Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Het algemene doel van het volgende experiment is om een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden om verschillende reactieve zuurstofsoorten of ROS en hun lokalisatie te monitoren en verdere inzichten te geven in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Dit wordt bereikt door drie verschillende tests uit te voeren, waarvan de eerste gebruikmaakt van RST-groen of OB G-gecoate kralen en levende microscopie, ob g-fluoresceine en Alexa. Fluor 594 zijn covalent gekoppeld aan het oppervlak van drie micrometer sica-kralen via BSA.

De fluorescentie-emissie van de OBG-fluoresceine geeft de oxidatie door ROS aan, terwijl het signaal van Alexa Fluor 594 helpt de kralen te lokaliseren en dient als controle voor fluorescentiekwantificering. De tweede methode maakt gebruik van de superoxide-gevoelige sonde dihydro-ethidium of DHE in een plate reader-gebaseerde assay. Als gevolg van oxidatie door superoxide kan ethidium intercaleren in nucleair en mitochondriaal DNA en heeft verschoven excitatie- en emissiepiken bij respectievelijk 522 nanometer en 605 nanometer.

De fluorescentie-intensiteit van AUM komt overeen met de hoeveelheid superoxideproductie, waardoor kwantitatieve meting van intracellulaire superoxidegeneratie in de cellen mogelijk is. De derde methode is ook een plate reader-gebaseerde assay. De waterstofperoxide-gevoelige sonde plex ultra rood of een UR wordt gebruikt om kwantitatief extracellulair waterstofperoxideproductie te meten.

De fluorescentie-intensiteit van een UR OX komt overeen met de hoeveelheid waterstofperoxide geproduceerd buiten de cellen. Resultaten worden verkregen die lokalisatie van dynamische ROS-generatie tonen op basis van de O-B-G-D-H-E en een UR-assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven de andere bestaande methoden, zoals plate rate-gebaseerde OB GSA's, is dat het de Al Roth-generatie dynamisch visualiseert op het niveau van een enkele cel.

In plaats van het gemiddelde Roth-signaal van een populatie cellen te weerspiegelen. Dergelijke populatiegemiddelde methoden hebben de neiging om kritieke informatie te verduisteren als gevolg van niet-synchrone fagocytose. Om de procedure voor het coderen van kralen met oxy te beginnen, voegt u een milliliter van een suspensie van 3,0 micron gecarboxyleerde silicakralen toe aan een 1,5 milliliter buis.

Snel de buis draaien en het supernatant verwijderen. Voeg een milliliter PBS toe en vortex op deze manier. Was de kralen drie keer met PBS.

Na de derde wasbeurt, verwijder het supernatant en schud de kralen opnieuw op. In één milliliter PBS met 25 milligram per milliliter cyanide, moet de cyanideoplossing elke keer voor gebruik vers worden bereid. Incubeer gedurende 15 minuten op een wiel. Dit activeert de gecarboxyleerde silicakralen om covalent gelabelde BSA te binden. Na 15 minuten centrifugeert u de buis, verwijdert u het supernatant.

Voeg een milliliter koppelingsbuffer toe en vortex. Was drie keer met koppelingsbuffer door snel te draaien en te vortexen om overtollig cyanide te verwijderen, meng de gewassen kralen met 500 microliter koppelingsbuffer die één milligram OBGH twee H-F-F-B-S-A bevat en vul vervolgens de buis met stikstofgas uit een standaard gasbus. Na het afdekken van de buis, incubeer gedurende 14 uur op een wiel bij kamertemperatuur in het donker. Op de volgende dag, dooft u niet-reactieve OBG uit door de kralen twee keer te wassen met één milliliter doofbuffer door snel te draaien en te vortexen, vervolgens wast u twee keer met koppelingsbuffer om de doofbuffer te verwijderen. Na verwijdering van het supernatant, voegt u één milliliter koppelingsbuffer toe met 50 microgram LOR 594 cin in een middelste ester om te koppelen aan BSA.

Vul de buis met stikstofkap en incubeer gedurende 1,5 uur op een wiel bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de 1,5 uur durende incubatie, stopt u de reactie door de kralen drie keer te wassen met één milliliter doofbuffer. Dit wordt gevolgd door het wassen van de kralen drie keer met één milliliter PBS.

Ten slotte, Ray, schud de kralen op in één milliliter PBS met twee microliters 10% gewicht per volume. Azuur voor langdurige opslag. Meet de concentratie van kralen in de suspensie met een hemo cytometer, deze is typisch een tot twee keer 10 tot de negende kralen per milliliter.

Vul de buis met stikstofkap en bewaar deze op vier graden Celsius in het donker. Begin deze procedure door exponentieel groeiende aliumcellen uit een 10 centimeter petrischaal te oogsten. Verschillende dichtheden van cellen op drie centimeter schalen met een optisch heldere plastic of glazen bodem en laat ze overnacht groeien.

Kies de schalen die ongeveer 80% confluent zijn voor gebruik in het experiment. Vervang het kweekmedium met LF-medium met lage stroom en incubeer gedurende twee uur vóór het experiment om de extracellulaire en intra-endosomale autofluorescentie van het HL vijf C kweekmedium te verminderen. Smelt 10 milliliter 1,5% BDO-agar in LF-medium en giet de agar op een vlakke oppervlakte om een agarlaag van ongeveer één millimeter dikte te vormen.

Wacht 10 tot 15 minuten tot de agar gestold is. Snijd de agarlaag in twee bij twee centimeter vierkanten en plaats deze in LF-medium voor later gebruik. Repareer de widefield microscoop.

Stel de temperatuur van de omgevingskamer in op 22 graden Celsius en pas de instellingen aan die vereist zijn voor het experiment. Na twee uur incubatie, zuigt u het LF-medium uit de drie centimeter schaal, maar laat de celmonolaag bedekt door een dunne film medium. Verdun de eerder bereide OBG-gecoate kralen tot 1,5 keer 10 tot de zevende kralen per milliliter en voeg 10 microliter toe op de cellayaar.

Neem een vierkant agarblad en laat eventueel overtollig vocht weglekken, maar houd de agar nat. Leg het agarvierkant voorzichtig op de cellayaar. De agaroverlay verhoogt het contact tussen kralen en cellen, waardoor de opname wordt verbeterd.

Het comprimeert ook lichtjes de cellen, waardoor ze beter in het brandpuntsvlak van het objectief blijven. Plaats de deksel op de schaal. Voor het succes van het experiment. Beweeg de AGA-overlay