Identificatie van metabool actieve bacteriën in de darm van de Generalist Spodoptera littoralis Via DNA Stabiele Isotopen Onderzoek naar gebruik van ¹³ C-Glucose

Het algemene doel van het volgende experiment is om een efficiënte methodologie te beschrijven die wordt gebruikt om de metabolisch actieve bacteriën in de darm van een insect fylogentisch genetisch te karakteriseren. Dit wordt bereikt door eerst C 13 gelabelde glucose aan het insect te geven om het DNA van de metabolisch actieve bacteriën in hun darm isotopisch te verrijken. De volgende stap is om het DNA van de bacteriële gemeenschap in de darm te extraheren.

De derde stap is om het DNA van de metabolisch actieve soorten te scheiden, die de C 13 hebben opgenomen. Het DNA wordt vervolgens fylogenetisch geïdentificeerd en gekwantificeerd voor de aanwezige soorten door middel van pyro sequencing. Hierdoor worden de metabolisch actieve bacteriesoorten geïdentificeerd die de gemeenschap vormen in de darm van het insect.

Dus de darm van meercellige organismen is een ingenieuze uitvinding om de metabolische capaciteiten van micro-organismen te benutten om complexe organische stof op te lossen of te solubiliseren, zodat het uiteindelijk als voedingsstof voor de insectengastheer kan dienen. Om het systeem te begrijpen, moeten we eerst analyseren wie er is en ten tweede wie welke metabolische activiteiten heeft. Als we deze gegevens hebben, kunnen we de flux van metabolieten en degradatieproducten tussen de degraderende micro-organismen en de insectengastheer reconstrueren.

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen in het veld van microbiële ecologie te beantwoorden, met name op de manier waarop deze microben met hun gastheer interageren. In die zin kunnen we meer weten en duidelijker definiëren welke functies deze organismen voor hun gastheer vervullen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de algemene actieve darmbacteriën.

Door het ucle-glucose te volgen, kan het ook worden uitgevoerd op andere koolstofbronnen, zoals het labelen van de celulose om actieve bacteriën te identificeren die betrokken zijn bij het verteringsproces van de ocrant-voedingsstof. Houd op liters, eieren en petrischalen op kamertemperatuur tot ze uitkomen. Breng vervolgens de pas uitgekomen larven over naar een schone plastic doos en kweek ze op een kunstmatige voeding bij 23 tot 25 graden Celsius onder een langdagregime met 16 uur verlichting en acht uur duisternis. Na een paar dagen breng je negen tot vijftien gezonde tweede stadiumlarven vanuit de kweekbox over naar individuele petrischalen met verse C 13 glucose.

Spiked kunstmatige voeding, ten minste drie replica's van drie larven elk zijn nodig per behandeling. Gebruik een kunstmatige voeding die dezelfde hoeveelheid inheemse glucose biedt als een natuurlijk voedselbron zoals katoen voor het voeren van de controlegroep. Gedurende de volgende 24 uur.

Vernieuw de kunstmatige voedingen regelmatig. Begin door de larven met zachte pincetten over te brengen naar een zwembad met gedestilleerd water om grote puinhopen te verwijderen. Breng vervolgens over naar een nieuwe schone schaal om de insecten te verdoven en te doden.

Plaats ze op ijs en laat vervolgens de temperatuur dalen tot min vijf graden Celsius in een koelbox. Desinfecteer vervolgens de dode insecten met 70% ethanol en dompel ze onder in PBS voor de dissectie. De gereedschappen moeten ook worden schoongemaakt met 70% ethanol.

Begin met insnijdingen in de cuticula langs de rechter- en linkerkant. Begin bij het hoofd en eindig bij de anus. Verwijder het hele exoskelet, de malian-tubuli en het vetlichaam.

Vervang vervolgens de buffer voordat u de darm opent met de darm geïsoleerd van de andere weefsels. Verwerk de hele darm of secties voor darm, middendarm of achterdarm. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag.

Breng de darmweefsels zonder PBS over naar een kleine steriele buis en bewaar ze in de vriezer. Droog voorafgaand aan de DNA-extractie de monsters gedurende 30 tot 90 minuten bij 45 graden Celsius in een vacuümconcentratorapparaat, afhankelijk van de grootte van het weefsel. Vervolgens moet het droge weefsel worden verpletterd met een steriele plastic Pele om de genomische DNA te extraheren met behulp van een kit voor bodem-DNA-extractie.

Bepaal vervolgens de concentratie van het uiteindelijke elueerde DNA met behulp van een spectrofotometer. Verifieer een succesvolle extractie van de microbiële metagenomica DNA uit de darm van het insect door een diagnostische PCR-assay voor te bereiden met behulp van bacteriële algemene primers 27 F en 1, 492 R.Voor diagnose. Laat vijf microliter van elk PCR-product draaien op een 1% agrosgel bij 300 volt en 115 milliamp voor ongeveer 20 minuten.

De juiste grootte van de amplicons is 1,5 kilobase. Haal het geëxtraheerde DNA dat overeenkomt met elke experimentele replicaat samen. Hou die met en zonder C 13 glucose gescheiden.

Normaliseer de DNA-concentraties om ervoor te zorgen dat elke steekproef gelijk bijdraagt aan zijn pool. Een uiteindelijke concentratie van 500 tot 5.000 nanogram DNA is geschikt voor het ultracentrifugeerproces. Controleer de verwachte concentratie nogmaals met de spectrofotometer in een steriele 15 milliliter schroefdopbuis.

Stel het gradiëntmedium op. Combineer het gekwantificeerde DNA met 4,8 milliliter cesiumchloride-oplossing. Vul vervolgens het volume aan met zes milliliter gradiëntbuffer.

Breng de mengsels voorzichtig over in 5,1 milliliter ultracentrifugebuizen. Gebruik een spuit en naald om de buizen tot aan de basis van hun hals te vullen en vermijd het pompen of vormen van luchtbellen. Voeg bij elke run ten minste één lege gradiënt toe zonder DNA.

Om als referentiegradiënt te dienen, selecteer paren buizen en balanceer ze tot binnen 10 milligram. Breng een buisdop aan op elke buis en zorg ervoor dat ze lekvrij zijn door de buis om te draaien en matige druk met de hand uit te oefenen. Gebruik een bijna verticale rotor met acht putten.

Versluit de rotorputten voorzichtig en laad de rotor in de ultracentrifuge volgens de instructies van de fabrikant. Draai het DNA neer op 50.000 RPM bij 20 graden Celsius onder vacuüm