Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen
September 5th, 2013
Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.
Dit fluorescentiemicroscoopexperiment beoordeelt de levensvatbaarheid van individuele bacteriën die geassocieerd zijn met gastcellen en bepaalt de levensvatbaarheid van bacteriën op verschillende subcellulaire locaties. Ten eerste, om externe bacteriën te identificeren, zet de geïnfecteerde cellen bloot aan een fluorescerend reagens dat specifiek is voor de bacteriële permease, de geïnfecteerde gastheer in aanwezigheid van fluorescerende kleurstoffen die levensvatbare van niet-levensvatbare bacteriën onderscheiden op basis van de bacteriële membraanintegriteit. Vervolgens, om aan te geven waar bacteriën zich in gastcellen bevinden, behandel de geïnfecteerde cellen met een fluorescent gekoppelde antilichaam tegen een marker van belang.
De resulterende immunofluorescente beelden kunnen het percentage van levensvatbare bacteriën binnen en extern aan gastcellen en de subcellulaire lokalisatie van levensvatbare versus niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën bepalen. In tegenstelling tot kolonietellingsassays, gentamycinebeschermingsassays en elektronenmicroscopie, stelt deze methode een directe beoordeling van de levensvatbaarheid van individuele bacteriën mogelijk. Het kan ook onthullen of bacteriën in verschillende subcellulaire compartimenten verschillen in hun levensvatbaarheid.
Dit proces zal worden gedemonstreerd door Brittany Johnson, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, Atory naar cellen gekweekt op cirkelvormige glazen deksels in 24-putjes platen voegt u de bacteriën van belang toe en incubeert u de gewenste tijd. Spoel de geïnfecteerde cellen eenmaal voorzichtig. Voeg vervolgens Alexa Fluor 6 4 7 gekoppeld antilichaam toe, of een bacterie specifiek lectin om externe bacteriën te detecteren en incubeer gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
Na twee spoelingen, aspireer het medium en voeg 0,5 milliliters levend dood kleuringsoplossing toe die cyto nine en propidium jodium bevat. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker, spoel vervolgens twee keer in mops magnesiumchloride. Draai de deksels met de voorkant naar beneden op glazen plaatjes.
Verzegeld met heldere nagellak. Verwerf de beelden binnen 30 minuten met behulp van een fluorescentiemicroscoop met filtersets die in het protocoltekst zijn gedetailleerd om de bacteriën te labelen. Voeg 10 microgram per milliliter van DPI toe in mors gedefinieerd medium en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
Besmet nu de adherente cellen met DPI gelabelde bacteriën. Bevestig de cellen niet met aldehyden of organische oplosmiddelen. Spoel de cellen eenmaal.
Voeg vervolgens Alexa Fluor 6 4, 7 gekoppeld antilichaam of lectin toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na twee spoelingen met mops buffer, voeg een Alexa Fluor 5 5, 5 gekoppeld antilichaam toe tegen de subcellulaire marker van belang en incubeer gedurende 20 minuten. Na twee, RINs met mops buffer, was de cellen eenmaal met mops magnesiumchloride. Aspireer vervolgens het medium en voeg 0,4 micromolair cyt groen toe, incubeer cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker, spoel de cellen twee keer in mops, magnesiumchloride.
Was vervolgens de cellen. Nog een keer in mops magnesiumchloride gedurende vijf minuten. Draai de deksels met de voorkant naar beneden op glazen plaatjes, verzegel met heldere nagellak, verwerf beelden van de plaatjes binnen 30 minuten op de fluorescentiemicroscoop.
In dit experiment werden humane neutrofielen geïnfecteerd met gonorroe. De Alexa Fluor 6 4 7 gekoppelde sojaboon lectin detecteert extracellulaire gonorroe. Vervolgens worden de groene fluorescerende levensvatbaarheidsdye, en de rode fluorescerende propidium jodide toegevoegd in aanwezigheid van saponine, dat cholesterol sequesteert om de gastheercel plasmamembranen selectief te permeabiliseren, maar niet de gonorroe membraan in geïnfecteerde cellen, de eukaryote celkern kleurt met zowel cyto nine als propidium jodide.
Deze beelden van gonorroe geïnfecteerde neutrofielen zijn gegenereerd met behulp van de levensvatbaarheidsdyes cyt talk screen en dpi. De propidium jodide kleurstof werd niet gebruikt omdat het fluoresceert in zowel rode als ultraviolette kanalen op de fluorescentiemicroscoop. Alle gonorroe kleuren met dpi, maar alleen bacteriën met gecompromitteerde membranen kleuren met ox groen.
De niet-levensvatbare intracellulaire bacteriën hebben een ring van kleuring voor CD 63 rond de bacteriën. Deze ring geeft aan dat primaire korrels zijn verrijkt op deze fagosoom. De levensvatbare intracellulaire bacterie mist kleuring voor CD 63, wat aangeeft dat primaire korrels niet zijn verrijkt op zijn fagosoom.Genomen.
Samen tonen de gegevens een correlatie aan tussen de levensvatbaarheid van gonorroe en residenten in een primaire korrel negatief fagosoom. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de levensvatbaarheid van bacteriën in gastcellen kunt evalueren. Bovendien zult u in staat zijn om de levensvatbaarheid van bacteriën te bepalen die gelokaliseerd zijn in verschillende compartimenten in gastcellen door antilichamen te gebruiken die gericht zijn op deze subcellulaire compartimenten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft protocollen voor het beoordelen van de levensvatbaarheid van individuele bacteriën geassocieerd met gastcellen met behulp van fluorescentiemicroscopie. De beschreven methoden maken het mogelijk om de bacteriële levensvatbaarheid op verschillende subcellulaire locaties te bepalen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Bacteriele pathogenese
- Fluorescentiemicroscopie
- Cellulaire interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van bacterieel overleven in gastcellen is cruciaal voor het bestuderen van infecties.
- Fluorescente kleurstoffen kunnen onderscheid maken tussen levensvatbare en niet-levensvatbare bacteriën.
- Traditionele methoden geven mogelijk geen directe beoordelingen van individuele bacteriële levensvatbaarheid.
- Deze studie is bedoeld om het begrip van bacterieel gedrag binnen gastcellen te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid in gastcellen.
- Om de lokalisatie van levensvatbare versus niet-levensvatbare bacteriën te onderzoeken.
- Om een nauwkeurigere alternatief te bieden voor bestaande methoden voor levensvatbaarheidsbeoordeling.
Gebruikte methoden
- Blootstelling van geïnfecteerde cellen aan fluorescente reagentia specifiek voor bacteriële permease.
- Gebruik van fluorescente kleurstoffen om levensvatbare van niet-levensvatbare bacteriën te onderscheiden.
- Incubatie met fluorescent gekoppelde antilichamen om bacteriële locaties te identificeren.
- Analyse van immunofluorescente beelden om de bacteriële levensvatbaarheid te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt directe beoordeling van individuele bacteriële levensvatbaarheid mogelijk.
- Resultaten wijzen op verschillen in levensvatbaarheid op basis van subcellulaire lokalisatie.
- Immunoflurescente beeldvorming biedt duidelijke visualisatie van bacteriën.
- Deze aanpak overtreft traditionele methoden bij het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is effectief voor het bestuderen van bacteriële levensvatbaarheid in gastcellen.
- Fluorescentiemicroscopie kan belangrijke inzichten geven in bacteriële pathogenese.
- Deze studie verbetert het begrip van microbiële overlevingsstrategieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct quantification of individual bacterial viability within mammalian cells addresses a critical gap in infectious disease research and host-pathogen interaction studies. This fluorescence microscopy workflow enables precise mapping of viable versus non-viable bacteria at the subcellular level, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and informs risk-adjusted portfolio decisions in anti-infective R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of bacterial survival mechanisms within host cell compartments.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable intracellular bacteria.
- Improves predictive confidence for prioritizing anti-infective targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative imaging assays for downstream screening workflows.
- Standardizes viability assessment at the single-bacterium level for reproducibility.
- Enables robust comparison of compound effects on bacterial viability in host contexts.
- Supports scalable adaptation to diverse bacterial and host cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns viability readouts with disease-relevant host-pathogen systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of anti-infective strategies.
- Enables risk-adjusted advancement based on subcellular localization and survival data.
- Supports translational biomarker development for infection outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for infectious disease programs, bridging early mechanistic studies and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on bacterial survival and host defense mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible viability outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple bacterial species and host cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes viability assessment and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in anti-infective portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and candidate interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to advanced imaging instrumentation and validated fluorescent reagents.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and imaging parameters.
- Adaptable to various bacterial and mammalian cell models with protocol optimization.
- Dependent on careful timing and handling to preserve viability readouts.
