Name: Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Leer hoe je reactive oxygen species (ROS) detecteert en kwantificeert in amoebe-modellen met behulp van live microscopie en fluorescentie-assays. Deze methoden bieden zowel kwalitatieve als kwantitatieve inzichten in oxidatieve stress.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor Drs Karl-Heinz Krause en Vincent Jaquet voor hulp en advies voor het opzetten van deze protocollen, en ook dank Christoph Bauer en Jerôme Bosset uit de Bioimaging Platform van het NCCR en Dr Navin Gopaldass voor hun technische ondersteuning. Het onderzoek wordt ondersteund door een Prodoc toekenning van de Zwitserse National Science Foundation.

1. Visualisatie en kwalitatieve meting van ROS productie in fagosomen De OBG-gecoate kralen moeten worden voorbereid op voorhand. De kralen coating procedures en agar overlay techniek worden aangepast uit gepubliceerde referenties 5,14. <ol><li> Voeg 1 ml suspensie van 3,0 urn gecarboxyleerde silicapareltjes (ongeveer 1,8 x 10 9 kralen) in een 1,5 ml buis, was de kralen 3x met 1 ml PBS met snelle rotatie en vortexen. </li><li> Resuspendeer de kralen in 1 ml PBS dat 25 mg / ml cyaanamide (de gecarboxyleerde siliciumoxideparels activeren covalent binden prelabeled BSA), incubeer op een wiel voor 15 minuten. </li><li> Was 3x met 1 ml koppelingsbuffer (0,1 M natriumboraat, pH 8,0) bij snelle rotatie (centrifugeer op volle snelheid in een tafelblad centrifuge mini voor 5 seconden of alternatief centrifugeer bij 2000 xg gedurende 1 min in een tafelblad centrifuge) en vortexen om overtollig cyaanamide verwijderen. </li><li> Meng de gewassen kralen met 500 pi van coupling buffer met 1 mg OxyBurst Groen (OBG) H2HFF (dihydro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA, vul de buis met stikstofgas uit een standaard gas-kan voordat aftopping, en incubeer op een wiel 14 uur (gedurende de nacht) bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de beads 2x met 1 ml quenching buffer (250 mM glycine in PBS) ongereageerd OBG verwijderen en tweemaal met koppelingsbuffer de quenching buffer verwijderen door snelle draai en vortexen. </li><li> Voeg 1 ml koppeling buffer die 50 ug van Alexa Fluor 594 succinimidylester te conjugeren aan BSA. De buis wordt met stikstof vóór afdekken en incubeer op een wiel gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Was de kralen 3x met 1 ml blussen buffer door een snelle spin en vortexen om de reactie te stoppen, dan was de kralen 3x met 1 ml PBS door snelle draai en vortexen. </li><li> Tenslotte resuspendeer de kralen in 1 ml PBS met 2 ui 10% w / v azide voor langdurige opslag. Meet de concentration kralen in de suspensie met een hemocytometer (gewoonlijk ongeveer 1-2 x 10 9 kralen / ml), vul de buis met stikstof vóór afdekken en bewaar bij 4 ° C in het donker. </li><li> De coating efficiëntie van de OBG fluoresceïne kan worden getest door het controleren van de emissiespectrum met excitatie bij 500 nm. Als geoxideerd met H 2 O 2 in aanwezigheid van mierikswortelperoxidase (HRP), de fluorescentie-intensiteit van geoxideerde parels op emissie piek (538 nm) is 11-12x hoger dan nonoxidized beklede kralen. </li><li> Harvest exponentieel groeiende Dictyosteliumcellen cellen van een 10 cm petrischaal, plaat verschillende dichtheden van cellen op 3 cm schalen met een optisch doorzichtige plastic of glazen bodem, en groeien ze &#39;s nachts. Kies de gerechten die zijn ongeveer 80% samenvloeiing voor het experiment. Een gedetailleerd protocol voor het kweken Dictyostelium cellen is gepubliceerd 15. </li><li> Vervang het kweekmedium met LoFlo medium (LF medium), incubeer gedurende2 uur voor het experiment om de extracellulaire en intraendosomal autofluorescentie van het HL5C kweekmedium verlagen. </li><li> Tegelijkertijd smelt 10 ml 1,5% Bacto agar in LF medium, giet de agar op een vlak oppervlak (bijvoorbeeld een glasplaat van 10 cm x 10 cm) om een agar-laag ongeveer 1 mm dik te vormen, wacht 10-15 min. stollen. Snijd de agar laag in 2 cm x 2 cm pleinen en plaats in LF medium voor later gebruik. </li><li> Ondertussen bereiden de draaiende schijf of brede veld microscoop, stel de temperatuur van de klimaatkamer bij 22 ° C en de instellingen voor dit experiment aan te passen. (Zie aanvullende opmerkingen in de discussie). </li><li> Na 2 uur incubatie, zuigen de LF medium van 3 cm schaal, maar de cel monolaag moet nog worden bedekt met een dunne film drager. Verdun de beklede parels 1,5 x 10 7 kralen / ml en voeg 10 ul op de cellaag. </li><li> Neem een ​​vierkante agar plaat, afvoer overtollige vloeistof, maar houden nat. Voorzichtig zet the agar vierkant bovenop de cellaag. Verplaats de agar plein als het ligt op de cellen. De agar overlay wordt gebruikt om contact tussen korrels en cellen verhogen, waardoor opname verbeteren, en ook enigszins comprimeert de cellen, waardoor ze beter in het brandvlak van het objectief. </li><li> Plaats het deksel op de schotel, plaats het op de microscoop podium, en automatisch foto&#39;s te nemen in de rode, groene en fase kanalen om de 1 min gedurende 2 uur of langer. </li><li> Selecteer en zich richten op cellulaire gebeurtenissen die het hele proces van fagocytose bevatten. Voeg de geoptimaliseerde 3 kanalen en monteren de beelden in een film met behulp van professionele software voor beeldverwerking. Kwantificeren fluorescentie-intensiteiten van elke geselecteerde kralen in de kleuren rood en groen kanalen, en de verhouding van groen / rood zal de dynamische phagosomal ROS productie van de cellen weerspiegelen. </li></ol> 2. Kwantitatieve en Medium-throughput meting van intracellulaire superoxideproductie <ol><li> Verzamelen one 80% samenvloeiing schotel van Dictyosteliumcellen in 10 ml HL5C medium. Centrifugeer Dictyostelium cellen bij 850 g gedurende 5 minuten, zorgvuldig en volledig zuig overtollige medium. Resuspendeer cellen in SS6.4 buffer [0,12 M sorbitol in Sorensen buffer (14.69 mM KH 2 PO 4 en 6,27 mM Na 2 HPO 4), pH 6,4], tellen cellen en verdund tot een uiteindelijke dichtheid van 6 x 10 6 cellen / ml (zie aanvullende opmerkingen in de discussie). </li><li> Voeg 50 ul van celsuspensie in elk putje van een witte ondoorzichtige plaat met 96 (zie aanvullende opmerkingen in de discussie). </li><li> Verdunnen DHE voorraad (30 mM in DMSO) 500 maal met SS6.4, pipet 50 pi verdund DHE in elk putje met een meerkanaalspipet indien nodig. De eindconcentratie van DHE 30 uM. De reactie start onmiddellijk. </li><li> Stimuli of remmers kunnen worden toegevoegd op dit punt, of op andere tijdstippen volgens specifieke behoeften. </li><li> Gebruik het eindpunt &quot;top lezen &amp; #34, modus van een fluorescentie microplaat lezer met fluorescentie-excitatie / emissie bij 522 nm/605 nm, om de 2 min gedurende 1 uur, gemiddeld 5 sec schudden / min, bij 22 ° C. </li></ol> 3. Kwantitatieve en High Throughput Meting van extracellulaire H 2 O 2 Productie <ol><li> Volg dezelfde stappen zoals beschreven in 2.1 en 2.2. </li><li> Bereid verdund HRP door toevoeging van 5 ul van HRP voorraad (100 E / ml in gedestilleerd water) in 10 ml SS6.4, vortex of keren de buis goed te mengen en te houden op ijs voor later gebruik. De verdunde HRP oplossing is 0,05 U / ml. </li><li> AUR reactiemengsel bereid door de AUR voorraad (10 mM in DMSO AUR) en verdunde HRP oplossing in SS6.4 buffer om de eindconcentraties van 6,25 uM, en 0,005 U / ml. Als voorbeeld, aan het reactiemengsel bereiden 40 reacties, meng 1600 gl SS6.4 met 400 gl verdunde HRP en 2,5 ul van AUR voorraadoplossing. </li><li> Voeg 50 ul van AUR mixtuur in elk putje met een meerkanaalspipet indien nodig. Nu start de reactie. </li><li> Stimuli of remmers kunnen worden toegevoegd op dit punt, of op andere tijdstippen volgens specifieke behoeften. </li><li> Gebruik het eindpunt &quot;top lezing&quot; modus van een fluorescentie microplaat lezer met fluorescentie-excitatie / emissie bij 530 nm/590 nm, om de 2 min gedurende 1 uur, gemiddeld 5 sec schudden / min, bij 22 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Vergeleken met de eerder beschreven werkwijzen, OBG test dynamisch visualiseert de werkwijze phagosomal ROS generatie op enkele cel, in plaats van het meten van een gemiddelde ROS signaal van een populatie cellen. Dergelijke populatie-gemiddelde methoden zijn vaak kritische informatie veroorzaakt door nonsynchronous fagocytose verduisteren. Wij hebben met succes DHE en AUR assays aangepast aan Dictyosteliumcellen en geoptimaliseerd de protocollen. Belangrijker nog, we aangegeven de soorten en de subcellulaire l...

Reactieve zuurstof species (ROS) zijn betrokken bij vele verschillende biologische processen zoals afweer, signalering, weefselontwikkeling en reactie op letsel en hypertensie en kanker. De goed bestudeerde phagosomal NADPH oxidase machines is gewijd aan snelle ROS generatie, bekend als de oxidatieve burst, om bacteriën ingenomen in phagosomes neutrofielen &#39;1 doden. Bovendien werd lekkage van elektronen als een bijproduct van de mitochondriale ademhalingsketen eerder gedacht alleen verantwoordelijk voor een ongereguleerde bron van ROS zijn. Maar onlangs werd geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme bijdragen aan intraphagosomal doden van bacteriën in muizen macrofagen 2. In de afgelopen jaren, heeft de sociale amoebe, Dictyosteliumcellen, uitgegroeid tot een krachtige en populaire model naar cel intrinsieke mechanismen van de aangeboren immuunrespons bestuderen. Inderdaad, Dictyostelium en menselijke fagocyten delen een verrassend hoog niveau van instandhouding in molecular machines die verantwoordelijk zijn voor bacteriën sensing, afblazen en het doden van 3,4. De homologen van de eiwitten en enzymen betrekking tot ROS productie of detoxificatie, zoals NADPH oxidase, katalase, superoxide dismutase, kan worden gevonden in menselijke en Dictyostelium. Zoals de best bestudeerde amoebe, Dictyostelium presenteert een aantal unieke voordelen ten opzichte van zoogdieren modelsysteem. Ze groeien bij kamertemperatuur zonder de noodzaak van CO2 met een verdubbelingstijd van 8-10 uur. Ze kunnen gemakkelijk worden bewaard als hechtende of opschorting culturen. Bovendien, dankzij hun volledig gesequenced en geannoteerd haploïde genoom, en gemakkelijk genetische manipulatie, Dictyosteliumcellen is uitgegroeid tot een zeer aantrekkelijke experimenteel model organisme. In vorige studies, verschillende gechloreerde en gefluoreerde derivaten van fluoresceïne (gezamenlijk bekend als OxyBurst Green, OBG) die fluorescentie uitzenden na oxidatie door ROS, zijn gebruikt als ROS reporter. Cel-doordringende esterified derivaten worden gebruikt om cytoplasmatische ROS te meten, terwijl cel-impermeant dextran-of-eiwit-gekoppelde derivaten worden gebruikt om extracellulaire ROS te meten. Met name OBG BSA-beklede parels reeds gebruikt phagosomal ROS productie detecteren in zoogdiercellen 5. Echter, de microplaat-lezer aanpak geven slechts een gemiddelde ROS generatie curve uit een populatie van cellen. Met het huidige protocol, met behulp Dictyosteliumcellen, een professioneel fagocyt, en geoptimaliseerd experimentele omstandigheden, stabiel en efficiënt fagocytose krijgen we zonder het vervoegen enige opsonine op de parels. DHE is gebruikt in verschillende modelsystemen, zoals zoogdieren neutrofielen en macrofagen, de productie van ROS 6-9 detecteren. Inmiddels zijn er enkele controverse over de specificiteit en gevoeligheid van de methode 8,10. Een verbeterde versie van Amplex Red, de fluorescentie-intensiteit van AUR minder gevoelig voor pH, waardoor het geschikt is om te meten maaktROS in nonneutral of zwak zure milieus. AUR is onlangs toegepast op verschillende zoogdiersystemen 11,12, maar het gebruik ervan in nonmammalian modellen, die vaak nodig zwak zure groeimedia, nog niet gerapporteerd. Daarnaast is er geen gepubliceerde protocol om kwantitatief en dynamisch meten ROS productie en lokalisatie in de sociale amoebe Dictyostelium. Het doel van de gepresenteerde set protocollen is om een ​​gemakkelijke en veelzijdige oplossing te controleren verschillende ROS en hun lokalisatie, en verder geven inzicht in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Voor de OBG test gebruikte we live microscopie om het hele proces van phagosomal ROS generatie na opname van OBG-gecoate kralen door Dictyosteliumcellen cellen bewaken, en voorzien van een nieuwe benadering van het mechanisme van intraphagosomal doden van bacteriën te bestuderen. We hebben midden-throughput DHE en AUR assays geoptimaliseerd Dictyostelium, intracellulaire Superox metenide en extracellulaire H 2 O 2 productie, respectievelijk door LPS als een krachtige stimulator ROS. Merk op dat LPS onlangs werd aangetoond dat de bactericide activiteit van Dictyosteliumcellen richting gefagocyteerd bacteriën 13 te verhogen. Daarnaast is de behandeling met DEDTC en catalase uitdrukkelijk bevestigd dat deze twee methoden specifiek meten verschillende soorten en subcellulaire lokalisatie van ROS in Dictyostelium. Tenslotte kan de OBG assay worden aangepast aan elke hechtende fagocytische cellen, door verdere opsoniserende de bolletjes met liganden voor receptoren van dierlijke fagocytische cellen. In principe kan de DHE en AUR assays ook worden afgesteld voor metingen in alle aanhangend of nonadherent cel onder geschikte experimentele omstandigheden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Green H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylated silica beads</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C medium</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Diethyldithiocarbamate (DEDTC)</td><td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cyanamide</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>ibidi &mu;-Dish 35 mm, high</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Bottom made of optically clear plastic</td></tr><tr><td>MatTek dish 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Bottom made of a glass coverslip</td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>White 96 well plate</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

opsporen, visualiseren en kwantificeren van de generatie van reactive oxygen species in een amoeba model systeem

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) bestaan ​​uit een reeks van reactief en kortstondige, zuurstofhoudende moleculen, die dynamisch worden interconverted of hetzij katalytisch of spontaan geëlimineerd. Door de korte levensduur van de meeste ROS en de diversiteit van hun bronnen en subcellulaire lokalisaties, kan een volledig beeld worden alleen verkregen door zorgvuldige metingen met behulp van een combinatie van protocollen. Hier presenteren we een set van drie verschillende protocollen gebruiken OxyBurst Groen (OBG)-gecoate kralen, of dihydroethidium (DHE) en Amplex Ultrared (AUR), kwalitatief en kwantitatief te monitoren verschillende ROS in professionele fagocyten zoals Dictyostelium. We geoptimaliseerd de kralen coating procedures en gebruikte OBG-gecoate kralen en live microscopie om dynamisch visualiseren intraphagosomal ROS generatie op de enkele cel niveau. Wij identificeerden lipopolysaccharide (LPS) van E. coli als een krachtige stimulator voor ROS generatie in Dictyostelium. Daarnaast hebben we developed real-time, het midden-throughput testen in DHE en AUR om kwantitatief te meten intracellulaire superoxide en extracellulaire H 2 O 2-productie, respectievelijk.

De generatie van ROS in phagosomes kan kwalitatief en dynamisch worden gevisualiseerd door microscopie (File S1). De rode fluorescentie uitgezonden door Alexa fluor 594 is pH-ongevoelig en blijft constant in de phagosomal milieu, terwijl de oxidatie van OBG verhoogt de fluorescentie in het groene kanaal. De emissiespectra van in vitro geoxideerd en nonoxidized OBG-gecoate korrels worden vergeleken in Figuur 1B, die een significante toename in intensiteit na oxidatie. Om visuali...

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden voor het monitoren van verschillende reactieve zuurstofcomponenten of ROS en hun lokalisatie, en om verdere inzichten te verschaffen in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Dit wordt bereikt door drie verschillende assays uit te voeren, waarvan de eerste gebruikmaakt van RST green of OB G-gecoate beads en live microscopy; ob g fluorescein en Alexa Fluor 594 zijn covalent gekoppeld aan het oppervlak van drie microns silica-beads via BSA.De fluorescentie-emissie van OBG-fluoresceïne duidt op oxidatie door ROS, terwijl het signaal van Alexa Fluor 594 helpt bij het lokaliseren van de beads en dient als controle voor de kwantificering van de fluorescentie. De tweede methode maakt gebruik van de superoxide-gevoelige probe dihydro-ethidium of DHE in een assay op basis van een plaatlezer. Als gevolg van oxidatie door superoxide is ethidium in staat om te intercaleren in nucleair en mitochondriaal DNA en vertoont het verschoven excitatie- en emissiepieken bij respectievelijk 522 nanometers en 605 nanometers.De fluorescentie-intensiteit van AUM komt overeen met de hoeveelheid superoxideproductie, waardoor kwantitatieve meting van de intracellulaire superoxidegeneratie in de cellen mogelijk is. De derde methode is eveneens een assay op basis van een platenlezer. De waterstofperoxide-gevoelige probe plex ultra red of a UR wordt gebruikt om de extracellulaire waterstofperoxideproductie kwantitatief te meten.De fluorescentie-intensiteit van een UR OX komt overeen met de hoeveelheid waterstofperoxide die buiten de cellen wordt geproduceerd. Er worden resultaten verkregen die de lokalisatie van dynamische ROS-generatie aantonen op basis van de O-B-G-D-H-E en UR assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals plate rate-gebaseerde OB GSAs, is dat het de Al Roth-generatie dynamisch visualiseert op het niveau van individuele cellen.In plaats van het spiegelen en middelen van het Roth-signaal van een celpopulatie. Dergelijke methoden voor populatiemiddeling hebben de neiging om kritieke informatie te maskeren vanwege niet-synchrone fagocytose. Om te beginnen met de procedure voor het coderen van beads met oxy, Burt Green of OBG, voegt u één milliliter van een suspensie van 3,0 micron carboxylated silica beads toe aan een 1,5 milliliter buisje.Centrifugeer de buis en verwijder snel het supernatant. Voeg 1 mL PBS toe en vortex op deze wijze. Was de beads drie keer met PBS.Verwijder na de derde wasbeurt het supernatant en resuspendeer de beads. In 1 mL PBS met 25 mg/mL cyanide, waarbij de cyanide-oplossing telkens vers voor gebruik moet worden bereid, incuberen op een rotor voor 15 minuten. Dit activeert de gecarboxyleerde silica-beads om pre-gelabelde BSA covalent te binden; centrifugeer de buis na 15 minuten en verwijder het supernatant.Voeg één milliliter koppelingsbuffer toe en vortex was drie keer met koppelingsbuffer door middel van een korte centrifugatie en vortexen om overtollig cyanide te verwijderen, meng de gewassen kralen met 500 microliters koppelingsbuffer die één milligram OBGH twee H-F-F-B-S-A bevat en vul de buis vervolgens met stikstofgas uit een standaard gasbus. Na het afsluiten van de buis wordt deze 14 uur geïncubeerd op een rotatiewiel bij kamertemperatuur in het donker; quench de volgende dag niet-reactief OBG door de kralen tweemaal te wassen met één milliliter quenchbuffer via een korte centrifugatie en vortexen, en was vervolgens tweemaal met koppelingsbuffer om de quenchbuffer te verwijderen. Na verwijdering van het supernatant wordt één milliliter koppelingsbuffer toegevoegd die 50 micrograms LOR 594 cin a middle ester bevat om te conjugeren aan BSA.Vul de buis met een stikstofdop en incubeer deze gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in het donker op een rotatiewiel. Stop na de incubatie van 1,5 uur de reactie door de beads drie keer te wassen met 1 milliliter quenchbuffer. Was de beads vervolgens drie keer met 1 milliliter PBS.Ten slotte, Ray, suspendeer de beads in één milliliter PBS met twee microliters 10% gewicht per volume azid voor langdurige bewaring. Meet de concentratie beads in de suspensie met een hemocytometer; deze is doorgaans één tot twee keer 10⁹ beads per milliliter.Vul de buis, sluit deze af met een stikstofkap en bewaar deze bij vier graden Celsius in het donker. Start deze procedure door exponentieel groeiende aliumcellen te oogsten van een Petri-schaal van 10 centimeter. Verdeel verschillende celdichtheden op schaaltjes van drie centimeter met een optisch heldere plastic of glazen bodem en kweek deze overnacht tot de volgende ochtend.Kies de schalen die ongeveer 80% confluent zijn voor gebruik in het experiment. Vervang het kweekmedium door medium met een lage flow of LF-medium en incubeer twee uur voor het experiment om de extracellulaire en intra-endosomale autofluorescentie van het HL-5C kweekmedium te verminderen. Smelt 10 milliliter 1,5% BDO-agar in LF-medium en giet de agar op een vlak oppervlak om een agarlagen van ongeveer één millimeter dik te vormen.Wacht 10 tot 15 minuten tot de agar is gestold. Snijd de agarlagen in vierkanten van twee bij twee centimeter en plaats deze in LF-medium voor later gebruik. Stel de widefield-microscoop in.Stel de temperatuur van de klimaatkamer in op 22 °C en pas de instellingen aan die nodig zijn voor het experiment. Na twee uur incubatie wordt het LF-medium uit de schaal van drie centimeter afgezogen, waarbij de cellaag bedekt blijft met een dunne laag medium. Verdun de eerder bereide OBG-gecoate beads tot 1,5 × 10⁷ beads per ml en voeg 10 µL toe aan de cellaag.Neem één vierkant agarlamellaat en laat eventueel overtollige vloeistof weglopen, maar houd de agar nat. Plaats het agarvierkant voorzichtig bovenop de cellaag. De agar-overlay vergroot het contact tussen de beads en de cellen, waardoor de opname wordt verbeterd.Het comprimeert de cellen ook enigszins, waardoor ze beter in het brandvlak van het objectief blijven. Plaats voor het succes van het experiment het deksel op de schaal. Verplaats de AGA-overlay niet wanneer deze de cellen bedekt; bovendien is het essentieel om direct met de beeldvormingsstap te beginnen.Plaats vervolgens de schaal op de objecttafel van de microscoop en neem automatisch elke minuut beelden op in de rode, groene en fasecontrastkanalen gedurende twee uur of langer. Om de ROS-productie te meten, selecteert u cellulaire gebeurtenissen die het volledige proces van fagocytose bevatten en stelt u hierop scherp. Voeg met behulp van professionele beeldbewerkingssoftware de drie geoptimaliseerde kanalen samen en monteer de beelden tot een film.Kwantificeer de fluorescentie-intensiteiten van elk van de geselecteerde beads in de rode en groene kanalen. De ratio van rood ten opzichte van groen weerspiegelt de dynamische FOMO R os-productie van de cellen. Om eerst de intracellulaire superoxide-productie te meten, oogst een 80%confluent schaaltje alium in 10 milliliters HL five C medium, centrifugeer vervolgens de alium-cellen bij 850 ×g gedurende vijf minuten en aspireer het medium zorgvuldig en volledig; resuspendeer de cellen in SS 6.4 buffer, tel de cellen en verdun deze tot een uiteindelijke dichtheid van 6 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg 50 µL cel-suspensie toe aan elke put van een witte, niet-transparante 96-wells plaat. Verdun de dihydro ethidium (DHE) stockoplossing 500 keer met SS 6.4 buffer. Gebruik vervolgens een multichannelpipet om 50 µL van de verdunde DHE in elke put van de 96-wells plaat te dispenseren. De uiteindelijke concentratie van DHE is 30 µM.De reactie zal onmiddellijk starten. Stimuli of remmers kunnen op dit punt of op andere tijdstippen worden toegevoegd, afhankelijk van de specifieke behoeften. Incubeer de cellen met matige schudding bij 22 °C.Meet de fluorescentie elke twee minuten gedurende één uur met een fluorescentie microplaatlezer. Gebruik de endpoint top-leesmodus met fluorescentie-excitatie bij 522 nanometers en emissie bij 605 nanometers. Begin deze procedure door een 96-well plaat met dium-cellen voor te bereiden, zoals gedemonstreerd in het vorige segment.Bereid verdunde mierikswortelperoxidase of HRP door vijf µL HRP-stock toe te voegen aan 10 mL SS 6,4-buffer. Keer de buis om om goed te mengen en bewaar op ijs. De verdunde HRP-oplossing heeft een concentratie van 0,05 units per milliliter.Bereid het plex ultra red- of a UR-reactiemengsel door de a UR-stock en de verdunde HRP-oplossing te mengen in SS 6.4-buffer tot eindconcentraties van 6,25 µM a UR en 0,005 units per milliliter HRP. Voeg 50 µL van het a UR-mengsel toe aan elke well.De reactie zal onmiddellijk beginnen. Stimuli of inhibitoren kunnen op dit moment of op andere tijdstippen worden toegevoegd, afhankelijk van de specifieke behoeften. Incubeer de cellen in medium onder schudcondities bij 22 °C.Meet de fluorescentie elke twee minuten gedurende één uur met een fluorescentie microplate reader. Gebruik de endpoint top leesmodus met fluorescentie-excitatie bij 530 nanometer en emissie bij 590 nanometer. De coatingefficiëntie van de OB g fluoresceïne wordt getest door waterstofperoxide en HRP te gebruiken om de gecoate beads in vitro te oxideren en het emissiespectrum te controleren met excitatie bij 500 nanometer.Zoals in deze grafiek te zien is, vertonen de geoxideerde beads een significante emissiepiek bij 538 nanometers vergeleken met die van niet-geoxideerde beads, met een intensiteitsverhouding van ten minste 11 tot 12 keer. De generatie van ROS in fagosomen in dium-cellen kan kwalitatief en dynamisch worden gevisualiseerd via microscopie, zoals getoond in deze representatieve time-lapse movie, opgenomen gedurende 40 minuten met een zesvoudige vergroting tijdens de eerste minuut na opname. Door fagocytose veranderde de fluorescentie van OBG fluoresce-gecoate beads van rood naar helder oranje, wat aangeeft dat ROS waarschijnlijk direct binnen de fagosomen werden geproduceerd.Intracellulaire superoxide- en extracellulaire waterstofperoxideproductie worden respectievelijk kwantitatief gemeten met de DHE- en UR-assays. Er wordt een overzicht gegeven van de biochemische reacties die bij deze twee assays betrokken zijn. Superoxide wordt door superoxide-dismutase of SOD omgezet in waterstofperoxide en waterstofperoxide wordt in de DHE-assay door catalase omgezet in water en zuurstof.Een microplaatlezer wordt gebruikt voor kwantitatieve metingen van intracellulair superoxide met een gemiddelde doorvoer. Een representatief experiment laat zien dat bij stimulatie met LPSA lipopolysaccharide van e coli de dynamische superoxideproductie van AX two-cellen significant hoger is dan het basale niveau van niet-gestimuleerde AX two-cellen en de achtergrond van de reactie in buffer; de afname van blauwe fluorescentie en de toename van rode fluorescentie zijn, zoals verwacht, omgekeerd gecorreleerd.De lokalisatie van de R os-productie, gemeten met de DHE-assay, wordt bevestigd door de volgende resultaten. De toevoeging van de membraanpermeabele superoxide-dismutase-remmer D-E-D-T-C-A verhoogde het DHE-signaal op een dosisafhankelijke wijze, wat aangeeft dat D-E-D-T-C leidde tot de accumulatie van het superoxide-dismutase-substraat. Alternatief had de toevoeging van een membraan IMP waterstofperoxide-quencher geen effect op de superoxide-productie in de A UR-assay.Een microplate-lezer wordt gebruikt voor kwantitatieve metingen van de productie van extracellulair waterstofperoxide met een gemiddelde doorvoersnelheid. Een representatief experiment laat zien dat bij stimulatie met LPS de dynamische productie van waterstofperoxide uit AX two-cellen significant hoger is dan het basale niveau van niet-gestimuleerde AX two-cellen; wanneer behandeld met verschillende concentraties D-E-D-T-C of catalase, neemt het A UR-signaal dosisafhankelijk af door respectievelijk remming van de productie van waterstofperoxide uit intracellulair superoxide en uitputting van extracellulair waterstofperoxide. De behandelingen met D-E-D-T-C en catalase bevestigden expliciet dat de DHE- en A UR-assays specifiek verschillende typen en subcellulaire lokalisaties van ROS meten volgens deze procedure.Andere methoden, zoals het spiegelen van de Ross-generatie tijdens infectie met pathogene of niet-pathogene bacteriën, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop de Dictal-hengst zal reageren op verschillende bacteriële infecties in termen van generatieverlies. En vergeet niet dat werken met pathogene bacteriën, zoals microbacteria marum, uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals passende BSL-2-maatregelen, altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een efficiënte methode om inzicht te krijgen in het visualiseren van de paracriene afgeleide ROS inductie van endotheliale Ca2 + signalering wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het meten van paracriene afgeleid ROS geactiveerd Ca2 + mobilisatie in vasculaire endotheliale cellen in een co-cultuur model.

Visualisatie van vasculaire Ca 2 + Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

This video describes the technique of visualizing oxidative stress in cultured organoids. This work helps in understanding the level of oxidative stress due to ROS accumulation in the various cell types present in an organoid after treatment with different ROS modulators.

Fluorescent Probe Imaging Assay: A Technique to Visualize Oxidative Stress in the Reactive Oxygen Species Inducer-Treated Cultured Intestinal Organoid Cells

Dit manuscript beschrijft het gebruik van genetisch-gecodeerde fluorogenic verslaggevers in een toepassing voor live-cel imaging voor de behandeling van xenobioticum-geïnduceerde oxidatieve stress. Deze experimentele aanpak biedt ongeëvenaarde Spatio resolutie, gevoeligheid en specificiteit terwijl het vermijden van veel van de tekortkomingen van conventionele methoden voor de detectie van toxicologische oxidatieve stress.

Imaging benaderingen van evaluaties van toxicologische oxidatieve Stress met behulp van genetisch-gecodeerde Fluorogenic sensoren

Hier presenteren we een protocol om de totale cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (DCFH-DA). Deze methode kan cellulaire ROS lokalisatie visualiseren in aanhangende cellen met een fluorescentiemicroscoop en ros intensiteit kwantificeren met een fluorescentieplaatlezer. Dit protocol is eenvoudig, efficiënt en kosteneffectief.

Detectie van totale reactieve zuurstofsoorten in aanhangende cellen door 2',7'-Dichloododihydrofluorescein Diacetate Kleuring

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.

Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Hier stellen we een gesystematiseerd, toegankelijk en reproduceerbaar protocol voor om cellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te detecteren met behulp van 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in Müller gliacellen (MGC's). Deze methode kwantificeert de totale cellulaire ROS-niveaus met een flowcytometer. Dit protocol is zeer eenvoudig te gebruiken, geschikt en reproduceerbaar.

Kwantificering van reactieve zuurstofsoorten met behulp van 2′,7′-dichlorofluoresceïnediacetaatsonde en flowcytometrie in Müller-gliacellen

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Leer hoe je reactive oxygen species (ROS) detecteert en kwantificeert in amoebe-modellen met behulp van live microscopie en fluorescentie-assays. Deze methoden bieden zowel kwalitatieve als kwantitatieve inzichten in oxidatieve stress.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Meer video's verkennen