Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D ¹H NMR

Het algemene doel van deze procedure is om de structuur van een metallochaperon-eiwitmimetisch peptidecomplex met koper te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de monster voor te bereiden in een zuurstofvrije omgeving. De tweede stap is het verkrijgen van de kernspinresonantie of NMR-spectroscopiegegevens die interacties tussen waterstofatomen laten zien.

Vervolgens worden de ruimtelijke interacties gekarteerd op een lineair peptidemodel. De laatste stap is het vinden van een representatieve laagenergetische structuur die past bij de gegevens. Uiteindelijk worden door NMR afgeleide structuren gebruikt om de bindingsmodus te bepalen en om structurele analyse uit te voeren op het kopergebonden complex.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande technieken zoals röntgenkristallografie, is dat je het kunt gebruiken om zwak bindende complexen te bekijken en ook voor moleculen en complexen die niet kristalliseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in koperbindende eiwitten. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals andere metaalchaps om te bestuderen hoe eiwitten de veilige afgifte van essentiële, maar potentieel giftige metaalionen in de cellijnomgeving mogelijk maken.

Om te beginnen, bereidt u monsters voor in een zuurstofvrije omgeving om te voorkomen dat het koper oxideert. Om het APO-monster voor te bereiden, lost u ongeveer een tot twee milligram van het peptide op in 450 tot 500 microliters gedeutereerd NMR-kwaliteitsoplosmiddel voor het met koper gereacteerde monster, lost u dezelfde hoeveelheid op als het APO-peptide met een EQU-molaar equivalent aan metaalzout in 450 tot 500. Microliters van het NMR-oplosmiddel. Filter elke oplossing met behulp van een centraal glasfiltraatpapier of een andere techniek die geschikt is voor de onderzochte verbindingen en ze niet absorbeert. Dit is essentieel om eventuele metaaldeeltjes te verwijderen, die de homogeniteit zullen beïnvloeden.

Breng de oplossingen over naar NMR-buisjes en sluit de monsters in de buisjes. Voordat u de handschoenenkast verlaat, haalt u de monsters uit de handschoenenkast en verzegelt u ze. Neem het eendimensionale protonenspectrum van de APO- en met koper gereacteerde monsters op in de NMR-machine en vergelijk deze.

Het APO-peptide is flexibel en vertoont een gemiddelde bevestiging, maar na reactie met koper hebben de gebonden peptideamiden een stiferdere structuur. Daarom zou het koperhoudende peptidespectrum een significante verandering in de chemische verschuiving in het amidegebied moeten vertonen, en de pieken kunnen worden opgelost. Stel geoptimaliseerde, cozy tox, nosy of rosy NMR-experimenten in onder identieke omstandigheden zoals beschreven in het tekstprotocol en voer ze in volgorde uit.

Voer eendimensionale experimenten uit tussen elk experiment in om ervoor te zorgen dat de monstersamenstelling constant blijft tijdens de gegevensverwerving. Nadat u de gegevens hebt verwerkt zoals besproken in het tekstprotocol, bereidt u een set van cozy en to spectra voor die op de noea- en rosy-spectrum worden geplaatst. Om alle NOE-pieken in het spectrum toe te wijzen.

Begin met het toewijzen van pieken die overlappen toxis-signalen in het vingerafdrukgebied. Omdat dit de toekomstige piektoewijzingsvermeldingen met het Sparky-programma zal vergemakkelijken, neemt u de toegewezen pieken op, vertaalt u H alfa naar amide-eiwitkoppelingswaarden in dedal-hoeken. Vertaal ook pieken in afstandsbeperkingen door de pieken binnen het programma te integreren en ze te vertalen met behulp van een interactie van bekende afstand.

Als de pieken overlappen of automatische integratiemethoden niet kunnen worden gebruikt, kunnen de pieken worden gelabeld als sterk, medium, zwak of zeer zwak door visuele schatting, en deze aanduidingen kunnen worden vertaald in afstanden tot 2,5, 3,5, 4,5 en 5,5 ångström respectievelijk. Importeer de afstandsbeperkingen en dedal-hoeken met het juiste formaat voor explorer. Explorer zal de conformationele ruimte doorzoeken om structuren te vinden die voldoen aan de canonische chemische geometrie.

Naast de experimenteel gevonden afstandsbeperkingen om een ensemble te genereren waarin geen van deze parameters wordt geschonden. Dit zal het startensemble vormen. Voer de eerste structuurbepaling uit zonder gebruik te maken van enige beperkingen voor het metaal om te achterhalen welke residuen deelnemen aan metaalbinding zonder enige vooringenomenheid.

Introduceer de beperkingen geleidelijk om fouten in de toewijzing te identificeren, evenals NOE-energie en gesimuleerde knielingsparameters zoals beschreven in het tekstprotocol voordat u de structuren minimaliseert met behulp van conjugaatgradiëntenergieminimalisatie gedurende 4.000 iteraties, creëer een laatste ensemble van gewoonlijk 50 leden door de introductie van beperkingen in een iteratieve wijze op het hele ensemble te rapporteren het aantal van elk type NOE-interactie dat wordt gevonden. Maak tenslotte een ensemble van structuren die voldoen aan de canonieke chemische geometrie en de empirische NMR-afgeleide beperkingen. Rapporteer het totale aantal bevestigingen, het aantal daarvan dat schendingen van de NMR-afgeleide beperkingen heeft en de RMSD van het hele ensemble, inclusief zowel ruggengraat als alle zware atoom RMSD-waarden.

Analyseer het laagenergetische ensemble en bepaal welke residudezijketens in de juiste nabijheid tot elkaar zijn om het metaalioon te kunnen binden. Zodra deze zijn bepaald, herhaalt u de analyse, inclusief de koperbindende gegevens. Voeg naast de NMR-afgeleide afstandsbeperkingen nu metaalbindende beperkingen toe aan de bepaalde residuen.

Voeg geschikte parameters toe om het metaalioon en zijn topologie te beschrijven. Voer de juiste fysische informatie in, zoals massabondenlengten met andere atomen, hoeken en niet-bindende afstotingsparameters in het parameterbestand. Voeg de bindingsinformatie toe aan het topologiebestand.

Deze informatie omvat welke bindingen worden gevormd en gebroken en welke formele ladingen worden gewijzigd als gevolg van binding. Verkrijg tenslotte een ensemble van structuren zoals eerder, de opgeloste ensemble vertegenwoordigt de conformationele ruimte die door het peptide wordt geadopteerd. Tijdens de NMR-meting importeert u alle bevestigingen van de structuur naar het Mal Mall-programma om een startensemble te maken.