA-based biomarker exploration for prostate cancer.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying transcriptionally active HERV loci that may drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression in tumor contexts.
- Screening: Enables assay readiness through standardized RNA extraction, whole transcriptome amplification, cDNA fragmentation, and microarray hybridization steps.
- Analytics: Delivers quantitative differential expression measurements after normalization and FDR correction, allowing comparison of HERV loci expression between tumor and normal tissues.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through functional validation of top HERV hits using annotated sequences and PCR primer design for RT-PCR confirmation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for HERV expression profiling applicable across cancer types, as demonstrated by additional match pair samples from other tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving mechanistic ambiguity around HERV loci expression in prostate cancer.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized workflows for RNA extraction, amplification, labeling, and microarray processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing biomarker candidates with stronger disease association than PSA, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of HERV loci based on expression magnitude, specificity, and functional annotation for downstream investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to high-density microarray equipment, hybridization ovens, scanners, and biocomputing tools for data normalization and clustering.
- Necessitates cross-team standardization between pathology, molecular biology, and bioinformatics teams for sample processing and data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the HERV microarray to different tissue types or cancer models beyond prostate cancer.
- Limited by the need for statistically validated workflows and representative patient sampling to ensure robustness in biomarker discovery, as noted in the study’s conclusion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:42
Handling of Prostrate Tissues
4:03
RNA Extraction, Purification, and Quality Control
5:53
Target Preparation
7:33
Hybridization to the HERV Chip Microarray
9:24
Scanning and Data Analysis
10:14
Results: Identification of Active HERV Loci in Prostrate Tissues
11:49
Conclusion
