Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor

Het algemene doel van deze procedure is om een tweedimensionale kaart van een bacterieel proteoom te genereren. Dit wordt bereikt door eerst een bacteriecultuur te kweken en de eiwitten te oogsten. Vervolgens worden de geoogste eiwitten in één dimensie gescheiden op basis van hun pH.

Door middel van isoelektrisch focussen na de scheiding in de eerste dimensie worden de eiwitten in de tweede dimensie verder gescheiden op basis van hun molecuulgewicht. Ten slotte wordt de gel van de tweede dimensie gekleurd en worden de eiwitten gevisualiseerd. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die verschillen in eiwitexpressie laten zien via tweedimensionale elektroforese.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van bacteriële pathogenese, zoals welke eiwitten worden geproduceerd onder bepaalde omstandigheden en hoe verschillen diverse bacteriële isolaten in eiwitproductie? Deze informatie kan helpen bij het identificeren van kandidaat-eiwitten die mogelijk betrokken zijn bij virulentie. Nadat een 100 milliliter koude zuivelcultuur tot de stationaire fase is gegroeid, worden 35 milliliter overgebracht naar een centrifugebuis en gecentrifugeerd bij 4.500 Gs en vier graden Celsius gedurende 20 minuten.

Resuspendeer het pellet in 35 milliliter koud PBS en herhaal de centrifugatie. Na het resuspenderen van het pellet in één milliliter koud PBS, brengt u de oplossing over naar een steriele microbuis van twee milliliter en centrifugeert u opnieuw. Herhaal de wasstap in één milliliter koud PBS voordat u centrifugeert bij vier graden Celsius en 14.000 Gs gedurende één minuut; verwijder het supernatant en voeg één milliliter PBS-EDTA-PMSF-oplossing toe. Breng het opgeloste pellet over naar een schroefdopbuis van twee milliliter die ongeveer 0,5 milliliter vooraf gesteriliseerde glaskralen bevat.

Ga vervolgens naar de koelkamer om de cellen te lyseren; gebruik hiervoor een mini bead beader drie keer gedurende telkens één minuut, waarbij het monster na elke ronde op ijs wordt geplaatst. Centrifugeer één minuut voordat het supernatant in een steriele polystyreen buis van 5 ml wordt overgebracht. Om de opbrengst te verhogen, wordt het bead bashing twee keer herhaald met een aanvullende aliquot PBS-EDTA-PMSF. Neem de monsters uit.

Sla na bepaling van de eiwitkwantiteit aliquots van 200 µg op bij -80 °C tot het tijdstip waarop ze worden gebruikt voor de eerste dimensie. Isoelektrische focussering of IEF begint met het reinigen van de stripophangsystemen met een strip-reinigingsoplossing. Spoel de strips vervolgens af met Milli-Q-water.

Laat ze vervolgens ondersteboven drogen; wijs na het drogen aan elk monster een nummer van een gelstriphouder toe. Breng een eerder bereid eiwitmonster van 200 microgram aan in de laterale put van de striphouder en verdeel het monster over de houder met een pipet en schone pincetten. Haal de gelstrips uit de verpakking.

Verwijder vervolgens de beschermlaag van de gelstrips voordat u deze met de ruwe zijde naar beneden in een langzame glijdende beweging plaatst, zodat de strips van de negatieve naar de positieve pool nat worden. Om doorbranden te voorkomen, plaatst u met gesteriliseerd water bevochtigd blotterpapier bovenop de elektrode en onder de gelstrips. Verwijder luchtbellen en bedek het geheel met een dunne laag minerale olie om uitdroging te voorkomen.

Lijn de houders voor de gelstrips uit op het IEF-apparaat. Run de monsters met behulp van het hier vermelde programma. De gels kunnen op elk moment tijdens de laatste stap worden verwijderd.

Wanneer het programma voltooid is, worden de strips uit de strip houders verwijderd en, tenzij ze onmiddellijk worden gebruikt, in plasticfolie gewikkeld en bewaard bij -80 °C tot het moment dat de tweede dimensie SDS-PAGE wordt uitgevoerd. Na het assembleren van het gel-gietapparaat voor SDS-PAGE wordt de geloplossing in een kolf met een vacuümtip en een roerstaf bereid door 1,5 M Tris-buffer en MCU-water toe te voegen, waarna de oplossing 20 minuten op gematigde snelheid onder vacuüm wordt ontgast. Wanneer het vacuümproces is voltooid, wordt 10% SDS aan de geloplossing toegevoegd door dit langs de wand van de kolf te pipetteren. Om de vorming van bellen te voorkomen, worden vervolgens vers bereid ammoniumpersulfaat en TEMED toegevoegd en wordt het mengsel geroerd.

Giet de gel en laat deze uitharden, los vervolgens DTT op in de eerder bereide equilibratieoplossing. Haal de strips uit de opslag bij -80 °C, pak ze uit en plaats de IPG-strips met de gelzijde naar beneden in de buffer en incubeer deze gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 4,5 liter elektroforesebuffer toe aan het loopreservoir.

Verwijder vervolgens met een pincet de strips uit de equilibratie-oplossing en gebruik een papieren handdoek om het overtollige buffer te verwijderen. Demonteer het apparaat voor het gieten van de gel en was de glasplaten met warm water. Nadat het water bovenop de gel is vervangen door running buffer, gebruikt u een schone pincet om een strip op de lange plaat te plaatsen, met de gelzijde naar u toe gericht.

Smeer de strip in met 1x buffer en gebruik een plastic strip om de IPG-strip verder tegen de gel aan te schuiven, zodat alle luchtbellen tussen de strip en de gel worden verwijderd. Voeg agarro-afdichtingsvloeistof toe aan de bovenkant van de strip om deze op zijn plaats te fixeren. Laat het geheel vervolgens in het gelreservoir zakken nadat dit proces voor alle strips is herhaald.

Nadat is gecontroleerd of het niveau van de 1x buffer in de buitenkamer op het aangewezen niveau staat, wordt de bovenkamer bevestigd. Plaats het frame van de bovenste bufferkamer bovenop de glasplaten en druk dit aan. Voeg de 2x loopbuffer toe aan de bovenkamer tot aan de middellijn.

Voeg vervolgens de one x running buffer toe aan de buitenkamer totdat deze de bovenste lijn bereikt. Plaats het deksel erop en zet de elektroforese-unit en de voeding aan. Laat de monsters een nacht lopen bij 52 volts, 96 milliamps en vijf watts.

Laat de gels lopen tot de frontlijn zich op één centimeter van de onderkant bevindt. Verwijder na afloop de platen uit de caster. Zodra de gels van de glasplaten zijn verwijderd, fixeert u ze gedurende ten minste één uur of overnacht bij vier graden Celsius in oplossing één.

Breng de gels vervolgens over naar fixeeroplossing twee en schud deze gedurende één uur. Was de gels vier keer gedurende elk 15 minuten in Milli Q-water. Gebruik daarna een zilvernitraatoplossing om de gels gedurende 30 minuten tot maximaal 48 uur te kleuren.

Nadat de gels een minuut zijn gewassen in Milli Q water, worden ze overgebracht naar de ontwikkelaarsoplossing totdat de gel gekleurd is. Na ongeveer vijf tot 30 minuten wordt de reactie gestopt door de gels gedurende 10 minuten in de stopoplossing te plaatsen. Hier wordt een met Coomassie Blue gekleurde gel getoond van eiwitextracties uit hele cellen van ol dia multivorans.

Klinische isolaten gekweekt in LB-medium of gist-mannitoolbouillon en geoogst in de stationaire fase. Vergelijkende analyse van de eiwitprofielen geëxtraheerd uit dezelfde bacteriële culturen op twee verschillende gelegenheden vertoonde vergelijkbare bandpatronen, wat duidt op succesvolle eiwitextracties. In deze figuur laat de 2D-gelelektroforese-analyse van 200 micrograms totaal eiwit van Bural dio, pseudo een overvloed aan meer dan 500 spots zien die individueel geïdentificeerd kunnen worden via massaspectrometrie.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cytometrie, worden uitgevoerd om kwantitatieve en kwalitatieve verschillen tussen nauw verwante bacteriële isolaten vast te stellen. Daarnaast kunnen onderzoekers, door middel van een aanpassing van de kleuringsmethode, de identiteit van proteïnevlekken bepalen via vlekexcisie en massaspectrometrie.