Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een zaadhuls-beddenassay om te onderzoeken hoe het endosperm de zaadkieming bij rabbit opsis reguleert in reactie op verschillende omgevingsfactoren, zowel op genetisch niveau als in vitro. Dit wordt bereikt door eerst met een injectienaald en afgeknotte pincetten zorgvuldig de zaadhuls en het embryo uit het Arab Opsis-zaad te dissekeren. In de tweede stap worden de gedisseceerde zaadhulsen voorzichtig overgebracht naar een kiemmedium.

Vervolgens worden de zaadhulzen samengevoegd tot een enkele cirkelvormige laag. In de laatste stap worden de embryo's in het midden van het samengevoegde bed van zaadhulzen geplaatst. Eveneens als een enkele cirkelvormige laag.

Het endosperm speelt een essentiële rol bij het beheersen van de zaadkieming in onze ab autopsy-zaden. De seed coat bending assay is een in vitro genetische systeemprecedure om de moleculair-genetische componenten van de signaleringspaden te identificeren die in het endosperm functioneren voor de controle van de zaadkieming. Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze methode moeite ermee, omdat het lastig is om het embryo snel te dissekeren zonder deze te beschadigen.

De ouderdom van het gebruikte materiaal is ook belangrijk om te overwegen, aangezien deze met de tijd de capaciteit om de celdeterminatie te beheersen kunnen verliezen. Begin met het gieten van 50 tot 60 µL rijpe, droge Arabidopsis-zaden in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg vervolgens 1 mL 70% ethanol toe aan de buis en schud de zaden bij kamertemperatuur in een vortex of ingesteld op 1200 RPM. Centrifugeer de buis na 10 minuten gedurende drie seconden bij 4.000 Gs om de zaden onderin de buis te concentreren.

Gebruik vervolgens een vacuümsuictip om de ethanol voorzichtig af te zuigen, zodat de zaden op de bodem van de buis achterblijven. Voeg nu één milliliter steriel gedestilleerd water toe aan de zaden en schud de zaden nogmaals 10 minuten. Nadat de zaden opnieuw zijn gecentrifugeerd, wordt het supernatant afgezogen en wordt er nog een milliliter steriel gedestilleerd water aan de buis toegevoegd, waarbij wordt gewaarborgd dat de waterstroom de zaden homogeen door de buis verspreidt.

Plaats de buis vervolgens in een rek om de zaden naar de bodem van de buis te laten zakken. Aspireer na ongeveer 30 seconden voorzichtig het water om de zaden uit te platen. Giet eerst 30 milliliters vers bereid kiemmedium van 50 degrees Celsius in een 100 millimeter Petri-schaal. Resuspendeer de zaden in 200 microliters steriel gedestilleerd water en gebruik vervolgens een micro-pipetpunt van één milliliter om ze over te brengen naar het oppervlak van het kiemmedium.

Zuig het water rondom de zaden af en laat de petrischaal met de zaden vervolgens onafgedekt in de laminaire flowkast staan om verder te drogen. Sluit de petrischaal na twee uur en laat de zaden nog 90 minuten in de kast staan. Plaats nu een stereomicroscoop in de kast.

Giet 30 milliliters kiemmedium in een andere 100 millimeter Petrischaal en plaats vervolgens twee naast elkaar geplaatste rechthoekige geautoclaveerde Watman drie millimeter papiertjes op het oppervlak van het medium. De moeilijkste stap van deze procedure is de dissectie, omdat het zaad erg dun is; het is daarom noodzakelijk om zeer voorzichtig te zijn om beschadiging van het embryo te voorkomen bij het doorsnijden van het zaadje dat is vastgehouden met een paar steriele stomaatDumont nummer vijf pincetten met stompe punt.

Breng de zaden over naar het papier, terwijl u de pincet gesloten houdt. Druk een individueel zaadje voorzichtig in het papier. Gebruik nu de punt van een insulinespuitnaald van gauge 29 om de zaadhuid langs de langste semi-principale as door te snijden, zo dicht mogelijk bij de plek waar de co-lead-ins verbonden zijn met de radical.

Gebruik vervolgens de pincet om het zaadje tegen het papier te duwen. Oefen opnieuw druk uit op de punt van de Cains, zo dicht mogelijk bij de punt van de wortel, om het embryo uit de zaadhuid te laten komen voor het opzetten van een zaadhuid-beddenassay. Plaats eerst een stuk steriel nylon gaas van 3,5 bij vijf centimeter in een andere, vers gegoten 100 millimeter petrischaal met kiemmedium.

Gebruik vervolgens de spuit om de embryo's en zaadhulzen voorzichtig tegen de metalen randen van de pincet te duwen en breng de plantenweefsels over naar het nylon gaas. Gebruik de pincet en de spuit om een enkele cirkelvormige laag zaadhulzen te vormen, waarbij u erop let dat de hulzen zo dicht mogelijk bij elkaar liggen en de openingen van de zaadhulzen naar boven zijn gericht. Plaats vervolgens de embryo's in een enkele cirkelvormige laag in het midden van het bed van zaadhulzen, waarbij u er ook voor zorgt dat de embryo's zo dicht mogelijk bij elkaar liggen.

Incubeer tot slot de seaco-bodemassays onder continu licht bij 20 tot 21 °C, in overeenstemming met eerdere resultaten. Zaden van een rabbit opsys-mutant die geen gier illine kunnen synthetiseren, of GA-deficiënte mutanten, kunnen 80 uur na zaadinhibitie niet kiemen. In tegenstelling hiertoe en in verdere overeenstemming met eerdere resultaten, triggert het verwijderen van de zaadhuid de groei van het embryo van de GA-deficiënte mutant, tenzij OB CIC-zuur of een BA aanwezig is in het medium, wat suggereert dat het endosperm van GA-deficiënte mutanten een BA afgeeft aan het embryo om de kieming ervan te blokkeren.

Op deze afbeelding is, 80 uur na kiemremming, een zaadhuid-bedassay te zien met GA-deficiënte mutante embryo's op een bed van 80 GA-deficiënte mutante zaadhuiden. In overeenstemming met onze hypothese blokkeren GA-deficiënte mutante zaadhuiden de groei van GA-deficiënte mutante embryo's. Hier wordt een zaadhuid-bedassay getoond met GA-deficiënte mutante embryo's gekweekt op een bed van GA-deficiënte mutante zaadhuiden die ook het vermogen missen om A BA te synthetiseren; 80 uur na kiemremming zijn de mutante zaadhuiden, zoals verwacht, niet in staat om de groei van GA-deficiënte mutante embryo's te blokkeren.

Op dezelfde wijze waren GA-deficiënte mutante embryo's, gekweekt op een bed van GA-deficiënte mutante zaadhulzen waarin de deli-factor RGL2 ontbrak, na deze procedure eveneens niet in staat om de groei van GA-deficiënte mutante embryo's te blokkeren. Andere methoden, zoals genexpressieanalyse van de zaadhuls en het uit het zaad gedisseceerde embryo, kunnen worden uitgevoerd om de genetische interactie via het baden van de zaadhuls te onderzoeken. Zodra deze techniek onder de knie is, zou het onderzoekers op het gebied van zaadkieming in staat moeten stellen om te verkennen hoe de zaadhuls de embryonale groei reguleert als reactie op omgevingssignalen in onze s.