Name: Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-14T22:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Leer een geavanceerde radiologische techniek voor focale bestraling op kleine diermodellen om neurogenese te remmen. Deze methode gebruikt CT-geleide driedimensionale beeldvorming voor nauwkeurige lokalisatie van neurale progenitorpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken C. Montojo, J. Reyes, en M. Armour voor technisch advies en bijstand. Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health subsidie ​​F31 NS063550 (naar DAL), een Basil O&#39;Connor Starter Scholar Award en subsidies van de Klingenstein Fonds en NARSAD (SB). SB is een WM Keck Distinguished Young Scholar in Medical Research.

Animal Gebruik Verkrijgen goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruik Comite voor standaard zorg en gebruik protocollen. Het huidige protocol is ontwikkeld voor focale stralingsstudies op 5,5-10 weken oude volwassen C57BL6 / J muizen zoals eerder beschreven (figuur 2) 2. Echter, andere leeftijden en kleine diersoorten (ratten, hamsters, grondeekhoorns, etc.) kunnen ook worden gebruikt, op voorwaarde dat doeltreffende anesthesie protocollen en een radiografische verwijzing atlas voor de identificatie van de regio van belang (ROI) zijn beschikbaar. 1. Kalibratie van CT-geleide Radiologische Platform Voer-film gebaseerd kalibraties voor stralingsdosis op de radiologische platform bij voorbaat voor elke collimator grootte en het type van X-ray tube filter gebruikt. Om een boog straal van bestraling richten op de gewenste doellocatie, gebruik dan de stralingsdosis-planningssoftware 49 beschike meeste commerciële straling platforms gewenste levertijd berekenen op basis van de stralingsdosis, de diepte van het gebied van belang (ROI) gebaseerd op CT-scans van de muis, en de rotatiesnelheid van de robotica platform, details hierover zijn weggelaten van dit protocol als zij verschillen tussen straling platforms. Ten behoeve van het visualiseren ventrobasal hypothalamus 2 (figuur 3) met CT, werken de röntgenbuis met een 0,4-mm brandpunt en stralingsenergie van 100 kVp met 1 mm Al filtratie. Voor focale bestraling van de HPZ, bedienen de röntgenbuis bij 225 kVp, 13 mA, en een 1 mm brandpunt met een filteroppervlak van 0,15 mm Cu, tot 10 Gy straling leveren tegen een weefsel diepte van 0,6 cm in een behandelperiode tijd van 4,6 minuten. Targeting verschillende ROI vereist berekenen verschillende parameters. <ol><li> Bij het ​​bestuderen van de effecten van vetrijke dieet op neurogenese in de mediane eminentie zoals eerder beschreven 2, vinden vier weken oude vrouwelijke C57BL6 / J muizen uit Jackson Mouse laboratoria, en het huis vier muizen per kooi. Schakel eten van normaal voer een vetrijk dieet na vijf weken oud. Laat muizen te wennen aan nieuwe huisvesting en voedsel. Voer CFIR behandeling bij 5,5 weken oud. Transport onderwerpt aan de operatie kamer dat de radiologische platform bevat. Minimaliseer stress tijdens de overdracht. Bereid isofluraan gas anesthesie kamer. Voeg vervolgens een enkele muis in de kamer. Tegelijkertijd bereiden verwarming pad (lage stand) voor de nabehandeling. </li><li> Zodra muis is onder en niet meer reageren op mond-pad compressie, breng het onder de radiologische platform en plaats op de immobilisatie bed van de robot podium. Plaats mond onderwerp in de neuskegel anesthesie cup, en tanden in de bijt blok (figuur 1D). Leg muis plat op de immobilisatie bed en controleer of het blijft ongevoeligheid handhaven. Zo ja, band naar beneden muis om het bed met gaas tape. Terwijl taping de muis om het bed, Zorg ervoor dat het hoofd wordt genivelleerd tot een horizontaal vlak. Dit kan worden bepaald door aan de oren en kijken of zij worden genivelleerd. Zodra de muis in de juiste positie, sluit de leiding beschermplaat. </li><li> Het verwerven van de computer-tomografie scan met software aan boord van radiologische platform de experimentator (dit verschilt tussen de platformen), die een driedimensionale anatomische structurele scan van de muis onderwerp zal bieden. Controleer of de muis hoofd waterpas van het horizontale vlak. Zo niet, herhaal dan de stappen 1,2-1,3 tot hoofd van het onderwerp wordt genivelleerd. </li><li> Identificeer ROI CT-beeld door. Bereken afstand van ROI naar het oppervlak van de schedel met een 45 ° hoek met het horizontale vlak zoals getoond in figuur 3E. </li><li> Met behulp van software aan boord, neem een X-ray van de muis onderwerp van bovenaf zoals weergegeven in figuur 4A. Verwijder vervolgens de muis van de radiologische platform, op verwarming pad en controleren totdat actief. </li><li> Uit de coronale CT-beelden, berekent de gemiddelde ROI anatomische diepte van ten minste drie muizen om de uitvoering dosering te bepalen. Als voorbeeld uit een eerdere studie 2 waar 10 Gy bestraling werd toegediend aan de ventrobasal hypothalamus, de diepte van de ROI van de schedel (vanuit een hoek van 45 °) is 0,66 cm (zie figuur 3E). Wetende dat, gebruikten de onderzoekers de dosis planning software (DPS) op hun radiologische platform geïnstalleerd om het juiste toerental en duur van de behandeling te berekenen om de gewenste dosering te verkrijgen om de ROI. </li><li> Na het bepalen behandelingsduur en rotatiesnelheid van de robot podium met de dosis-planningssoftware meten dosisverdeling van de berekende parameters Gafchromic stralingsgevoelige films ingebed in een trace kunststof mock-muismodel. Om dit te doen, insluiten drie Gafchromic stralinggevoelig films tussen vier verticaal gestapelde-water equivalent plastic blokken 29 alszie figuur 4B. </li><li> Plaats mock muismodel met Gafchromic films op robotachtige podium, en lopen de focale bestraling bundel met de nieuw berekende parameters. Bijvoorbeeld, de ventrobasal hypothalamus, inputdoel de parameters van 0,15 mm Cu filter, 225 kVp, 13 mA, 1-mm stralingsbundel instelling 45 ° prismahoek, 1,3 ° / sec rotatie en 4,6 min met een ROI bereiken radiologische dosis van 10 Gy. </li><li> Na bestraling, controleer films voor patroon en de intensiteit van de straling dosering. Voor een 360 ° hoek rotatie met de opgesomd om ventrobasal hypothalamus, een donkere ring in de film boven de isocentrum, een kleine heldere plek aan de isocentrum film, en een lichtere ring in de film onder de isocentrum overeenkomt met de kegel-doelparameters beam administratie van de bestraling zal worden waargenomen (Figuur 4B). </li><li> Superimpose isocentrum Gafchromic film over de X-stralen van de muis onderwerpen waaruit de parameters cal warenkend. De bestraalde centraal op isocentrum moet samenvallen met de gewenste ROI regio zoals getoond in figuur 4C. </li></ol> Alternatieve methode: Als moeite met het richten hersenen ROI wordt verholpen, gebruikt jodium contrast intrathecaal geïnjecteerd om visualisatie van ventrikels verbeteren onder CT-beelden. Omwille van de beknoptheid, wordt deze procedure weggelaten uit dit protocol, maar eerder beschreven 35, 50. Jodium contrast zal zorgen voor extra ventriculaire monumenten (figuur 5A). 2. Het bepalen van nauwkeurigheid van Bestraling Beam Verdere bevestiging CFIR nauwkeurigheid bundel door directe visualisatie van de stralingsbundel in weefsel 2, 35, 51. Om dit te doen, uit te voeren immunohistochemie te sporen γH2AX 51, een histon-eiwit en een vroege marker van dubbele DNA-breuken. Muis onderwerpen moeten transcardially worden doorbloed en binnen een uur na bestraling vast. Na bestraaldatie, DNA herstel snel optreedt, en de niveaus van ΥH2Ax significante daling van 35. <ol><li> Herhaal stappen 1,1-1,3. </li><li> Nadat het doel is geïdentificeerd op CT, is de muis onderwerp onder robotachtige controle verplaatst naar deze doelgroep af te stemmen met de straling levering balk. Input berekende parameters (toerental en duur van de behandeling om de gewenste dosering te bereiken) van stap 1.6 in dosis-planning software en beginnen met de behandeling. De behandeling wordt geleverd met de gantry gewezen op 45 ° van de verticaal, terwijl de muis draait om een ​​verticaal georiënteerde as. </li><li> Na bestraling, voeren transcardial perfusie op de muis onderwerpen. Voer perfusie binnen een uur 52. Na perfusie, onderdompeling fix hersenen in 4% PFA / PBS en schud overnacht bij 4 ° C. </li><li> De volgende ochtend, was 5 min in PBS 3x te paraformaldehyde fixeermiddel te verwijderen. Vervolgens dompelen in 30% sucrose in 1x PBS op een rocker bij 4 ° C. </li><li> Schud bij 4 ° C (ushandmatig 12-16 uur), totdat de hersenen zinkt naar bodem van de buis. Dit dient als een cryoprotection stap. Eenmaal hersenen zinken, verwijder hersenen met een geperforeerde lepel om overtollig 30% sucrose/1x PBS overdracht te voorkomen. Snel insluiten in invriesmedium op droog ijs. Swirl bevriezing medium met pipet en lijn hersenen in plastic mal. </li><li> Eenmaal volledig bevroren, transfer hersenen blokken -20 ° C vriezer voor opslag. </li><li> Op de dag dat immunohistochemie zal worden uitgevoerd, sectie coronaalwaarts bij 40 micrometer dikte, en zweven in een 24-wells plaat met PBS met een dun penseel. Onderdelen moeten in de juiste seriële zodat immuunkleuring bestraling dekking van doelgebied vast worden gehouden. </li><li> Voorverwarmen 0,01 M natriumcitraat-oplossing tot 80 ° C in een waterbad ter voorbereiding van antigenen stap. Tegelijkertijd, terwijl de natriumcitraat aan het opwarmen is, presteren 5 min wasbeurten 3x in 0,01 M PBS. </li><li> Zodra natriumcitraat oplossing bij 80 ° C, dompel hersensecties in de natriumcitraat bufferoplossing. Voeg in een waterbad bij 80 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder de sectie en laat natriumcitraatoplossing op kamertemperatuur komen, dan voeren drie 5 minuten wassen in 0,01 M PBS. </li><li> Blokkeren hersenen secties voor 1 uur in PBS-Triton met 5% normaal geit serum. </li><li> Incubeer hersensecties overnacht in PBS-Triton bevattende 5% normaal geit serum 1:700 concentratie van muis-anti-fosfo-H2AX primaire antilichaam bij 4 ° C. </li><li> De volgende dag, voeren 15 min wast 3x in 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Incubeer hersensecties PBS-Triton bevattende 5% normaal geit serum met geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met 488 nm fluorphore bij 1:500 concentratie 2 uur. </li><li> Voer de 15 min wast 3x in 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Voer 4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) vlek (1:5000 in PBS) gedurende 10 min tot kern visualiseren. Vervolgens wassen hersenen secties 5 minuten met PBS. </li><li> Monteer aan elektrostatisch charged objectglaasjes door drijvende sectie in PBS. Veeg het overtollige PBS en laat dia&#39;s te drogen. Dekglaasje dia met fixeermiddel en laat de dia te drogen in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht. </li><li> Neem foto&#39;s van seriële coronale secties met fluorescentiemicroscoop. ΥH2Ax immunostaining (groen) geeft de plaats van bestraling. DAPI (blauw) is een nucleaire vlek (Figuur 5B). </li></ol> 3. Voorbereiding van de muis Onderwerpen voor Focal Bestraling Onderzoek ΥH2Ax immunostaining resultaten. Eenmaal tevreden met de kalibratie en het richten van de bestraling balk, doorgaan met het experiment. Op dit punt, de totale tijd die nodig is om een ​​muis te behandelen (bij opstart dierlijke voltooiing van straallevering) ongeveer 10-15 min bij 10 Gy behandeling met een 1-mm beam. <ol><li> Bestel vier weken oude C57BL6 / J vrouwelijke muizen van Jackson Muis laboratoria. Huis vier muizen per kooi en zet voedsel uit normale choween vetrijk dieet vijf weken oud. Oor punch muizen om hen unieke merktekens geven. Monitor gezondheid van muizen dagelijks. Opmerking: metallic markers kunnen niet worden gebruikt zullen ze resulteren in lijn artefacten op de CT. </li><li> Weeg muizen de dag voor straling of blanco behandeling. Split muizen in twee cohorten voor straling of blanco behandeling en ervoor te zorgen dat er geen significant verschil in gewicht tussen cohorten. Op de dag van de behandeling, wanneer de muizen zes weken oud, weeg alle muizen en noteer het gewicht. Voorzichtig vervoeren beide cohorten naar de radiologische platform. Zorg om stress te minimaliseren. </li><li> Bereid isofluraan gas anesthesie kamer. Verdoven twee muizen, een in de voorafbepaalde bestraling groep en een in de sham controlegroep. Bereid verwarming pad in de lage stand voor postoperatieve behandeling. </li><li> Volg de stappen 1,2-1,4 voor de muis aan bestraling te ontvangen. Voor de sham muis, houd de muis in de anesthesie kamer terwijl de behandeling aan de hand is. Maken sure dat anesthesie kamer ligt vlakbij de CFIR platform, zodat eventuele effecten op omgevingsstraling worden gehouden inch Na de doelstelling wordt aangegeven op CT, beweeg de muis onderwerp onder robotachtige controle om dit doel te brengen met de straling levering balk. Input berekende parameters (toerental en duur van de behandeling) in de dosis-planningssoftware. </li><li> Zodra bestralingsbehandeling is voltooid, keren zowel sham en bestraalde muizen verwarming pad en controleren totdat ze wakker worden. </li><li> Terug zowel sham en bestraalde muizen aan dierlijke faciliteit. Monitor elke dag. Weeg de muizen elke halve week. Bestraling van gerichte hypothalamus proliferatieve zone bevestigen, toedienen intraperitoneale injecties van BrdU (50 mg / kg) drie dagen na de behandeling en onderzoeken neurogenese tussen groepen door colabeling van immunohistochemie voor BrdU en een neuronale marker een maand na de eerste BrdU blootstelling (Figuur 6) 2. </li></ol>

JW heeft een financiering en overleg onderzoek overeenkomsten met Xstrahl, Inc

CT-geleide focale bestraling (CFIR) is een nieuwe en compleet systeem benadering kan leveren straling velden om doelen in kleine dieren onder robotachtige controle met behulp van CT-begeleiding 32. Het vermogen van CFIR om zeer gerichte bundels te leveren aan kleine diermodellen biedt nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar het laboratorium onderzoek en klinische vertaling te overbruggen. Dit document beschrijft de CFIR aanpak voor exacte bestraling levering specifiek te richten een hypothalamus neurale voor...

Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat de volwassen hersenen van zoogdieren een opmerkelijke mate van plasticiteit kan ondergaan. -Volwassen geboren neuronen worden gegenereerd door volwassenheid in gespecialiseerde niches van de hersenen van zoogdieren 1. Wat is de functie van deze volwassen geboren neuronen? En meer nog, ze een rol in de fysiologie en gedrag spelen? Studies over dit onderwerp zijn van oudsher gericht op de subventricular zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone van de hippocampus, maar recente studies hebben neurogenese gekenmerkt in andere hersengebieden zoals de zoogdieren hypothalamus 2. Neurogenese is gemeld bij de postnatale en volwassen hypothalamus 2-10, en de functie van deze pasgeboren neuronen van de hypothalamus blijft een actief gebied van onderzoek. De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging voor het veld neurowetenschappen in het algemeen. Selectieve remming van specific neurale voorlopercellen bevolking blijft beperkt door het gebrek aan beschikbare moleculaire merkers die uniek zijn voor enkele neurale voorlopercellen bevolking 11 zijn. Zo selectieve verwijdering van volwassen geboren neuronen van deze neurale voorlopercellen via genetische targeting blijft moeilijk. Ook virale levering aan-volwassen geboren neuronen richten lijdt aan potentiële verstorende variabelen zoals de invoering van verwondingen en ontstekingen in het milieu 12. Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een tot deze verwart omzeilen en onderzoeken deze vragen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en maakt een niet-invasieve methode om neurale populaties richten 13-15. Onlangs beschreven we een germinal regio van de zoogdieren hypothalamus mediaan eminentie (ME) die wij genoemd de hypothalamus proliferatieve zone (HPZ) 2 </sup&gt;. We vonden dat wanneer jonge vrouwelijke muizen volwassen kregen een vetrijk dieet (HFD), niveaus van neurogenese in HFD-gevoede muizen waren aanzienlijk hoger dan hun normale voer (NC) gevoed controles op dit ME regio 2. Om te testen of volwassen neurogenese in de hypothalamus ME reguleert de stofwisseling en gewicht, hebben we getracht dit proces te verstoren. De mediane eminentie een klein eenzijdige structuur aan de basis van de derde ventrikel waaruit regulerende hormonen vrijkomen. Om wildgroei en de daaropvolgende neurogenese remmen zonder dat de andere fysiologische functies van dit hersengebied, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van de nieuw geboren volwassen neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie 2 selectief remmen. Een aantal groepen in dienst straling om neurogenese te onderdrukken in canonieke regio&#39;s 14-28. Echter, vorige radiologische benaderingen algemeen gerichte grote gebieden, of often onbedoeld ook gerichte verschillende hersengebieden waar neurogenese gerapporteerd, waardoor het moeilijk om ondubbelzinnig koppelen elke gedragstekorten waargenomen defecten in specifieke neurale populaties. De mogelijkheid om meer gerichte bestraling wordt geleverd door radiologische platforms die c omputer-tomografie begeleide imaging combineren met f ocal bundel ir straling (CFIR) levering aan precieze anatomische targeting 29-36 mogelijk te maken. Stralingsbundels zo klein als 0,5 mm in diameter zijn specifieke neurale populaties 35 richten. Deze methode laat ons toe om de hypothalamus ME richten en te arresteren proliferatie en blokkeren neurogenese in kleine dieren. Na radiologische behandeling van deze voorlopercellen bevolking, kan fysiologische en gedragsmatige testen worden uitgevoerd om de potentiële functie van volwassen geboren cellen te verlichten. Focal targeting is vooral belangrijk voor onze toepassing, omdat dehypofyse ligt dicht bij de hypothalamus mediaan eminentie, bestraling van de hypofyse kan hormonale functie beïnvloeden en vervolgens de resultaten te beschamen. De biologische basis voor de onderdrukking van neurogenese na bestraling nog steeds onduidelijk. Vorige straling studies hebben zich op grote oppervlakte balken, en hebben geconcludeerd dat de onderdrukking van neurogenese wordt gemedieerd door een ontstekingsreactie 14, 37. Als zodanig is het onduidelijk of zeer focale bestraling neurogenese kan onderdrukken, aangezien geen aanzienlijke ontstekingsreactie opwekken. Echter, recente studies door onze groep van de klassieke neurogene gebied in de hippocampus hebben aangetoond dat zeer focale bestraling met een dosis van 10 Gy neurogenese kan onderdrukken gedurende tenminste 4 weken na bestraling 35. Om de functie van volwassen geboren neuronen van de hypothalamus in de mediaan eminentie ondervragen, maken we gebruik van een precisie straling device kan leveren CT beeldvorming in combinatie met een kleine diameter stralingsstralen om neurogenese te remmen ME. Met een röntgenbuis gekoppeld aan een portaal dat draait over een bereik van 360 °, leveren wij arc-beam micro bestraling licht met behulp van een robot gestuurde Model fase waardoor rotatie van een dierlijke patiënt tijdens bestraling (figuur 1) . Een hoge resolutie röntgendetector wordt gebruikt om beelden te verkrijgen wanneer de balk in de horizontale stand 33. Voor dit onderzoek werden CT beelden gereconstrueerd met een isotrope voxel grootte van 0,20 mm. On-board CT kon de identificatie van een doel, terwijl het dier de behandeling plaats. De doelstelling werd gelokaliseerd met behulp van de CT navigatie dosis-planning software, die was met onze commercieel beschikbare radiologische platform. Na het lokaliseren van onze ROI door CT-beeldvorming, werd het dier naar de juiste behandeling positie bewogen door de robotachtige specimen stadium dat vier graden heeftrees van vrijheid (X, Y, Z, θ). Door een combinatie van portaal en robot fase hoeken kunnen stralen worden geleverd vanuit bijna elke richting ten opzichte van het dier en stereotactische boogvormige behandelingen mogelijk 29. Voor deze en alle andere beeldvormende onderzoeken, werden de muizen geplaatst in een immobilisatie-apparaat dat de levering van verdoving isofluraan gas toestaat terwijl het beperken van beweging. De immobilisatie bed is CT-compatibel, en maakt verbinding met de robot monster etappe 34. We verwachten dat CFIR conceptuele vooruitgang zal bieden in een aantal onderzoeksgebieden. Hoewel we gebruik van radiologische targeting van de hypothalamus mediaan eminentie als bewijs van het principe van deze techniek, kan CFIR worden gebruikt om een ​​deel van het lichaam van een klein model organisme in principe richten. In de neurologie, bijvoorbeeld ogen we deze techniek kan worden gebruikt om de functie van actief proliferatieve voorlopercellen populaties die zijn voorgesteld exis evaluerent in andere circelvormige, zoals het gebied postrema 38, 39, subfornicaal orgaan 40 en de hypofyse 41. Langdurige controverses over de functionele rol van de volwassen neurogenese en het identificeren van een causale rol in het gedrag kan nu ook beter worden aangepakt. In zangvogel, kan deze techniek de rol van volwassen neurogenese behoud van de robuuste en seizoensgedrag van de vogels 42 die wordt belemmerd door het vermogen om selectief te remmen neurogenese in specifieke hersengebieden pakken. Inzicht in deze robuuste behavioral model zou nieuw inzicht te werpen op de rol van de volwassen neurogenese in het reguleren van andere seksueel dimorf gedrag. Ook bij het metabool gebied CFIR kan worden gebruikt om aspecten van de rol van de proliferatie van levercellen en zijn rol in het metabolisme en energiebalans verkennen. De mogelijkheid voor conceptuele vooraf verschillende onderzoeksdisciplines wordt verbeterd door de introductie van deze techniek. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; In dit artikel laten we zien de mogelijkheden van CFIR voor nauwkeurige anatomische targeting van een focale bestraling balk. Hoewel we in eerste instantie ontwikkeld dit kleine dier straling onderzoeksplatform (SARRP) voor onze studies, andere soortgelijke apparaten zijn nu commercieel beschikbaar die vergelijkbaar-CT-geleide focale bestraling 43, 44 kunnen bereiken. Vandaar generaliseren we dit CFIR protocol met stappen die nodig zijn voor alle research platforms in plaats van die specifiek voor SARRP. De voordelen van CFIR dan eerdere benaderingen radiologische neurogenese remmen zijn dat deze techniek maakt driedimensionale volumetrische beeldbegeleiding voor lokalisatie en richten van de dosis, conforme dosis minimaliseert blootstelling aan nontargeted hersengebieden en hoge precisie balansgeometrie maakt conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. We geven een overzicht van CT-geleide beeldvorming gebruiken om de dosis te richten op een bepaalde anatomische regio, en op die manier hoe de straling te visualiserendosisverdeling direct in weefsel met behulp van immunohistochemische kleuring voor γ-H2AX, een merker van DNA dubbelstrengs breuken 35, 45-48. Het gebruik van deze benadering voor selectieve bestraling van neurogene niches belangrijke implicaties kunnen hebben in het openbaren van de functionele rol van nieuwe volwassen geboren neuronen op fysiologie en ziekte.

<table><tbody><tr><td>SARRP research platform</td><td>Xstrahl</td><td>RS225A</td><td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td></tr><tr><td>SARRP bestralingsbunker</td><td>Xstrahl</td><td></td><td>Optioneel, maar blootstelling aan straling moet worden beperkt met alternatieve loodbescherming</td></tr><tr><td>GAF chromic film</td><td>IPS</td><td>GAFchromic ETB2</td><td></td></tr><tr><td>Muis phantom</td><td>Gammex</td><td>457</td><td>Koopt 0,5 cm x 30 cm x 30 cm vaste waterblokken van Gammex en snijdt ze op de gewenste maat.</td></tr><tr><td>Muis anti-fosfo-histone H2AX Ser139 antilichaam</td><td>Millipore, Inc.</td><td>05-636</td><td>clone JBW301</td></tr><tr><td>Dieet met hoog vetgehalte voor knaagdieren</td><td>Research Diets</td><td>D12492i</td><td>60% van de calorieën als vet, voedsel moet worden bestraald</td></tr><tr><td>Isofluraange</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>0,01 M Natriumcitraat</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1,471 g natriumcitraat opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>Superfrost Plus dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>nucleaire contrakleuring</td></tr><tr><td>Monteringsmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Vectashield of Gelvatol heeft de voorkeur</td></tr></tbody></table>

functionele ondervraging van adult hypothalamus neurogenese met focal radiologische remming

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

De functionele karakterisering van volwassen geboren neuronen blijft een belangrijke uitdaging. Benaderingen van volwassen neurogenese te remmen via invasieve virale levering of transgene dieren hebben potentiële verwart dat de interpretatie van de resultaten moeilijk te maken uit deze studies. Nieuwe radiologische gereedschappen zijn in opkomst, echter, die het mogelijk maken een om niet-invasief onderzoek naar de functie van geselecteerde groepen van volwassen geboren neuronen door middel van nauwkeurige en precieze anatomische targeting in kleine dieren. Focal ioniserende straling remt de geboorte en differentiatie van nieuwe neuronen en kan targeting van specifieke neurale gebieden. Met het oog op de mogelijke functionele rol die volwassen hypothalamus neurogenese speelt in de regulatie van fysiologische processen belichten, ontwikkelden we een niet-invasieve focale bestraling techniek om de geboorte van volwassen geboren neuronen in de hypothalamus mediaan eminentie selectief remmen. We beschrijven een werkwijze voor C omputer-tomografie geleidef okale ir straling (CFIR) levering aan precieze en accurate anatomische targeting in kleine dieren mogelijk te maken. CFIR maakt gebruik van drie-dimensionale volumetrische beeldgeleiding voor lokalisatie en de gerichtheid van de stralingsdosis, minimaliseert de blootstelling aan straling te nontargeted hersengebieden, en zorgt voor conforme dosisverdeling met scherpe bundel grenzen. Dit protocol maakt het mogelijk om vragen met betrekking tot de functie van volwassen geboren neuronen vragen, maar opent ook gebieden op vragen op het gebied van radiobiologie, tumor biologie en immunologie. Deze radiologische instrumenten zal de vertaling van de ontdekkingen op de bank te vergemakkelijken aan het bed.

Het beoordelen van CT-geleide targeting en nauwkeurigheid De mechanische kalibratie van het systeem is essentieel voor dat bundels vanuit verschillende invalshoeken alle kruisen in een punt. Kalibratie werd uitgevoerd met een semi-automatische imaging gebaseerde methode, waarbij end-to-end nauwkeurigheid uitlijning werd gemeten als 0,2 mm 29. Deze nauwkeurigheid is zeer kritisch als het volume van de hypothalamus mediaan eminentie structuur is klein 2. Om deze kalibratie t...

De functie van zoogdieren neuronen-volwassene geboren blijft een actief gebied van onderzoek. Ioniserende straling remt de geboorte van nieuwe neuronen. Met computer-tomografie geleide focale bestraling (CFIR), kunnen driedimensionale anatomische targeting van specifieke neurale populaties nu worden gebruikt om de functionele rol van volwassen neurogenese beoordelen.

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een geavanceerde radiologische techniek, waarmee focale bestraling van kleine diermodellen kan worden uitgevoerd om vervolgens de proliferatie met anatomisch specifieke resolutie te remmen. Dit wordt bereikt door eerst computertomografie-gestuurde driedimensionale volumetrische beeldvorming toe te passen voor de lokalisatie van het interessegebied. De tweede stap van de procedure is het berekenen van de toediening en de duur van de radiologische behandeling van het interessegebied.De derde stap is het uitvoeren van een filmgebaseerde kalibratie voor de stralingsdosis. De laatste stap is het bepalen van de nauwkeurigheid van de stralingsbundel door directe visualisatie van de stralingsbundel in het weefsel. Uiteindelijk kunnen de resultaten van deze studies de potentiële functionele rol van geselecteerde prolifererende neurogene progenitorpopulaties aantonen door middel van post-behandelingsanalyse van de fysiologie en het gedrag.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het onderdrukken van neurogenese, zoals brede bestraling van de hersenen, is dat hierbij stralingsbundels met een diameter van slechts 0,5 millimeter worden gebruikt om specifieke neurogeneratieve populaties te targeten. Hierdoor kunnen gedragsmatige of fysiologische defecten ondubbelzinnig worden gekoppeld aan de specifieke functies van neurogeneratieve populaties. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor de opstelling van de stralingsbundel aanvankelijk moeilijk aan te leren zijn vanwege de talrijke stappen die komen kijken bij het gebruik van zowel de hardware als de software voor prop-lokalisatie en dosering. Bereid een ISO-isofluraan gasanesthesiekamer voor en plaats vervolgens één muis in de kamer.Bereid gelijktijdig een warmtemat voor op de lage stand voor de nazorg van het dier. Wanneer de muis niet langer reageert op compressie van de voetzool, breng het dier dan naar het radiologische platform en plaats het op de immobilisatiebed van de robotpodium. Plaats de snuit in de neusconus van de anesthesiebeker en de tanden in de bijtplaat.Leg de muis plat op de immobilisatiebank. Als de muis niet reageert, fixeer deze dan met gaastape. Zorg ervoor dat de kop in een horizontaal vlak ligt door aan de oren omhoog te trekken.Zodra de muis in de juiste positie is, sluit u het loodafscherm. Voer nu een computertomografiescan uit met de ingebouwde software van het radiologische platform om op basis van de beelden een driedimensionale anatomische structurele scan van de muis te verkrijgen. Controleer of de kop waterpas is ten opzichte van het horizontale vlak.Zo niet, blijf de kop van de muis aanpassen totdat dit wel het geval is. Identificeer nu de ROI op basis van de CT-beelden om de ventrale basale hypothalamus te visualiseren met CT-beeldvorming. Bedien de röntgenbuis zoals vermeld.Bereken de afstand van de ROI tot het oppervlak van de schedel met een hoek van 45 graden ten opzichte van het horizontale vlak. Maak met de ingebouwde software een röntgenfoto van de muis vanuit een bovenaanzicht. Verwijder vervolgens de muis van het radiologische platform.Plaats het op het warmtekussen en monitor het totdat het actief is. Bereken aan de hand van de coronale CT-beelden de gemiddelde anatomische diepte van de ROI bij ten minste drie muizen om de dosering voor toediening te bepalen. Als voorbeeld uit een eerdere studie waarbij 10 gray I-straling werd toegediend aan de ventrale basale hypothalamus, is de diepte van de ROI vanaf de schedel onder een hoek van 45 graden 0,66 centimeters.Zodra de waarde bekend is, gebruikt u dosisplanningssoftware om de juiste rotatie, snelheid en behandelingsduur te berekenen voor de gewenste dosis in de ROI. Meet vervolgens de dosisverdelingen van de berekende parameters. Plaats drie GAF chromische stralingsgevoelige films in een water-equivalent plastic muismodel.Positioneer deze tussen vier verticaal gestapelde water-equivalente plastic blokken. Plaats de mock-muis op de robottafel en start de focale bestralingsbundel met de nieuw berekende parameters. In dit voorbeeld wordt een stralingsdosis van 10 Gy aan de ventrale basale hypothalamus getest. Controleer na de bestraling het patroon en de intensiteit van de dosis op de films voor een rotatie van 360 graden, waarbij de cone beam is gericht op de ventrale basale hypothalamus.Straling veroorzaakt een donkere ring in de film boven het ISO-centrum, een kleine scherpe stip op de film in het ISO-centrum en een lichtere ring in de film eronder. Het ISO-centrum van de GA FCH Chromic-film wordt nu over de röntgenstralen gelegd. Het bestraalde brandpunt in het ISO-centrum moet later overlappen met de gewenste ROI.De nauwkeurigheid van de bestralingsbundel kan in het weefsel worden beoordeeld door een marker voor dubbelstrengse DNA-breuken te visualiseren. Wanneer de kalibratie en targeting van de bestralingsbundel naar tevredenheid zijn verlopen, kan men overgaan tot het experiment. In dit voorbeeld kregen vijf weken oude vrouwelijke C 57 black six J muizen gedurende één week vóór de behandeling een vetrijk dieet.De dag voor de behandeling werden de muizen gewogen en verdeeld over twee cohorten, waarbij geen significant verschil in gewicht tussen de cohorten bestond. Op de dag van de behandeling werden de muizen opnieuw gewogen en vervolgens voorzichtig naar het radiologische platform getransporteerd, waarna twee muizen werden geanestheseerd: één in de experimentele groep en één in de controlegroep. Stel daarnaast de warmtemat in op de lage stand voor de postoperatieve behandeling.Bereid de muis voor om bestraling te ontvangen zoals eerder beschreven. Terwijl de behandeling plaatsvindt, wordt de sham-muis in de anesthesiekamer nabij het CFIR-platform gehouden, zodat eventuele effecten van omgevingsstraling worden meegerekend. Nadat het doelwit op de ct is geïdentificeerd, wordt het muisonderwerp onder robotische besturing verplaatst om het doelwit uit te lijnen met de bundel.Voer vervolgens de berekende dosisinstelling in en dien de bestraling toe. Plaats na de bestraling beide muizen op het warmtekussen en houd ze in de gaten totdat ze wakker worden. Nadat alle muizen zijn bestraald, worden ze dagelijks gemonitord en twee keer per week gewogen.Drie dagen na de behandeling. Om de bestraling te bevestigen, worden een maand later intraperitoneale injecties van BRDU toegediend. Neurogenese wordt geïdentificeerd in cellen met BRDU en een neuronale marker. Dosidistributies werden gemeten met GAF chromic.Stralingsgevoelige films ingebed in een imitatiemuis. De stralingsbundel had een halve maximale breedte (FWHM) van 2,31 millimeter. De brandpuntsbundel demonstreert de precieze uitlijning van bundels vanuit verschillende richtingen.Deze film kan over een röntgenfoto van het werkelijke muisproefdier worden gelegd om de positie en precisie van de bundel aan te tonen. Mocht de targeting van de ROI op basis van de anatomische herkenningspunten onvoldoende zijn, dan kan een intrathecale injectie van jodiumcontrast worden gebruikt om de targeting te verbeteren. De laterale en derde ventrikels zijn duidelijk gevisualiseerd in CT-scans die zijn verkregen op het A-C-F-I-R radiologische platform om de CT-gestuurde targeting van de hypothalamus verder te bevestigen.De locatie van de bundel in het weefsel werd gevisualiseerd aan de hand van de resulterende dubbelstrengs DNA-breuken; gamma H2A x-kleuring toonde een nauwkeurige targeting aan met een uiterst scherpe rand van de bundel. De stereotactische boogbehandeling, bestaande uit een boog van 45 graden ten opzichte van de verticale as, targette effectief de ventrale basale hypothalamus zonder andere neurogene niches te bestralen.Het effect van bestraling op neurogenese werd onderzocht bij volwassen muizen gevoed met een vetrijk dieet. Er was een inhibitie van de neurogenese van ongeveer 85% in vergelijking met schijnbehandelde controles. Daarentegen was er in een aangrenzende structuur aan de rand van de bestralingsplaats geen statistisch significant verschil tussen de bestraalde dieren en de schijncontroles.Bestraalde muizen die vóór de behandeling een vetrijk dieet kregen, vertoonden een afname in gewichtstoename na de behandeling in vergelijking met de schijnbehandelde groep. In contrast hiermee vertoonden controlemuizen die standaardvoer kregen, welke significant lagere niveaus van me neurogenesis hadden dan hun tegenhangers met een vetrijk dieet, geen significant verschil in gewicht tussen de schijnbehandelde en de bestraalde groepen. Bovendien gaat deze verminderde gewichtstoename bij bestraalde muizen met een vetrijk dieet gepaard met veranderingen in het metabolisme en de activiteit zodra dit is beheerst.Deze techniek kan in ongeveer 15 minuten per muis worden uitgevoerd als dit correct wordt gedaan. Vergeet niet dat werken met straling uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van loden afscherming, stralingsdetectoren en een passende training in het gebruik van straling altijd moeten worden getroffen vóór en tijdens het uitvoeren van deze procedure.

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video illustrates an immunofluorescence staining method used to examine neurogenesis in the adult hippocampus. Initially, a mouse brain section undergoes treatment with primary antibodies directed at marker proteins associated with neurogenesis in neuronal progenitor cells. Next, it is labeled with secondary antibodies tagged with fluorophores. The brain section is then observed under a confocal microscope to distinguish various subtypes of progenitor cells, based on the expression patterns...

An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

De activiteit van enige neuronen uit-volwassen leeftijd muizen kunnen worden bestudeerd door te distantiëren neuronen uit specifieke gebieden van de hersenen en het gebruik van fluorescerende membraanpotentiaal kleurstof beeldvorming. Door het testen respons op veranderingen in glucose, kan deze techniek worden gebruikt om de glucose gevoeligheid van volwassen ventromediale hypothalamus neuronen te bestuderen.

Membraanpotentiaal Dye beeldvorming van ventromedial hypothalamus neuronen van volwassen muizen om te studeren Glucose Sensing

Werkwijzen voor de manipulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke volwassen hippocampus neurogenese beschreven. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor een dentate gyrus-afhankelijke gedragstest (genoemd het ruimtelijk patroon scheiding-Barnes doolhof) voor het onderzoek naar cognitieve uitkomst bij muizen. Deze techniek moet ook helpen onderzoek mogelijk te maken in andere experimentele instellingen.

Methoden voor de modulatie en analyse van NF-kB-afhankelijke Adult Neurogenese

Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Dit protocol laat zien hoe u een betrouwbare HFS-methode in muizen. Neuronen in de hippocampal getand gyrus zijn elektrisch gestimuleerd door HFS direct en niet indirect in vivo. Neuronale activiteit en moleculaire signalering zijn onderzocht door c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring, respectievelijk; neurogenese wordt gekwantificeerd door bromodeoxyuridine labeling assay.

Een invasieve methode voor de activatie van de muis getand Gyrus door hoogfrequente stimulatie

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.

Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om specifieke hypothalamische celsubtypen in cultuur te laten groeien. De cellen kunnen worden geselecteerd op basis van opportune / unieke membraanmarkers en worden gebruikt in vele toepassingen, waaronder immunofluorescentie, elektrofysiologische en biochemische assays.

Isolatie van gerichte hypothalamus neuronen voor studies van hormonale, metabole en elektrische regulatie

Leer een geavanceerde radiologische techniek voor focale bestraling op kleine diermodellen om neurogenese te remmen. Deze methode gebruikt CT-geleide driedimensionale beeldvorming voor nauwkeurige lokalisatie van neurale progenitorpopulaties.

Functionele Ondervraging van Adult hypothalamus Neurogenese met Focal Radiologische Remming

Meer video's verkennen