Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem
November 5th, 2013
We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een eenvoudige en veelzijdige oplossing te bieden om verschillende reactieve zuurstofsoorten of ROS en hun lokalisatie te monitoren en verdere inzichten te geven in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen. Dit wordt bereikt door drie verschillende tests uit te voeren, waarvan de eerste gebruikmaakt van RST-groen of OB G-gecoate kralen en levende microscopie, ob g-fluoresceine en Alexa. Fluor 594 zijn covalent gekoppeld aan het oppervlak van drie micrometer sica-kralen via BSA.
De fluorescentie-emissie van de OBG-fluoresceine geeft de oxidatie door ROS aan, terwijl het signaal van Alexa Fluor 594 helpt de kralen te lokaliseren en dient als controle voor fluorescentiekwantificering. De tweede methode maakt gebruik van de superoxide-gevoelige sonde dihydro-ethidium of DHE in een plate reader-gebaseerde assay. Als gevolg van oxidatie door superoxide kan ethidium intercaleren in nucleair en mitochondriaal DNA en heeft verschoven excitatie- en emissiepiken bij respectievelijk 522 nanometer en 605 nanometer.
De fluorescentie-intensiteit van AUM komt overeen met de hoeveelheid superoxideproductie, waardoor kwantitatieve meting van intracellulaire superoxidegeneratie in de cellen mogelijk is. De derde methode is ook een plate reader-gebaseerde assay. De waterstofperoxide-gevoelige sonde plex ultra rood of een UR wordt gebruikt om kwantitatief extracellulair waterstofperoxideproductie te meten.
De fluorescentie-intensiteit van een UR OX komt overeen met de hoeveelheid waterstofperoxide geproduceerd buiten de cellen. Resultaten worden verkregen die lokalisatie van dynamische ROS-generatie tonen op basis van de O-B-G-D-H-E en een UR-assays. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven de andere bestaande methoden, zoals plate rate-gebaseerde OB GSA's, is dat het de Al Roth-generatie dynamisch visualiseert op het niveau van een enkele cel.
In plaats van het gemiddelde Roth-signaal van een populatie cellen te weerspiegelen. Dergelijke populatiegemiddelde methoden hebben de neiging om kritieke informatie te verduisteren als gevolg van niet-synchrone fagocytose. Om de procedure voor het coderen van kralen met oxy te beginnen, voegt u een milliliter van een suspensie van 3,0 micron gecarboxyleerde silicakralen toe aan een 1,5 milliliter buis.
Snel de buis draaien en het supernatant verwijderen. Voeg een milliliter PBS toe en vortex op deze manier. Was de kralen drie keer met PBS.
Na de derde wasbeurt, verwijder het supernatant en schud de kralen opnieuw op. In één milliliter PBS met 25 milligram per milliliter cyanide, moet de cyanideoplossing elke keer voor gebruik vers worden bereid. Incubeer gedurende 15 minuten op een wiel. Dit activeert de gecarboxyleerde silicakralen om covalent gelabelde BSA te binden. Na 15 minuten centrifugeert u de buis, verwijdert u het supernatant.
Voeg een milliliter koppelingsbuffer toe en vortex. Was drie keer met koppelingsbuffer door snel te draaien en te vortexen om overtollig cyanide te verwijderen, meng de gewassen kralen met 500 microliter koppelingsbuffer die één milligram OBGH twee H-F-F-B-S-A bevat en vul vervolgens de buis met stikstofgas uit een standaard gasbus. Na het afdekken van de buis, incubeer gedurende 14 uur op een wiel bij kamertemperatuur in het donker. Op de volgende dag, dooft u niet-reactieve OBG uit door de kralen twee keer te wassen met één milliliter doofbuffer door snel te draaien en te vortexen, vervolgens wast u twee keer met koppelingsbuffer om de doofbuffer te verwijderen. Na verwijdering van het supernatant, voegt u één milliliter koppelingsbuffer toe met 50 microgram LOR 594 cin in een middelste ester om te koppelen aan BSA.
Vul de buis met stikstofkap en incubeer gedurende 1,5 uur op een wiel bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de 1,5 uur durende incubatie, stopt u de reactie door de kralen drie keer te wassen met één milliliter doofbuffer. Dit wordt gevolgd door het wassen van de kralen drie keer met één milliliter PBS.
Ten slotte, Ray, schud de kralen op in één milliliter PBS met twee microliters 10% gewicht per volume. Azuur voor langdurige opslag. Meet de concentratie van kralen in de suspensie met een hemo cytometer, deze is typisch een tot twee keer 10 tot de negende kralen per milliliter.
Vul de buis met stikstofkap en bewaar deze op vier graden Celsius in het donker. Begin deze procedure door exponentieel groeiende aliumcellen uit een 10 centimeter petrischaal te oogsten. Verschillende dichtheden van cellen op drie centimeter schalen met een optisch heldere plastic of glazen bodem en laat ze overnacht groeien.
Kies de schalen die ongeveer 80% confluent zijn voor gebruik in het experiment. Vervang het kweekmedium met LF-medium met lage stroom en incubeer gedurende twee uur vóór het experiment om de extracellulaire en intra-endosomale autofluorescentie van het HL vijf C kweekmedium te verminderen. Smelt 10 milliliter 1,5% BDO-agar in LF-medium en giet de agar op een vlakke oppervlakte om een agarlaag van ongeveer één millimeter dikte te vormen.
Wacht 10 tot 15 minuten tot de agar gestold is. Snijd de agarlaag in twee bij twee centimeter vierkanten en plaats deze in LF-medium voor later gebruik. Repareer de widefield microscoop.
Stel de temperatuur van de omgevingskamer in op 22 graden Celsius en pas de instellingen aan die vereist zijn voor het experiment. Na twee uur incubatie, zuigt u het LF-medium uit de drie centimeter schaal, maar laat de celmonolaag bedekt door een dunne film medium. Verdun de eerder bereide OBG-gecoate kralen tot 1,5 keer 10 tot de zevende kralen per milliliter en voeg 10 microliter toe op de cellayaar.
Neem een vierkant agarblad en laat eventueel overtollig vocht weglekken, maar houd de agar nat. Leg het agarvierkant voorzichtig op de cellayaar. De agaroverlay verhoogt het contact tussen kralen en cellen, waardoor de opname wordt verbeterd.
Het comprimeert ook lichtjes de cellen, waardoor ze beter in het brandpuntsvlak van het objectief blijven. Plaats de deksel op de schaal. Voor het succes van het experiment. Beweeg de AGA-overlay
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een veelzijdige benadering voor het monitoren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in verschillende cellulaire modellen. De methoden staan zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse toe van ROS-lokalisatie en de implicaties ervan in cellulaire mechanismen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Onderzoek naar oxidatieve stress
Achtergrond
- Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een cruciale rol in cellulaire signalering.
- Het monitoren van ROS is essentieel voor het begrijpen van oxidatieve stress in cellen.
- Er kunnen verschillende assays worden gebruikt om ROS in verschillende cellulaire contexten te bestuderen.
- Live microscopie en fluorescentietechnieken verbeteren de detectie van ROS.
Doel van het onderzoek
- Om protocollen te ontwikkelen voor het meten van ROS in amoebe- en zoogdiercellen.
- Om inzichten te geven in ROS-gerelateerde cellulaire mechanismen.
- Om zowel kwalitatieve als kwantitatieve studies van ROS te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Live microscopie met behulp van RST groen of OB G gecoate kralen.
- Fluorescentie-emissieanalyse van geoxideerd OBG-fluoresceïne.
- Gebruik van superoxide-gevoelige sonde dihydroethidium (DHE).
- Plate reader-gebaseerde assays voor het kwantificeren van ROS-niveaus.
Belangrijkste resultaten
- Fluorescentie van OBG-fluoresceïne geeft ROS-oxidatie aan.
- DHE intercaleert in DNA bij oxidatie door superoxide.
- Verschillende assays leveren complementaire gegevens over ROS-lokalisatie.
- Methoden kunnen worden aangepast voor verschillende cellulaire modellen.
Conclusies
- De ontwikkelde protocollen zijn effectief voor het bestuderen van ROS.
- De verkregen inzichten kunnen onderzoek naar oxidatieve stress informeren.
- Deze methoden verbeteren het begrip van ROS in cellulaire processen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Monitoring reactive oxygen species (ROS) is critical for target validation in drug discovery, particularly in inflammatory and infectious disease models where ROS signaling modulates pathway activity. The ability to visualize and quantify ROS at subcellular resolution supports mechanistic de-risking by linking target engagement to functional oxidative responses. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing orthogonal readouts that reduce false positives in phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving ROS-mediated signaling pathways in immune cell models.
- Operational Value: Provides qualitative visualization of phagosomal ROS dynamics to confirm target-dependent cellular responses.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by correlating ligand stimulation (e.g., LPS) with quantifiable ROS bursts in phagocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, medium-throughput measurement of intracellular superoxide and extracellular H₂O₂ using DHE and AUR probes.
- Operational Value: Establishes standardized, reproducible fluorescence readouts compatible with 96-well plate formats for assay scalability.
- Assay Readiness: Generates dose-dependent signal changes in response to modulators, enabling inhibitor profiling and pathway validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses disease-relevant stimuli like LPS to model inflammatory activation in phagocytic systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes superoxide vs. hydrogen peroxide sources via compartment-specific probes, clarifying redox biology.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement by confirming target modulation through functional ROS output in native cellular contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying functional validation data after target engagement but before lead optimization, helping triage compounds based on pathway-specific oxidative responses.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of immunomodulatory targets through real-time ROS kinetics in live phagocytes.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for superoxide and H₂O₂ detection in plate-based formats.
- Analytics: Supplies quantitative fluorescence ratios and intensity metrics that allow comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects in vitro ROS measurements to inflammatory disease models via LPS stimulation in Dictyostelium as a surrogate phagocyte system.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular ROS detection platform adaptable across cell types and stimuli for repeated use in target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in ROS-linked signaling pathways.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protocols for qualitative and quantitative ROS detection across microscopy and plate reader platforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional, mechanism-based readouts that complement binding or transcriptional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that modulate defined ROS responses in physiologically relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, probe handling, and phagocytosis assays.
- Depends on access to live-cell imaging systems and fluorescence microplate readers with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of bead coating, cell preparation, and stimulus timing across users and labs.
- Involves adaptation considerations when translating from Dictyostelium to mammalian phagocyte models.
- Limited by the short half-life of ROS, requiring immediate detection and optimized probe kinetics for accurate signal capture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:42
OxyBurst Green (OBG)-Coating of Beads
5:43
Visualization and Qualitative Measurement of ROS Production in Phagosomes
8:48
Quantitative and Medium-throughput Measurement of Intracellular Superoxide Production
10:30
Quantitative and Medium-throughput Measurement of Extracellular H2O2 Production
12:04
Results: OxyBurst Green (OBG), Dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR) Assays can Detect and Measure ROS in Dictyostelium
15:54
Conclusion
