Name: Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer stamcellen programmeren voor therapeutische angiogenese met biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes. Deze methode gebruikt humane adipose-derived stamcellen en een murine achterpootischemiemodel om vasculaire endothelial growth factor overexpressie te bevorderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag American Heart Association Nationale Scientist Development Grant (10SDG2600001), Stanford Bio-X Interdisciplinair Initiative Program, en Stanford Medical Scholars Research Program erkennen voor financiering.

1. Polymeer Synthese <ol><li> In een zuurkast afgewogen 3523 mg butaandioldiacrylaat (C) en over te dragen aan een glazen scintillatieflesje met een roerstaafje. </li><li> Verwarm 5-amino-1-pentanol (32) tot 90 ° C om het zout oplosbaar dan in een zuurkast afgewogen 1.533 mg en 32 toevoegen scintillatieflesje met C. Deze methode resulteert in een molverhouding C: 32 = 1:1,2. </li><li> Plaats onmiddellijk de flacon met beide oplossingen op een roer plaat. Stel roer snelheid van 600 rpm. </li><li> Breng de scintillatieflesje een oven ingesteld op 90 ° C. Stel roersnelheid 1000 rpm gedurende 4 uur. Als de roerstaaf vast komt te zitten, hoe lager de snelheid. Na 4 uur, lagere snelheid 300 tpm en temperatuur van 90 ° C gedurende nog 12-16 uur. </li><li> Voeg 5 g C32 tot 10 ml watervrij tetrahydrofuran (THF) in een glazen scintillatieflesje met een roerstaafje. Wikkel in folie en vortex op hoog totdat volledig is opgelost. </li><li> In een aparte glazen scintillatieflesje containing een roerstaafje, voeg 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). Voeg 40 ml THF. </li><li> Plaats beide flacons (C32 en 122) op een roer plaat gedurende 5 minuten daarna samen te combineren. Bedek in folie en laat op kamertemperatuur roeren bij 400 rpm gedurende 24 uur. Het eindproduct wordt genoemd C32-122. </li><li> Weeg 5 x 50 ml Falcon buizen voor elk 5 g partij van C32-122. Let op de massa van elke buis in een notebook. </li><li> Overdracht 30 ml watervrije diethylether elk 50 ml Falcon buis. </li><li> Breng 10 ml C32-122 aan elk 50 ml Falcon buis. </li><li> Vortex Falcon buizen krachtig centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. Opmerking: De geëxtraheerde polymeer in de basis van de buis. </li><li> Gooi de bovenste oplossing en herhaal de stappen 1.9 en 1.11 twee keer. </li><li> Plaats de open buizen met geëxtraheerd C32-122 in de exsiccator en vacuüm &#39;s nachts. Zorg ervoor dat alle buizen worden beschermd tegen licht. </li><li> Weeg alle buisjes met C32-122 aan de uiteindelijke massa van de te bepalengeëxtraheerd polymeer. </li><li> Los het geëxtraheerde polymeer in watervrije DMSO bij een concentratie van 100 mg / ml. </li><li> Bewaar het opgeloste polymeer bij -20 ° C beschermd tegen licht en vocht. </li></ol> 2. Cel zaaien <ol><li> Grondlaag basis van een T-150 weefselkweekfles met 0,1% (gew / vol) gelatine. De gelatine moet de kolf nog gedurende 30-45 minuten. De gelatine coating helpt hechting van ADSCs. </li><li> Zuig gelatine uit de pre-gecoate T-150 kolf. </li><li> Voeg 4 x 10 6 ADSCs (≤ doorgang 3) aan de kolf in 20 ml DMEM dat 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 10 ng / ml bFGF. </li><li> Plaats de T-150 kolf in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende de nacht. </li><li> Begin transfectie procedure de volgende dag. </li></ol> 3. Nanodeeltjes Voorbereiding en transfectie <ol><li> De volgende procedure is voor de bereiding van nanodeeltjes bevattende 16,1 pg plasmide DNA per1,0 x 10 6 cellen in een polymeer gewichtsverhouding van 30:1 plasmide. </li><li> Verdun plasmide-DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) tot een eindconcentratie van 120 ug / ml natrium acetaat (25 mM) in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Verdun C32-122 (100 mg / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 3,6 mg / ml natrium acetaat (25 mM) in een tweede 15 ml Falcon buis. </li><li> Combineer de inhoud van elke Falcon buizen in een 15 ml Falcon buis en vortex onmiddellijk op hoog voor 10 sec. </li><li> Laat de buis op kamertemperatuur gedurende 10 minuten voor de nanodeeltjes vorming optreden. </li><li> Gedurende incubatie, vervangen medium in weefselkweek kolf met 7,8 ml volledig aangevuld DMEM per 1,0 x 10 6 cellen getransfecteerd. </li><li> Breng de nanodeeltjes oplossing voor de weefselkweek kolf en kantel hem naar voren en naar achteren om gelijkmatig verspreid. </li><li> Plaats de weefselkweek kolf in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 4 uur. </li><li> Na 2 uur, vervang de nanoparkel bevattende media met DMEM. </li><li> Na een verdere 2 uur incubatie bij 37 ° C, 5% CO2, de cellen klaar zijn voor in vivo injectie. </li></ol> 4. Achterbeen ischemie Procedure <ol><li> Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Stanford Universiteit Animal Care en gebruik Comite en goedgekeurd APLAC protocollen. Het genereren van het muizenmodel van achterbeen ischemie wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven. 8 Zie de referentie voor gedetailleerde instructies. Een korte beschrijving vindt u hieronder. </li><li> Plaats de muis onder verdoving met 1-3% isofluraan dosering bij inademing en zuurstof stroomsnelheid van 1 l / min. Zorgen narcose diepte door teen knijpen, vermindering van de ademhalingsfrequentie, en lethargie. </li><li> Haal haar uit de buikstreek en beide achterbeen gebieden van de muis met scheerschuim. </li><li> Maak insnijding in het midden van de mediale dij richting middellijn en vervolgens dwars door bedekkende vet pad naar exvormen de slagader. </li><li> Ligeren de slagader op twee locaties: distale plaats (dicht bij de knie) en proximale website (net distaal van de lies ligament). </li><li> Om de ligeringen maken, scheiden de slagader van de ader en draad een 5-0 zijden hechtdraad rond de slagader. Bind de slagader met twee knopen aan de ligatie te maken. </li><li> Verwijder de slagader tussen de twee punten ligatie. </li><li> Was het operatiegebied met PBS en vervolgens hechtdraad de incisie gesloten. </li><li> De anesthesie kan nu worden verwijderd. Houd de muis warm tot opnieuw ontwaken. Voor postoperatieve zorg kan 2-4 mg / kg lidocaïne subcutaan worden geïnjecteerd op de incisie voor hergebruik ontwaken. Verdere pijnbestrijding kunnen onderhuidse levering van 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine bij 12 en 24 uur. Bewaak de gezondheidstoestand van de muizen een keer per dag gedurende zeven dagen door het observeren van veranderingen in ademhaling, openlijke pijn of angst, en huidskleur. </li><li> Bevestig achterbeen ischemie door laser Doppler perfusie beeldvorming.</li></ol> 5. Cel Injecties <ol><li> Wanneer de getransfecteerde cellen en de muizen zijn klaar, wassen getransfecteerde cellen met PBS, trypsinize, centrifuge, en daarna tellen. </li><li> Resuspendeer cellen bij een dichtheid van 10 x 10 6 cellen per ml in PBS. </li><li> Celsuspensies worden gescheiden in afzonderlijke Eppendorf buizen met een volume van 110 pl. Dit zorgt ervoor dat elke muis ontvangt evenveel cellen. </li><li> Plaats elke muis onder verdoving (2,5% isofluraan, 1 L / min zuurstof debiet). </li><li> Reinig de injectieplaats met alcohol doekjes. </li><li> Met behulp van een 27 G tuberculinespuit, stellen de cellen op en neer in de spuit te zorgen voor een homogene suspensie is verkregen. Opstellen 100 pi van de celsuspensie volume in de spuit. </li><li> Injecteer de helft van de celsuspensie in de adductor regio en vervolgens injecteren de andere helft in de kuitspier regio. Bij het injecteren, laat de spuit in de plaats voor minstens 15-30 sec totlekkage van de celsuspensie voorkomen. </li><li> Juiste bediening van de dieren onderzoek zijn: 1) cellen getransfecteerd met een niet-coderend plasmide (bijvoorbeeld plasmiden zonder biologische activiteit), 2) alleen cellen, en 3) PBS. </li><li> Wanneer injecties zijn voltooid, verwijdert u de muis van anesthesie en warm te houden totdat de muis opnieuw Awakes. </li></ol> 6. Bioluminescentieweergave <ol><li> Om bioluminescentie imaging (BLI) beginnen, verdoven muizen zoals hierboven beschreven. </li><li> Reinig de injectieplaats met alcohol doekjes. </li><li> Gebruik makend insulinespuit, laadvermogen 100 ui 15 mg / ml D-luciferine (het substraat voor vuurvlieg luciferase). Houd substraat buurt van licht. </li><li> Om intraperitoneale injecties uit te voeren, houdt muizen door de huid van hun rug te trekken hun voorste huid strak. Breng de naald intraperitoneaal in de buikstreek en injecteer 100 ul van substraat. </li><li> Plaats de muis in de IVIS luciferase imaging kamer onder verdoving. </li><li&gt; Afbeelding de muizen met een belichtingstijd van 1.0 minuten. Bij de parametrering, beginnen om beelden te verwerven. </li><li> Wanneer het beeld wordt verkregen, markeren de regio van belang zijn voor de luciferase signaal te meten. In dit geval, markeer de ischemische ledematen in de mobiele injectieplaats. </li><li> Blijf de luciferase signaal meten elke 3-5 min, totdat het signaal bereikt een piek en begint te dalen. Dit is de waarde gebruikt voor vergelijking tussen muizen en over verschillende tijdstippen. </li><li> Als het klaar is, verwijder dan de muizen uit de kamer en anesthesie. Blijf muizen warm tot opnieuw ontwaken. </li></ol> 7. Laser Doppler Perfusie <ol><li> Laser Doppler perfusie beeldvorming wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven. 8 De procedure wordt hier kort beschreven. </li><li> Voorafgaand aan Doppler de muis moet netjes geschoren zijn op de gebieden bovenliggende beide achterpoten en de buikstreek te artefact voorkomen dat ze door haar. </li><li> Wanneer bereid afbeelding Doppler, de mouse worden verdoofd zoals boven beschreven. </li><li> Verwarm de muis tot 36 ° C op een hete plaat, terwijl controle van de lichaamstemperatuur door rectale thermometer. </li><li> Plaats de muis op een niet-reflecterende zwarte oppervlak en houd verdoofd door neuskegel. De muis dient op zijn rug oppervlak worden geplaatst met zijn ledematen gelijkmatig blootgesteld. </li><li> Plaats de laser Doppler sensor ongeveer 15 cm boven de muis en leiden van de laserstraal van de sensor naar de liezen van de muis. </li><li> Wanneer de muis en de Doppler sensor in positie zijn, kunnen beelden worden gemaakt met behulp van de LDPIwin software door op de Start-knop. </li><li> Relatieve perfusiemetingen kunnen worden genomen door het aangeven van beide achterpoten (ischemische en niet-ischemische) als regio van belang (ROI). De verhouding van de gemiddelde perfusie van ischemisch de niet-ischemische achterpoot zal relatief perfusie geven. </li></ol> 8. Tissue Harvest Procedure <ol><li> Wanneer bereid oogst muis tisaanklagen voor histologie en / of biochemische processen, moet de muis worden gedood. Hier wordt de muis gedood door blootstelling aan 5% isofluraan gedurende 3-5 min, vervolgens euthanasie de muis door cervicale dislocatie. </li><li> Snijd de bovenliggende huid rond de omtrek achterbeen aan het distale abdominale gebied en proximaal van het achterbeen. De huid wordt gesneden uit de ventrale naar de dorsale oppervlakken, zodat de huid kan worden teruggetrokken via achterbeen aan de voet. </li><li> Bij het trekken van de huid weer, kon het ledemaat worden geamputeerd door gebruik te maken van stompe dissectie schaar te knippen bij het bekken en dijbeen gewricht. </li><li> Twee belangrijke weefsels worden genomen voor analyse: de mediale adductoren en de gastrocnemius spieren. </li><li> Voor histologie, insluiten een of beide weefsels in optimale snijtemperatuur (oktober) voor cryosectioning. </li><li> Voor biochemische analyse, verzamel een of beide weefsels in een 1,5 ml Eppendorf en onderdompelen in een bad van vloeibare stikstof gedurende ten minste 2 minuten. De monsters kunnen wordenbewaard bij -80 ° C voor verdere verwerking. </li></ol>

<ol><li>Deveza, L., Choi, J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+for+treating+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis for treating cardiovascular diseases.</a> Theranostics. 2, 801-814 (2012).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+stem+cells+for+enhanced+angiogenesis+using+biodegradable+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3317-3322 (2010).</li>
<li>Mangi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+modified+with+Akt+prevent+remodeling+and+restore+performance+of+infarcted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts.</a> Nat Med. 9, 1195-1201 (2003).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+bone+healing+based+on+ex+vivo+gene+therapy+using+human+muscle-derived+cells+expressing+bone+morphogenetic+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhancement of bone healing based on ex vivo gene therapy using human muscle-derived cells expressing bone morphogenetic protein 2.</a> Hum. Gene Ther. 13, 1201-1211 (2002).</li>
<li>Park, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+may+be+uniquely+suited+for+combined+gene+therapy+and+cell+replacement%3A+Evidence+from+engraftment+of+Neurotrophin-3-expressing+stem+cells+in+hypoxic-ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells may be uniquely suited for combined gene therapy and cell replacement: Evidence from engraftment of Neurotrophin-3-expressing stem cells in hypoxic-ischemic brain injury.</a> Exp. Neurol. 199, 179-190 (2006).</li>
<li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Acc Chem Res. 41, 749-759 (2008).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+human+adult+and+embryonic+cell-derived+stem+cells+using+biodegradable+nanoparticulate+polymeric+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to human adult and embryonic cell-derived stem cells using biodegradable nanoparticulate polymeric vectors.</a> Gene Ther. 16, 533-546 (2009).</li>
<li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> J. Vis. Exp. , e1035(2009).</li>
<li>Ceradini, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+trafficking+is+regulated+by+hypoxic+gradients+through+HIF-1+induction+of+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1.</a> Nat. Med. 10, 858-864 (2004).</li>
<li>Kidd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+mesenchymal+stem+cell+tropism+for+tumor+and+wounding+microenvironments+using+in+vivo+bioluminescent+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging.</a> Stem Cells. 27, 2614-2623 (2009).</li>
<li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+end-groups+of+linear+polymer+determine+cell-type+gene-delivery+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small-molecule end-groups of linear polymer determine cell-type gene-delivery efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947-4951 (2009).</li>
<li>Sunshine, J. C., Akanda, M. I., Li, D., Kozielski, K. L., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+base+polymer+hydrophobicity+and+end-group+modification+on+polymeric+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Effects of base polymer hydrophobicity and end-group modification on polymeric gene delivery.</a> Biomacromolecules. 12, 3592-3600 (2011).</li>
<li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+poly%28%CE%B2-amino+esters%29%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+self-assembly+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Degradable poly(β-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li>
<li>Eltoukhy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+weight+of+amine+end-modified+poly%28beta-amino+ester%29s+on+gene+delivery+efficiency+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular weight of amine end-modified poly(beta-amino ester)s on gene delivery efficiency and toxicity.</a> Biomaterials. 33, 3594-3603 (2012).</li>
<li>Glover, D. J., Lipps, H. J., Jans, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+safe%2C+non-viral+therapeutic+gene+expression+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in humans.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 299-310 (2005).</li>
<li>Dave, U. P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+insertional+mutagenesis+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene therapy insertional mutagenesis insights.</a> Science. 303, 333(2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier melden wij een methode om volwassen stamcellen programmeren therapeutische factoren overexpressie behulp van niet-virale, biologisch afbreekbare nanodeeltjes. Dit platform is bijzonder bruikbaar voor het behandelen van ziekten waarbij stamcellen kan natuurlijk huis, zoals ischemie en kanker. 9-10 In de non-virale gentherapie platform biedt voor transiënte overexpressie van therapeutische factoren, die geschikt is voor de meeste weefselregeneratie en wond genezingsproces. De transfectie proces afhankelijk...

Het algemene doel van deze techniek is om therapeutische angiogenese met niet-viraal geprogrammeerde stamcellen overexpressie therapeutische factoren op de plaats van ischemie. Stamcellen werden gewijzigd ex vivo eerste gebruik van biologisch afbreekbare nanodeeltjes gesynthetiseerd in het lab, en vervolgens getransplanteerd in een muizenmodel van achterbeen ischemie om hun potentieel te valideren voor het verbeteren van angiogenese en weefsel berging. Gecontroleerde vasculaire groei een belangrijk onderdeel van succesvolle weefselregeneratie, en voor behandeling van verschillende ziekten zoals ischemische beroerte, ischemie en myocardiaal infarct. Verscheidene strategieën zijn ontwikkeld om vasculaire groei, inclusief groeifactor productietijd en celtherapie te bevorderen. 1 Ondanks de werkzaamheid waargenomen in de dierlijke ziektemodellen, deze werkwijzen ondervinden nog steeds beperkingen, zoals de noodzaak van suprafysiologische doses groeifactor levering of onvoldoende paracrinevrijgeven cellen alleen. Een mogelijke strategie om de bovenstaande beperkingen te overwinnen is om stamcellen en gentherapie, waarbij stamcellen genetisch geprogrammeerd ex vivo voorafgaand aan transplantatie om gewenste therapeutische factoren overexpressie te combineren. Deze aanpak is aangetoond in diverse modellen, waaronder de ziekte van achterbeen ischemie 2, hart-en vaatziekten 3, botgenezing 4 en neurale verwonding 5, enz. De meeste gentherapietechnieken afhankelijk virale vectoren, die worden geassocieerd met veiligheidsproblemen als potentiële immunogeniciteit en insertie mutagenese. Biomaterialen gemedieerde non-virale gentherapie kunnen deze beperkingen te overwinnen, maar vaak last van lage transfectie-efficiëntie. Om het tempo van de ontdekking van nieuwe biomaterialen voor efficiënte niet-virale gentherapie, hebben recente studies combinatorische chemie en high-throughput screening aanpak toegepast. Biologisch afbreekbaar polymeer bibliotheken zoals poly (β-amino esters) (PBAE) ontwikkeld en gescreend, wat leidde tot de ontdekking van leidende polymeren met sterk verbeterde transfectie-efficiëntie in vergelijking met de conventionele vector polymere tegenhangers. 6-7 Hierin beschrijven we de synthese van PBAE en verificatie van hun vermogen om vet-afgeleide stamcellen (ADSCs) transfecteren in vitro, gevolgd door daaropvolgende transplantatie van genetisch gemodificeerde ADSCs overexpressie vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in een muizenmodel van ischemie achterbeen . De uitkomsten werden geëvalueerd door het bijhouden lot van de cel met behulp van bioluminescentie beeldvorming, het beoordelen van weefsel reperfusie met behulp van laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI), en het bepalen van angiogenese en weefsel berging door histologie.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td>Acronym: C</td></tr><tr><td>5-amino-1-pentanol (97 %)</td><td>Alfa Aesar</td><td>2508-29-4</td><td>Acronym: 32</td></tr><tr><td>Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)</td><td>Molecular Biosciences</td><td>17774</td><td>Acronym: 122</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>G-Biosciences</td><td>R010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO Anhydrous (>99.9 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-Mouse CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr></tbody></table>

programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Gecontroleerde vasculaire groei is cruciaal voor een succesvolle weefselregeneratie en wondgenezing, alsmede voor de behandeling van ischemische ziekten zoals beroerte, hartaanval of perifere arteriële aandoeningen. Directe levering van angiogene groeifactoren heeft het potentieel om groei van nieuwe bloedvaten te stimuleren, maar wordt vaak geassocieerd met beperkingen zoals gebrek aan targeting en korte halfwaardetijd in vivo. Gentherapie biedt een andere kijk door het leveren van genen die coderen voor angiogene factoren, maar vereist vaak met behulp van virus, en wordt beperkt door bezorgdheid over de veiligheid. Hier beschrijven we een recent ontwikkelde strategie voor het bevorderen van vasculaire groei door het programmeren stamcellen angiogene factoren overexpressie in situ gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes. Specifiek onze strategie gebruikt stamcellen bestelwagens door te profiteren van hun vermogen om te migreren naar ischemische weefsels in vivo. De geoptimaliseerde polymère vectoren, vet-afgeleidestamcellen werden gewijzigd om een ​​angiogene gen dat vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) overexpressie. We beschreven werkwijzen voor de polymere synthese, vorming van het nanodeeltje transfectie stamcellen in vitro, alsook werkwijzen voor het valideren van de werkzaamheid van VEGF expressie stamcellen voor het bevorderen van angiogenese in muizen achterbeen ischemie model.

Na mengen, de positief geladen polymeer (C32-122) en negatief geladen DNA plasmide zichzelf assembleert in nanodeeltjes. Vorming van het nanodeeltje kan worden bevestigd door middel van elektroforese analyse dwz de complexvorming tussen C32-122 en plasmide-DNA wordt voorkomen dat de mobilisatie van het DNA tijdens de elektroforese. Het polymeer dient als een transfectie reagens om verbeterde opname van DNA in de doelcellen en de daaropvolgende expressie van coderend voor eiwitten (Figuur 2) te ...

We beschrijven de manier van programmeren stamcellen therapeutische angiogenese factoren overexpressie bioafbreekbare polymere nanodeeltjes. Beschreven processen omvatten polymeersynthese, transfecteren vet-afgeleide stamcellen in vitro, en valideren van de werkzaamheid van geprogrammeerde stamcellen om angiogenese te bevorderen in een muizen achterbeen ischemie model.

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van het gebruik van polymere nanodeeltjes voor de overexpressie van therapeutische genen in stamcellen met behulp van een marien model van ischemie in de achterste ledemaat. Dit wordt bereikt door eerst biologisch afbreekbare polymeren te synthetiseren via een tweestaps mic-additiereactie, gevolgd door het vervaardigen van polymere nanodeeltjes die therapeutische genen coderen. De tweede stap is het in vitro transfecteren van humane uit vetweefsel afgeleide stamcellen om vasculaire endotheliale groeifactor te overexpresseren.Vervolgens worden de geprogrammeerde stamcellen intramusculair geïnjecteerd in een ischemisch achterpoot voor de productie van therapeutische factoren. De laatste stap is om de overleving van cellen en de reperfusie van bloed in het ischemische ledemaat in de loop van de tijd te monitoren met behulp van bioluminescentie-imaging en laser-doppler-imaging. Ten slotte kunnen kwantitatieve genexpressie en histologie worden uitgevoerd om de gelokaliseerde expressie van therapeutische factoren en de effectiviteit van weefselregeneratie aan te tonen.Het voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele me

programming-stem-cells-for-therapeutic-angiogenesis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De chirurgische procedure voor de levering van embryonale stamcel-afgeleide endotheelcellen van de ischemische achterbeen is aangetoond, met niet-invasieve tracking door bioluminescentie imaging.

Embryonale stamcellen afgeleide endotheelcellen voor de behandeling van ischemie achterbeen

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Dit manuscript beschrijft de efficiënte, niet-virale aflevering van miR aan endotheelcellen door een PEI / MNP vector en de magnetisatie. Dus behalve genetische modificatie, deze benadering voor magnetische cellen leiding en MRI detecteerbaarheid. De techniek kan worden gebruikt om de kenmerken van de therapeutische cel producten te verbeteren.

voorbereiding en<em&gt; In Vitro</em&gt; Karakterisering van Magnetische miR-gemodificeerde endotheelcellen

Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.

Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Wij beschrijven een chirurgische procedure die wordt gebruikt om perifere ischemie in konijnen met hyperlipidemie en diabetes te veroorzaken. Deze operatie fungeert als een preklinisch model voor aandoeningen ervaren in perifeer vaatlijden bij patiënten. Angiografie wordt ook beschreven als een middel om de omvang van de geïntroduceerde ischemie en het herstel van de doorbloeding te meten.

Preklinisch model van de achterste ledematen ischemie bij diabetische konijnen

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Dit artikel presenteert een protocol voor de nauwkeurige echogeleide afgifte van vasculaire stamcellen aan de aortavaatwand. De techniek richt zich effectief op de vaatwand en bevordert vasculair herstel bij aorta-aneurysma's en dissecties.

Precisie-echogeleide stamcelafgifte voor vasculair herstel bij aortaaandoeningen

Leer stamcellen programmeren voor therapeutische angiogenese met biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes. Deze methode gebruikt humane adipose-derived stamcellen en een murine achterpootischemiemodel om vasculaire endothelial growth factor overexpressie te bevorderen.

Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Meer video's verkennen