Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen

Dit fluorescentiemicroscopie-experiment beoordeelt de levensvatbaarheid van individuele bacteriën die geassocieerd zijn met gastheercellen en bepaalt de bacteriële levensvatbaarheid op verschillende subcellulaire locaties. Stel eerst de geïnfecteerde cellen bloot aan een fluorescent reagens dat specifiek is voor de bacteriële permease om externe bacteriën te identificeren, en stel de geïnfecteerde gastheer bloot aan fluorescerende kleurstoffen die levensvatbare van niet-levensvatbare bacteriën onderscheiden op basis van de integriteit van het bacteriële membraan. Incubeer vervolgens de geïnfecteerde cellen met een fluorescent gekoppeld antilichaam tegen een marker van belang om aan te geven waar bacteriën zich binnen de gastheercellen bevinden.

De resulterende immunofluorescentiebeelden kunnen worden gebruikt om het percentage levensvatbare bacteriën binnen en buiten de gastheercellen te bepalen, evenals de subcellulaire lokalisatie van levensvatbare versus niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën. In tegenstelling tot kolonietellingsassays, gentamicine-protectie-assays en elektronenmicroscopie, maakt deze methode een directe beoordeling van de levensvatbaarheid van individuele bacteriën mogelijk. Het kan daarnaast onthullen of bacteriën in verschillende subcellulaire compartimenten verschillen vertonen in hun levensvatbaarheid.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Brittany Johnson, een promovendus uit mijn laboratorium. Voeg aan cellen die gekweekt zijn op ronde glazen dekglasjes in 24-wells platen de bacteriën van belang toe en incubeer gedurende de gewenste tijd. Spoel de geïnfecteerde cellen eenmaal voorzichtig af. Voeg vervolgens Alexa Fluor 647-gekoppeld antilichaam, of een bacteriespecifiek lectine toe om externe bacteriën te detecteren en incubeer 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.

Na twee spoelbeurten wordt het medium geaspireerd en worden 0,5 milliliters van een live-dead kleuringsoplossing met cyto nine en propidiumjodide toegevoegd. Incubeer de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker en spoel ze vervolgens tweemaal met mops magnesiumchloride. Plaats de dekglasjes ondersteboven op objectglazen.

Afdichten met transparante nagellak. Leg de beelden binnen 30 minuten vast met een fluorescentiemicroscoop met filtersets zoals beschreven in het tekstprotocol om de bacteriën te labelen. Voeg 10 µg/mL DPI toe in mors-gedefinieerd medium en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Infecteer nu de adherente cellen met DPI-gelabelde bacteriën. Fixeer de cellen niet met aldehyden of organische oplosmiddelen. Spoel de cellen eenmaal af.

Voeg vervolgens een Alexa Fluor 647-gekoppeld antilichaam of lectine toe en incubeer dit gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na twee spoelingen met MOPS-buffer voegt u een Alexa Fluor 555-gekoppeld antilichaam tegen de gewenste subcellulaire marker toe en incubeert u dit gedurende 20 minuten. Na twee spoelingen met MOPS-buffer wast u de cellen eenmaal met MOPS-magnesiumchloride. Aspireer vervolgens het medium en voeg 0,4 µM Cy3 Green toe; incubeer de cellen vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker en spoel de cellen tweemaal met MOPS-magnesiumchloride.

Was daarna de cellen. Nog een keer in MOPS magnesiumchloride gedurende vijf minuten. Plaats de dekglasjes met de cellen naar beneden op glazen objectglazen, seal deze met transparante nagellak en maak binnen 30 minuten beelden van de objectglazen met de fluorescentiemicroscoop.

In dit experiment werden menselijke neutrofielen geïnfecteerd met gonokokken. Het Alexa Fluor 6 4 7-gekoppelde soja-lectine detecteert extracellulaire gonokokken. Vervolgens werden de groene fluorescerende levensvatbaarheidskleurstof en het rode fluorescerende propidiumjodide toegevoegd in aanwezigheid van saponine, wat cholesterol wegvangt om bij voorkeur de plasmamembranen van de gastheercel te permeabiliseren, maar het membraan van de gonokokken in geïnfecteerde cellen niet permeabiliseert; de eukaryote celkern kleurt met zowel cyto nine als propidiumjodide.

Deze beelden van gonorroe-geïnfecteerde neutrofielen zijn gegenereerd met behulp van de levensvatbaarheidsstoffen cyt talk screen en dpi. De propidiumjodide-kleurstof werd niet gebruikt omdat deze zowel in de rode als in de ultraviolette kanalen van de fluorescentiemicroscoop fluoresceert. Alle gonorroe kleurt met dpi, maar alleen bacteriën met beschadigde membranen kleuren met ox green.

De niet-levensvatbare intracellulaire bacterie vertoont een ring van CD 63-kleuring rondom de bacterie. Deze ring geeft aan dat primaire granula verrijkt zijn bij dit fagosoom. De levensvatbare intracellulaire bacterie vertoont geen kleuring voor CD 63, wat aangeeft dat primaire granula niet verrijkt zijn bij het fagosoom ervan.

Samen tonen de gegevens een correlatie aan tussen de levensvatbaarheid van gonorroe en de aanwezigheid in een primair granula-negatief fagosoom. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de levensvatbaarheid van bacteriën in gastheercellen kan worden geëvalueerd. Daarnaast zult u in staat zijn de levensvatbaarheid te bepalen van bacteriën die gelokaliseerd zijn in verschillende compartimenten in gastheercellen door gebruik te maken van antilichamen gericht tegen deze subcellulaire compartimenten.