Name: Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Leer fluorescentiemicroscopiemethoden om de levensvatbaarheid van bacteriën in associatie met zoogdiercellen te bepalen. Deze techniek maakt directe visualisatie van individuele bacteriën mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Asya Smirnov en Laura Gonyar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH R00 TW008042 en R01 AI097312 om AKCMBJ werd mede ondersteund door NIH T32 AI007046.

1. Het beoordelen van Bacteriële levensvatbaarheid met propidiumjodide en SYTO9 <ol><li> Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met bacteriën van belang. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen. </li><li> Spoel cellen eenmaal voorzichtig in 0,1 M 3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS), pH 7,2, bevattende 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl2). </li><li> Incubeer cellen gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. </li></ol> OPMERKING: Gedrag controles met levende en dode bacteriën, in afwezigheid van gastheercellen aan te tonen dat het lectine of antilichaam van belang bindt alle bacteriën ongeacht levensvatbaarheid (figuur 1). <ol start="4"><li> Spoel cellen twee keer met MOPS / MgCl2. </li><li> Aspireren media uit cellen en voeg 0,5 ml Levend / Dead Kleuroplossing. Levend / Dead Kleuroplossing is 5uM SYTO9, 30 uM propidiumjodide, en 0,1% saponine (uiteindelijke concentraties) in MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2. </li><li> Omkeren coverslips gezicht naar beneden op glasplaatjes en afdichting met duidelijke nagellak. Heeft montage media niet gebruiken. </li><li> Acquire beelden binnen 30 minuten, met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filter sets compatibel met groen, rood en ver-rood afbeelding acquisitie. </li></ol> OPMERKING: Beide conventionele fluorescentiemicroscopie en confocale laser scanning microscopie worden gebruikt. Na 30 min de fluorescente kleurstoffen beginnen te lekken uit de bacteriën en de verkregen gegevens niet langer juist zijn. De afbeeldingen in dit artikel zijn verkregen op een Nikon Eclipse E800 rechtop fluorescentiemicroscoop met Hamamatsu Orca-ER digitale camera met Openlab software. Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-kleur blauw. Fluorescentie van propidiumjodide werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTO9 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. <ol start="10"><li> Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + rood, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen alleen rood, externe levensvatbare bacteriën verschijnen blauw + groen, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen alleen groen. Tellen door het oog van de aantallen bacteriën die externe levensvatbaar, interne niet-levensvatbare, externe levensvatbaar, en interne levensvatbaar zijn. </li><li> Bereken het percentage externe levensvatbare bacteriën door het aantal externe levensvatbare bacteriën door het totale aantal externe bacteriën (levensvatbare plus nonvistaat). Bereken het percentage interne levensvatbare bacteriën door het aantal interne levensvatbare bacteriën door het totale aantal interne bacteriën (levensvatbare plus levensvatbaar) (Figuur 4). </li><li> Er zijn twee essentiële controles uit te voeren met dit protocol. Eerste, valideren dat alle levensvatbare bacteriën propidiumiodide-positieve en alle levende bacteriën zijn SYTO9-positief. Een mid-logaritmische kweek van bacteriën (in de afwezigheid van gastheercellen) moet&gt; 95% SYTO9-positief zijn. Weergegeven in figuur 2 is een half-logaritmische kweek van N. gonorrhoeae (at 10 8 kolonievormende eenheden per ml) geïncubeerd met Live / Dead Kleuroplossing. Ten tweede, valideren dat zowel propidiumiodide en SYTO9 gepermeabiliseerd, geïnfecteerde gastheercellen kunt invoeren. <ol><li> Een populatie van dode bacteriën genereren, verzamelen 2 x 10 8 bacteriële kolonievormende eenheden in een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 70% isopropanol en 10 minuten zitten. Pellet de bacteriën in een microcentrifuge eennd tweemaal spoelen de bacteriën in PBS resterende isopropanol te verwijderen. Volg dan de stappen protocol 1,5-1,7. Voeg 5 ul van bacteriële suspensie aan een glasplaatje en overlay met een dekglaasje. Afbeelding monsters zoals in protocol stap 1.9. Onder deze omstandigheden moet 100% van de bevolking propidiumjodide-positieve (Figuur 2) zijn. In sommige bacteriesoorten kunnen propidiumjodide niet volledig overweldigen SYTO9 kleuring, en niet-levensvatbare bacteriën kan geel of oranje verschijnen. </li><li> Voor fagocytische cellen zoals neutrofielen, blootstellen van de cellen te doden bacteriën en isopropanol toe dat 100% van de intracellulaire bacteriën propidiumjodide-positieve (figuur 3). Voor nonphagocytic cellen die geen dode bacteriën kunnen internaliseren, kan het voldoende zijn om geïnfecteerde cellen behandeld met natriumazide of andere cel-permeant antimicrobiële middelen voorafgaand aan het toevoegen Levend / Dead Kleuroplossing zijn. </li></ol></li></ol> 2. Het beoordelen van Bacteriële rentabiliteit SYTOX Green en DAPI <ol><li> Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse&#39;s Defined Medium 25 gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen. </li><li> Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles. </li><li> Zuig media uit cellen en voeg 0,5 ml 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2. </li><li> Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten. </li><li&gt; Acquire beelden binnen 30 minuten met een fluorescentiemicroscoop. Zie protocol stap 1.9 voor een beschrijving van de microscoop, digitale camera, en acquisitie software. </li></ol> OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 590-650 nm en een emissie-filter van 663-735 nm en vals-rood. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm. <ol start="10"><li> Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen rood + blauw, en de interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen (figuur 4). Kwantificeren van de procent van de externe en interne bacteriën zoals beschreven in het protocol step 1.11. </li><li> De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3). </li></ol> 3. Het beoordelen van Bacteriële Leefbaarheid Naast subcellulaire lokalisatie <ol><li> Etiket bacteriën van belang met 10 ug / ml DAPI in Morse&#39;s beschreven medium gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Infect cellen die aanhanger 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 24-well platen met DAPI-gemerkte bacteriën. Laat de cellen met aldehyden of organische oplosmiddelen NIET op te lossen. </li><li> Spoel cellen eenmaal met MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 647-gekoppelde antilichaam of lectine dat bindt aan de bacteriële species van belang in MOPS / MgCl2, externe bacteriën detecteren. Zie opmerking in protocol stap 1.3 voor aanbevolen controles. </li><li> Zuig media uit cellen en spoel cellen twee times in MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer cellen met Alexa Fluor 555-gekoppeld antilichaam tegen subcellulaire marker van belang zijn voor 20 min, in MOPS / MgCl2 met 0,2% saponine. </li><li> Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2. </li><li> Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig media uit cellen en voeg 0,4 uM SYTOX Green in MOPS / MgCl2. </li><li> Incubeer de cellen 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Spoel de cellen tweemaal in MOPS / MgCl2. </li><li> Was de cellen eenmaal in MOPS / MgCl2 gedurende 5 minuten. </li><li> Acquire beelden van dia&#39;s binnen 30 min op fluorescentiemicroscoop. Zie protocol stap 1.9 voor een beschrijving van de microscoop, digitale camera, en acquisitie software. </li></ol> OPMERKING: Fluorescentie van Alexa Fluor 647 werd gedetecteerd met behulp van een filter met een golflengte van 590-650 nm en emissie filter van 663-735 nm, en vals-gekleurde paars. Fluorescentie from Alexa Fluor 555 werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 540-580 nm en een emissie-filter van 600-660 nm. Fluorescentie van SYTOX Green werd gedetecteerd met een filter met een excitatie golflengte van 465-495 nm en een emissie-filter van 515-555 nm. Fluorescentie van DAPI werd gedetecteerd met een filter met excitatie golflengte van 355-375 nm en barrière-filter van 400 nm. <ol start="14"><li> Dit protocol zal resulteren in beelden waar externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + groen, interne niet-levensvatbare bacteriën verschijnen groen + blauw, externe levensvatbare bacteriën verschijnen paars + blauw, interne levensvatbare bacteriën verschijnen blauw alleen, en subcellulaire eiwit lijkt rood (figuur 4). Kwantificeren van de perecent van externe en interne levende bacteriën, zoals beschreven in het protocol stappen 1.11. </li><li> De in protocol stap 1.12 beschreven controles moeten worden uitgevoerd met de DAPI / SYTOX groene kleurstof combinatie (fig. 2 en 3). </li><li> InNaast het tellen van levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriën, classificeren elk bacteriën als positief of negatief voor colocalization met de subcellulaire marker van belang. </li><li> Bereken het percentage van levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal levensvatbare bacteriën colocalized door het totaal aantal levensvatbare bacteriën. Bereken het percentage levensvatbare bacteriën colocalized de subcellulaire markering door deling van het aantal niet-levensvatbaar colocalized bacteriën door het totaal aantal levensvatbare bacteriën. </li></ol>

<ol><li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils.</a> Front Microbiol. 2, 77(2011).</li>
<li>Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+Neisseria+gonorrhoeae+with+adherent+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes.</a> Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+oxidative+stress+defenses+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+using+a+human+polymorphonuclear+leukocyte+survival+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay.</a> Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).</li>
<li>Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+of+Neisseria+gonorrhoeae+to+non-oxidative+killing+by+adherent+human+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes.</a> Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> J. Vis. Exp. (49), e2693(2011).</li>
<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Dorward, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+bacteria-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions.</a> Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+absolute%2C+and+simultaneous+quantification+of+specific+pathogenic+strain+and+total+bacterial+cells+using+an+ultrasensitive+dual-color+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer.</a> Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).</li>
<li>Mueller, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+strains+possess+multiple+strategies+for+abiotic+and+biotic+surface+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization.</a> J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inactivation+of+Salmonella+and+Pseudomonas+biofilms+on+stainless+steel+by+use+of+T-128%2C+a+fresh-produce+washing+aid%2C+in+chlorinated+wash+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).</li>
<li>Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+water-borne+bacteria+using+viability+assays+and+flow+cytometry%3A+a+comparison+to+culture-based+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques.</a> J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp.. (17), e745(2008).</li>
<li>Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+confocal+microscopy+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils.</a> Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ability+of+penicillin+to+eradicate+ingested+group+A+streptococci+from+epithelial+cells%3A+clinical+and+pathogenetic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications.</a> Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).</li>
<li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).</li>
<li>Thulin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+group+A+streptococci+in+macrophages+during+acute+soft+tissue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection.</a> PLoS Med. 3, e53(2006).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+new+pathway+for+Staphylococcus+aureus+dissemination%3A+the+silent+survival+of+S.+aureus+phagocytosed+by+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Swords, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+xenopi+multiplies+within+human+macrophages+and+enhances+HIV+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro.</a> Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).</li>
<li>Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+uberis+internalizes+and+persists+in+bovine+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells.</a> Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).</li>
<li>Martinez, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determination+of+Mycobacterium+leprae+viability+by+use+of+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).</li>
<li>Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+equigenerosi+strain+Le1+invades+equine+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).</li>
<li>Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+strains+of+Helicobacter+pylori+demonstrate+delayed+phagocytosis+and+stimulate+homotypic+phagosome+fusion+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages.</a> J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).</li>
<li>Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+characteristics+of+diarrheagenic+Escherichia+coli+pathotypes+and+Helicobacter+pylori+during+passage+through+the+free-living+ciliate%2C+Tetrahymena+sp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).</li>
<li>Morse, S. A., Bartenstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purine+metabolism+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+the+requirement+for+hypoxanthine%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine.</a> Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).</li>
<li>Johnson, M. B., Criss, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+phagosomes+delay+fusion+with+primary+granules+to+enhance+bacterial+survival+inside+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils.</a> Cell Microbiol. , (2013).</li>
<li>Stocks, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+use+of+the+commercially+available+viability+stain%5BTitle%5D)+AND+%22BacLight.+Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism and use of the commercially available viability stain.</a> BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier voorgesteld zijn twee protocollen die gebruik maken DNA binding en levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met een fluorescerend lectine om levende en dode bacteriën bevestigd aan en in menselijke cellen te identificeren. Aangezien beide protocollen effectief discrimineren live vanuit dode bacteriën, de keuze van welk protocol te gebruiken hangt af van het doel van het experiment. Het eerste protocol gebruikt propidiumjodide om levensvatbaar bacteriën en SYTO9 om intacte bacteriën detecteren detecteren. Weerge...

Er is een dynamische interactie en co-evolutie tussen bacteriën en de gastheren waar zij wonen. Bacteriën hechting organellen, secretie systemen, en / of de mogelijkheid om toxines die hun productieve infectie van gastheer fagocytische en niet-fagocytische cellen inschakelen produceren geëvolueerd. De bacteriën moet maken met herkenning en antimicrobiële activiteiten van het gastheerimmuunsysteem. De gastheer immuunsysteem bestaat uit aangeboren en adaptieve componenten, waaronder fysische en chemische barrières, immuuncellen, het complementsysteem, en andere onderdelen van humorale immuniteit. Hoewel veel bacteriën gevoelig voor doden en goedkeuring door het meerlagige immuunrespons hebben sommige pathogene en opportunistische bacteriën mechanismen van verschillende gastheercellen infecteren en ontwrichting goedkeuring door de immuunrespons 1 ontwikkeld. Neisseria gonorrhoeae is een voorbeeld van een bacterieel pathogeen dat is zeer geschikt om te volharden in zijn menselijke gastheer. N. gonorrhoeae koloniseert gemakkelijk de luminale oppervlakken van mucosale epitheliale cellen van het urogenitale kanaal, keelholte, conjunctiva en rectum. Kolonisatie leidt tot de overvloedige rekrutering van neutrofielen bij mucosale sites. Neutrofielen zijn professionele fagocyten die diverse antimicrobiële processen micro-organismen doden bezitten, maar N. gonorrhoeae kan overleven in de aanwezigheid van neutrofielen 2-5. Begrijpen hoe bacteriële pathogenen zoals N. gonorrhoeae ondermijnen, onderdrukken en kapen de immuunrespons uiteindelijk overleven in normaal vijandige hostomgevingen is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de bestrijding van infectieziekten. Experimentele protocollen vaak gebruikt om bacteriële overleving onderzoeken gastheercellen omvatten kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. In kiemgetal assays wordt een populatie van geïnfecteerde cellen gelyseerd (bijvoorbeeld met een wasmiddel which de bacteriën resistent) om de bacteriën te bevrijden. De lysaten verdund en uitgeplaat op agar media en kolonievormende eenheden in de lysaten worden geteld voor elk tijdstip en / of experimentele conditie. Deze benadering meldt de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie, maar is niet in staat onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire overleving. Een variatie op het kiemgetal assay bescherming gentamicine assay specifiek meet intracellulaire bacteriële overleving, gebaseerd op het onvermogen van de antibiotica gentamicine de eukaryote plasmamembraan 6 steken. Echter, deze test is afhankelijk van de bacteriën gevoelig voor doding door gentamicine (of een ander antibioticum dat eveneens eukaryote membraan-impermeant) en het onvermogen van het antibioticum toegang tot interne bacteriën. Daarom kan een bescherming gentamicine assay niet effectief zijn voor de behandeling van bacteriële soort of bij de behandeling van bacteriële overleving in sterkpinocytose cellen zoals neutrofielen. Geen van deze benaderingen onthult de subcellulaire lokalisatie of ander gedrag van individuele bacteriën (bijvoorbeeld als de bacteriën vormen aggregaten of microkolonies die anders individuele bacteriële cellen zich gedragen). Een andere vaak gebruikte benadering om de levensvatbaarheid van individuele externe en interne bacteriën worden onderzocht dunne plaat transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Deze benadering heeft het voordeel dat het kan informatie over de locatie van de bacteriën in gastheercellen (bijvoorbeeld fagosoom, cytoplasma, autophagosome), die verder kunnen worden onderzocht door immuno-elektronenmicroscopie met goud gekoppelde antilichamen tegen subcellulaire markers. Echter, elektronenmicroscopie is niet bijzonder gevoelig op het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid. Wanneer ingebedde secties worden gekleurd met uranylacetaat, loodcitraat of andere elektron-dichte reagentia en afgebeeld door elektronenmicroscopie worden elektron-dichte levensvatbare bacteriën en elektronische beschouwdtron-Lucent nonviable 7,8. Echter, deze veronderstelling overschat bacteriële levensvatbaarheid, omdat alleen die dode bacteriën met ernstig verstoord membranen en verstoken van cytoplasma verschijnen elektron-Lucent. Bovendien kunnen sommige bacteriesoorten verschillende elektronendichtheden beeldscherm afhankelijk van het stadium van de groei, waardoor het moeilijk levensvatbaar bepalen. Als alternatief of in aanvulling op deze gebruikte methoden, hier bieden wij protocollen en redenen voor het gebruik van fluorescente kleurstoffen die bacteriële levensvatbaarheid aan om de overleving van bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. Om extracellulaire bacteriën te identificeren, worden geïnfecteerde cellen eerst blootgesteld aan een fluorescerend reagens, zoals een lectine of bacterie-specifiek antilichaam. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens permeabel en blootgesteld aan DNA-specifieke kleurstoffen die differentieel toegankelijk bacteriën met intacte versus gedegradeerde membranen als een surrogaat voor bacteriële levensvatbaarheid. In de eerste pROTOCOL, het membraan permeabel kleurstof SYTO9 identificeert de totale bacteriële populatie, terwijl propidiumjodide is alleen toegankelijk voor de bacteriën die membranen hebben gecompromitteerd en worden dus beschouwd als niet-levensvatbaar. Propidiumjodide en SYTO9 zijn gebruikt om bacteriële levensvatbaarheid evalueren biofilms, onderscheiden van pathogene pathogene bacteriën en opsommen levensvatbare watergedragen bacteriën 9-12. In het tweede protocol, 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-fenylindool (DAPI) identificeert totale bacteriën, terwijl SYTOX Groen is alleen toegankelijk voor de niet-levensvatbaar bevolking. De levensvatbaarheid kleurstof paren te combineren met immunofluorescentie op locatie elke bacterie bepalen met betrekking tot een eiwit van belang, bijvoorbeeld bacteriële subcellulaire lokalisatie definiëren. Het gebruik van deze assays biedt belangrijke inzicht in de interacties die resulteren in bacteriële doden of overleving tijdens infectie van gastheercellen. De in dit artikel protocollen werden gebruikt om de levensvatbaarheid van beoordelenN. gonorrhoeae die van en in primaire humane neutrofielen, ook in verschillende populaties van neutrofielen phagosomes 5,13,14 bevestigd. Echter, deze protocollen worden toegepast om de levensvatbaarheid van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën beoordelen professionele fagocyten, niet-professionele fagocyten en protozoa 15-24.

<table><tbody><tr><td>21 G 3/4 butterfly needles for blood collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>367251</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bloedopnamebuizen met Natrium Heparien 10 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Steriele water voor irrigatie</td><td>Baxter</td><td>07-09-64-070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran 500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natrium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S641</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>RDCD0200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS zonder Ca2+ of Mg2+</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3002802</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll oplossing</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm ronde glazen dekvlakken</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80 12CIR-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gepoold menselijk serum</td><td>Sigma</td><td>S7023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Mediatech</td><td>15-040-CV</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007103</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Menselijke interleukine-8</td><td>R&amp;D Systems</td><td>208-IL/CF</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M3183</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Propidium Jodide</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 of L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTO9</td><td>Life Technologies</td><td>L7007 of L7012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Fluka Analytical</td><td>47036</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-gekoppelde sojabonenlectin</td><td>Life Technologies</td><td>L-32463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis anti-CD63</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>H5C6</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Antilichaam Labeling Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A20187</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemacytometer Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>EMS</td><td>78320</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT + Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in associatie met zoogdiercellen

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Huidige protocollen om deze vragen te beantwoorden zijn onder kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. Kiemgetal en bescherming gentamicine assays alleen de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie te beoordelen en in staat zijn om individuele bacteriële levensvatbaarheid te bepalen. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën bepalen en informatie over hun lokalisatie in gastheercellen. Echter, bacteriën vertonen vaak een aantal elektron dichtheden, waardoor de beoordeling van de levensvatbaarheid moeilijk. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen. Deze testen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de overleving van Neisseria gonorrhoeae beoordelen in primaire humane neutrofielen, maar moet eenpplicable aan een bacterie-gastheercel interactie. Deze protocollen gecombineerd membraan-permeabele fluorescente kleurstoffen (SYTO9 en 4 &#39;,6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]), die alle bacteriën kleuren met membraan-ondoorlaatbare fluorescerende kleurstoffen (propidiumjodide en SYTOX Green), die alleen toegankelijk zijn levensvatbaar bacteriën. Vóór eukaryotische cel permeabilisatie, wordt een antilichaam of fluorescerend reagens extracellulaire bacteriën te identificeren. Dus deze assays discrimineren de levensvatbaarheid van bacteriën aanhanger en in eukaryotische cellen. Een protocol is ook voorzien voor gebruik van de levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met fluorescente antilichamen tegen eukaryote cel markers om de subcellulaire lokalisatie van individuele bacteriën te bepalen. De bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen besproken in dit artikel zijn een gevoelig aanvulling en / of alternatief voor de traditionele microbiologie technieken om de levensvatbaarheid van de individuele bacteriën evalueren en informatie verstrekken over waar bacteriën overleven in gastheercels.

De geschetste protocollen werden gebruikt om overleving van N. onderzoeken gonorrhoeae na blootstelling aan primaire humane neutrofielen 5,26. Neutrofielen werden geïnfecteerd met N. gonorrhoeae en verwerkt met protocol 1, met behulp van de groene fluorescerende kleurstof SYTO9 levensvatbaarheid en de rood-fluorescerende propidiumiodide (Figuur 4A). De kleurstoffen werden toegevoegd in aanwezigheid van saponine, die cholesterol sequesters preferentieel permeabilize ...

Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Dit fluorescentiemicroscopie-experiment beoordeelt de levensvatbaarheid van individuele bacteriën die geassocieerd zijn met gastheercellen en bepaalt de bacteriële levensvatbaarheid op verschillende subcellulaire locaties. Stel eerst de geïnfecteerde cellen bloot aan een fluorescent reagens dat specifiek is voor de bacteriële permease om externe bacteriën te identificeren, en stel de geïnfecteerde gastheer bloot aan fluorescerende kleurstoffen die levensvatbare van niet-levensvatbare bacteriën onderscheiden op basis van de integriteit van het bacteriële membraan. Incubeer vervolgens de geïnfecteerde cellen met een fluorescent gekoppeld antilichaam tegen een marker van belang om aan te geven waar bacteriën zich binnen de gastheercellen bevinden.De resulterende immunofluorescentiebeelden kunnen worden gebruikt om het percentage levensvatbare bacteriën binnen en buiten de gastheercellen te bepalen, evenals de subcellulaire lokalisatie van levensvatbare versus niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën. In tegenstelling tot kolonietellingsassays, gentamicine-protectie-assays en elektronenmicroscopie, maakt deze methode een directe beoordeling van de levensvatbaarheid van individuele

fluorescence-microscopy-methods-for-determining-viability-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een alternatieve benadering voor de opsomming van...

Een functioneel geheel Bloed Test van de levensvatbaarheid van Mycobacteriën Meet, met behulp van Reporter-Gene Tagged BCG of M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Dit artikel presenteert twee protocollen: een om anaërobe bacteriën te meten die succesvol kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en de andere om anaërobe bacteriën te visualiseren die interageren met gastheercellen. Dit onderzoek kan worden toegepast op elke cultiveerbare anaëroob en elk type eukaryotische cel.

Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Hier wordt een methode beschreven voor de bepaling van inter-Kingdom associatie en concurrentie (bacteriën en schimmels) voor het hechten aan virus-geïnfecteerde HeLa-celmonolagen. Dit protocol kan worden uitgebreid naar meerdere combinaties van prokaryoten, eukaryoten en virussen.

Bepaling van Biofilm Initiatie on-virus geïnfecteerde cellen door bacteriën en schimmels

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Leer fluorescentiemicroscopiemethoden om de levensvatbaarheid van bacteriën in associatie met zoogdiercellen te bepalen. Deze techniek maakt directe visualisatie van individuele bacteriën mogelijk.

Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Meer video's verkennen