Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Dit fluorescentiemicroscoopexperiment beoordeelt de levensvatbaarheid van individuele bacteriën die geassocieerd zijn met gastcellen en bepaalt de levensvatbaarheid van bacteriën op verschillende subcellulaire locaties. Ten eerste, om externe bacteriën te identificeren, zet de geïnfecteerde cellen bloot aan een fluorescerend reagens dat specifiek is voor de bacteriële permease, de geïnfecteerde gastheer in aanwezigheid van fluorescerende kleurstoffen die levensvatbare van niet-levensvatbare bacteriën onderscheiden op basis van de bacteriële membraanintegriteit. Vervolgens, om aan te geven waar bacteriën zich in gastcellen bevinden, behandel de geïnfecteerde cellen met een fluorescent gekoppelde antilichaam tegen een marker van belang.

De resulterende immunofluorescente beelden kunnen het percentage van levensvatbare bacteriën binnen en extern aan gastcellen en de subcellulaire lokalisatie van levensvatbare versus niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën bepalen. In tegenstelling tot kolonietellingsassays, gentamycinebeschermingsassays en elektronenmicroscopie, stelt deze methode een directe beoordeling van de levensvatbaarheid van individuele bacteriën mogelijk. Het kan ook onthullen of bacteriën in verschillende subcellulaire compartimenten verschillen in hun levensvatbaarheid.

Dit proces zal worden gedemonstreerd door Brittany Johnson, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, Atory naar cellen gekweekt op cirkelvormige glazen deksels in 24-putjes platen voegt u de bacteriën van belang toe en incubeert u de gewenste tijd. Spoel de geïnfecteerde cellen eenmaal voorzichtig. Voeg vervolgens Alexa Fluor 6 4 7 gekoppeld antilichaam toe, of een bacterie specifiek lectin om externe bacteriën te detecteren en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Na twee spoelingen, aspireer het medium en voeg 0,5 milliliters levend dood kleuringsoplossing toe die cyto nine en propidium jodium bevat. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker, spoel vervolgens twee keer in mops magnesiumchloride. Draai de deksels met de voorkant naar beneden op glazen plaatjes.

Verzegeld met heldere nagellak. Verwerf de beelden binnen 30 minuten met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filtersets die in het protocoltekst zijn gedetailleerd om de bacteriën te labelen. Voeg 10 microgram per milliliter van DPI toe in mors gedefinieerd medium en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Besmet nu de adherente cellen met DPI gelabelde bacteriën. Bevestig de cellen niet met aldehyden of organische oplosmiddelen. Spoel de cellen eenmaal.

Voeg vervolgens Alexa Fluor 6 4, 7 gekoppeld antilichaam of lectin toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na twee spoelingen met mops buffer, voeg een Alexa Fluor 5 5, 5 gekoppeld antilichaam toe tegen de subcellulaire marker van belang en incubeer gedurende 20 minuten. Na twee, RINs met mops buffer, was de cellen eenmaal met mops magnesiumchloride. Aspireer vervolgens het medium en voeg 0,4 micromolair cyt groen toe, incubeer cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker, spoel de cellen twee keer in mops, magnesiumchloride.

Was vervolgens de cellen. Nog een keer in mops magnesiumchloride gedurende vijf minuten. Draai de deksels met de voorkant naar beneden op glazen plaatjes, verzegel met heldere nagellak, verwerf beelden van de plaatjes binnen 30 minuten op de fluorescentiemicroscoop.

In dit experiment werden humane neutrofielen geïnfecteerd met gonorroe. De Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelde sojaboon lectin detecteert extracellulaire gonorroe. Vervolgens worden de groene fluorescerende levensvatbaarheidsdye, en de rode fluorescerende propidium jodide toegevoegd in aanwezigheid van saponine, dat cholesterol sequesteert om de gastheercel plasmamembranen selectief te permeabiliseren, maar niet de gonorroe membraan in geïnfecteerde cellen, de eukaryote celkern kleurt met zowel cyto nine als propidium jodide.

Deze beelden van gonorroe geïnfecteerde neutrofielen zijn gegenereerd met behulp van de levensvatbaarheidsdyes cyt talk screen en dpi. De propidium jodide kleurstof werd niet gebruikt omdat het fluoresceert in zowel rode als ultraviolette kanalen op de fluorescentiemicroscoop. Alle gonorroe kleuren met dpi, maar alleen bacteriën met gecompromitteerde membranen kleuren met ox groen.

De niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën hebben een ring van kleuring voor CD 63 rond de bacteriën. Deze ring geeft aan dat primaire korrels zijn verrijkt op deze fagosoom. De levensvatbare intracellulaire bacterie mist kleuring voor CD 63, wat aangeeft dat primaire korrels niet zijn verrijkt op zijn fagosoom.Genomen.

Samen tonen de gegevens een correlatie aan tussen de levensvatbaarheid van gonorroe en residenten in een primaire korrel negatief fagosoom. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de levensvatbaarheid van bacteriën in gastcellen kunt evalueren. Bovendien zult u in staat zijn om de levensvatbaarheid van bacteriën te bepalen die gelokaliseerd zijn in verschillende compartimenten in gastcellen door antilichamen te gebruiken die gericht zijn op deze subcellulaire compartimenten.