Programmeren stamcellen voor therapeutische angiogenese gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van polymere nanodeeltjes te demonstreren voor de overexpressie van therapeutische genen in stamcellen met behulp van een ischemiemodel van de achterste ledematen van een zeevis. Dit wordt bereikt door eerst biodegradeerbare polymeren te synthetiseren via een tweestaps mic-editiereactie, gevolgd door het maken van polymere nanodeeltjes die therapeutische genen coderen. De tweede stap is het transfecteren van humane vetafgeleide stamcellen in vitro om vaatendotheelgroeifactor over te expresseren.

Vervolgens worden geprogrammeerde stamcellen intramusculair geïnjecteerd in een ischemische achterste ledemaat voor NC twee productie van therapeutische factoren. De laatste stap is het monitoren van celoverleving en bloedreperfusie in het ischemische ledemaat in de loop van de tijd met behulp van bioluminescentie-imaging en laserdoppler-imaging. Uiteindelijk kunnen kwantitatieve genexpressie en histologie worden uitgevoerd om gelokaliseerde expressie van therapeutische factoren en de effectiviteit van weefselregeneratie te laten zien.

Het voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele methoden voor angiogenesis is het gebruik van stamcellen als voertuigen voor geneesmiddelafgifte. Deze strategie stelt ons in staat om de natuurlijke neiging van stamcellen te gebruiken om naar ischemie te migreren, en maakt ook dynamische reacties op micro-omgevingssignalen mogelijk. De nanodeeltjes die worden gebruikt voor plasma-DNA-afgifte zijn zeer efficiënt en biodegradeerbaar, wat zorgt voor een lagere cytotoxiciteit en een groter aantal intracellulair afgeleverde DNA-kopieën.

Deze techniek kan worden toegepast op veel klinisch relevante cel-gebaseerde therapeutischa omdat het een biodegradeerbare niet-virale vector gebruikt om genen in autologe cellen in te voegen. Werk in een afzuigkap, weeg de butaan diaal DLI af en breng het materiaal over in een glazen inhalatieflacon met een roerbare stok. Voeg vervolgens voorverwarmde vijf amino één pentol toe aan dezelfde flacon. Plaats de flacon onmiddellijk op een roerplaat en stel de snelheid in op 600 RPM.

Breng de flacon over in een oven op 90 graden Celsius en verhoog de roersnelheid na vier uur tot 1000 RPM, verlaag de snelheid tot 300 RPM en roer gedurende nog eens 12 tot 16 uur. Wanneer u klaar bent, voegt u 10 milliliter anhydrous tetra hydro uran toe aan vijf gram C 32 in een glazen flacon met een roerbare stok. Na het inwikkelen in folie, vortex op hoog totdat het volledig is opgelost in een aparte glazen flacon met een roerbare stok, voegt u 10 millimolair tetra ethyleen glycol diamine toe.

Voeg 40 milliliter THF toe aan deze flacon, plaats beide flacons gedurende vijf minuten op een roerplaat voordat u ze combineert. Bedek het resulterende in folie en laat het op kamertemperatuur staan gedurende 24 uur. Het eindproduct wordt C 32 1 22 genoemd.

Breng vervolgens 30 milliliter anhydrous dathyl ether over in elk van de vijf 50 milliliter falconbuisjes. Nadat C 32 1 22 aan anhydrous dyl ether is toegevoegd, vormt zich een wit troebele oplossing, vortex de buis en centrifugeer deze vervolgens. Het geëxtraheerde polymeer zal zich aan de basis van de buis verzamelen, gooi de bovenste oplossing weg en herhaal deze stappen nog twee keer.

Na extractie plaatst u de open buisjes in de drooggekoelde en vacuüm over nacht, zorg ervoor dat de buisjes tegen licht worden beschermd. De volgende dag weegt u de buisjes met C 32 1 22 om de uiteindelijke massa te bepalen. Los tenslotte het geëxtraheerde polymeer op in anhydrous DMSO met een concentratie van 100 milligram per milliliter.

Voor de bereiding van nanodeeltjes. Verdun eerst plasma-DNA tot een uiteindelijke concentratie van 120 microgram per milliliter in natriumacetaat in een tweede buis. Verdun C 32 1 22 tot een uiteindelijke concentratie van 3,6 milligram per milliliter. Combineer de inhoud van elke buis in een enkele 15 milliliter Falcon-buis en vortex onmiddellijk op hoog gedurende 10 seconden.

Laat de buis gedurende 10 minuten op kamertemperatuur staan om nanodeeltjevorming te laten plaatsvinden terwijl de nanodeeltjes zich vormen. Vervang het medium in een eerder geplaatste weefselkweekflacon met 7,8 milliliter volledig gesupplementeerd DMEM.

Breng de nanodeeltjesoplossing over naar de weefselkweekflacon en spreid deze gelijkmatig voordat u deze in de incubator plaatst. Na twee uur vervangt u het nanodeeltjesbevattende medium door DMEM. Na vier uur zijn de cellen klaar voor in vivo-injectie.

Wanneer de getransfecteerde cellen klaar zijn, telt u de cellen bij een dichtheid van 10 maal 10 van de zes cellen per milliliter in PBS om ervoor te zorgen dat elke muis een gelijke hoeveelheid ontvangt. Scheid de celsuspensies in einor-buisjes bij een volume van 110 microliter. Anesthesiceer vervolgens een muis die eerder hindlimbischemie heeft ondergaan.

Nadat de anesthesie is bevestigd door een teenprik, maak de injectieplaats schoon met een naald van 27 gauge. Resuspendeer de cellen en trek 100 microliter van de suspensie op. Injecteer de helft van de celsuspensie in de adductorspierregio en injecteer vervolgens de andere helft in de kuitspierregio.

Na het injecteren, laat u de spuit minimaal 15 tot 30 seconden op zijn plaats om lekkage te voorkomen. Wanneer de injecties zijn voltooid, houdt u het dier warm tot het volledig is hersteld. Voor bioluminescentie-imaging bevestigt u de anesthesie met een teenprik en maakt u vervolgens de injectieplaats schoon zoals eerder getoond.

Vul een insulinespuit met 100 microliter Lucifer en injecteer deze intraperitoneaal. Voordat u het dier in de ivus Luciferase-beeldvormingskamer plaatst, beeldt u de muizen af met een belichtingstijd van één minuut. Wanneer het beeld is verkregen, markeert u het gebied van belang.

In dit geval gaat u door met het meten van het luciferasesignaal om de drie tot vijf minute