Name: Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Leer de structuur van koper-gebonden metallochaperone-peptiden bepalen met 1D en 2D 1H NMR-spectroscopie. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van bindingsmodi en moleculaire interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het Human Frontier Science Program (Young investigator grant (RGY)0068-2006) voor de financiële ondersteuning.

1. Bereiding van het monster
<ol>
	<li>Apo-monster: Los ongeveer 1-2 mg van het peptide op in 450-500 µl van gedeutereerd oplossingsmiddel van NMR-kwaliteit (de voorkeursoplossingen voor biologische monsters zijn 10% D2O in water of d6-DMSO11-12 als het monster zich niet in water oplost of ermee reageert).</li>
	<li>Koper-reactiemonster: Los ongeveer 1-2 mg van het peptide op met een equimolaire hoeveelheid metaalzout in 450-500 µl van het NMR-oplosmiddel.</li>
	<li>Filter de oplossing met een sinterglas, filtratiepapier of een andere techniek die geschikt is voor de onderzochte verbindingen en deze niet absorbeert. Dit is essentieel om eventuele metaaldeeltjes te verwijderen, wat de homogeniteit zal beïnvloeden.</li>
	<li>Breng de oplossing over naar een NMR-buis en sluit deze. Zorg ervoor dat de kwaliteit van de buis past bij de gebruikte magneetsterkte (zie voor meer details de apparatuurtabel).</li>
	<li>Als het monster gevoelig is voor zuurstof, moeten deze stappen worden uitgevoerd in een inerte omgeving en moet de buis worden afgedicht om oxidatie te voorkomen.</li>
</ol>
2. Verzameling en verwerking van NMR-gegevens13
<ol>
	<li>Neem 1D 1H spectra op van de apo- en koper-reactiemonsters en vergelijk. Het koperhoudende peptidespectrum moet een significante verandering van chemische verschuiving in het amidegebied vertonen en de pieken worden opgelost, aangezien het apo-peptide flexibel is en een gemiddelde van conformatieën vertoont, maar bij reactie met koper, hebben de gebonden-peptide amiden een enkele structuur (Figuur 2).
	<ol>
		<li>Als het spectrum onveranderd is, wordt aangenomen dat de reactie is mislukt.</li>
		<li>Als het monster groen wordt, zal het koper in de atmosfeer zijn geoxideerd, wat de bindingseigenschappen kan veranderen.</li>
		<li>In beide gevallen moet het monster opnieuw worden gemaakt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bepaal optimale temperatuuromstandigheden voor de NMR-metingen die een minimale overlapping van de amideresiduen met smalle lijnbreedtes geven.</li>
	<li>Stel COSY14, TOCSY15 en NOESY16 of ROESY17 NMR-experimenten in onder identieke omstandigheden (temperatuur, pH, etc.) en voer ze in volgorde uit.
	<ol>
		<li>COSY (Figuur 3) en TOCSY (Figuur 4) experimenten zullen door-binding interacties detecteren van aangrenzende en langere bereik buur-proton-proton interacties, respectievelijk. COSY-spectrum geeft informatie over HN-Hα correlaties terwijl TOCSY-spectrum, naast informatie over HN en andere H alifatische protonen van gecorreleerde residuen, geeft.</li>
		<li>NOESY en ROESY (Figuur 5) experimenten detecteren door-ruimte nabijheid zonder afhankelijkheid van bindingen om structurele informatie te geven. De keuze tussen de twee is afhankelijk van de effectieve grootte van de verbinding en de veldsterkte. Sommige combinaties geven theoretisch nul signalen (Figuur 6) en een ROESY-experiment moet worden uitgevoerd om NOE-interacties10,18 te detecteren.</li>
		<li>Als het monster in water is, moeten de experimenten een component van watersuppressie hebben. Dit wordt het meest efficiënt bereikt met gradiënten19. In dit geval is het voordelig om het monster, eenmaal toegewezen, in zuiver D2O opnieuw te lopen om interacties met en tussen de Hα waterstofs te verkrijgen.</li>
		<li>Optimaliseer de duur van de TOCSY- en NOESY of ROESY-mengtijd door een aantal korte experimenten uit te voeren om maximale signaalaccumulatie te vinden met minimale verliezen door spin-diffusie. Zorg ervoor dat dit het lineaire gebied van de opbouwcurve is. Waarden die gebruikelijk zijn voor peptiden bij 600 MHz-velden omvatten mengtijd van ongeveer 100 msec voor TOCSY en 150 msec voor NOESY of ROESY-experimenten.</li>
		<li>Voer 1D-experimenten uit tussen elke experiment om ervoor te zorgen dat de samenstelling van het monster constant blijft tijdens de gegevensverwerving (Figuur 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwerk de spectra met behulp van geschikte apodisatiefuncties om maximale resolutie te verkrijgen met minimale verlies van signaalsterkte, en voeg nulvulling toe in de t1-dimensie.
	<ol>
		<li>Corrigeer verder de baseline in de F2 en vervolgens F1-dimensie met een kwadratische polynoomfunctie.</li>
		<li>Calibreer de chemische verschuiving van de spectra zorgvuldig volgens de resterende water- of DMSO-pieken in de respectieve oplosmiddelen volgens hun verschuiving vanaf bekende standaarden (TMSP of TMS, respectievelijk).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Toewijzing van pieken en integratie met behulp van SPARKY20
<ol>
	<li>Maak een set COSY- en TOCSY-spectra die op het NOESY of ROESY-spectrum zijn geplaatst (Figuur 8).</li>
	<li>Wijs alle NOE-pieken in het spectrum toe volgens de volgorde van toewijzing die is ontwikkeld door Wüthrich21.
	<ol>
		<li>Begin met het toewijzen van pieken die overlappen met TOCSY-signalen in het vingerafdrukgebied, omdat dit de volgende toewijzing van pieken met het SPARKY-programma vergemakkelijkt (Figuur 9). Registreer de toewijzingschemisch verschuiving (Figuur 10), en 3JHNHα waarden (Figuur 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vertaal pieken naar afstandbeperkingen en 3JHNHα waarden naar diëderhoeken.
	<ol>
		<li>Dit kan worden

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De bijdrage van structurele informatie om bindingsmechanismen te begrijpen, wordt algemeen aanvaard. Peptiden zijn nuttig als modellen voor eiwitbinding en -interacties; echter zijn ze niet geschikt voor de belangrijkste methode voor structuurbepaling, röntgenkristallografie. NMR is bijzonder nuttig voor deze systemen, aangezien de structuren gemakkelijk in oplossing kunnen worden opgelost. Dit is vooral het geval voor metallochaperone-mimetica die bovendien structuurbepaling onder een inerte omgeving vereisen om oxidati...

Peptiden worden veel gebruikt als eiwitmodellen, potentiële medicijnkandidaten en therapeutische middelen op zichzelf. Hun kleine omvang en hoge mate van flexibiliteit bemoeilijken echter vaak de structuurbepaling door middel van röntgenstralen vanwege problemen met kristallisatie.
Kernspinresonantie (NMR) kan worden gebruikt om peptidestructuren en interacties te bepalen. De methode kan informatie geven over lokale en algehele structuur, binding en interacties met lagere affiniteit, en is toepasbaar op moeilijke monsters omdat het in de oplossing kan worden gedaan.
Kopertransport in biologische systemen wordt bereikt door intracellulaire koper-metallochaperone-eiwitten die specifiek Cu (I)-ionen binden en deze via een reeks eiwit-eiwit-interacties naar hun doeleiwitten brengen om de ionen te beschermen tegen oxidatie en de afgifte van toxisch koper2-5 te voorkomen. De bindingsplaats wordt gekenmerkt door de geconserveerde sequentie, MXH/TCXanyXanyC, waarvan is aangetoond dat deze zowel door NMR als door kristallografie het Cu (I) bindt via de zachte thiolato-liganden van de twee cysteïnewetjes, hoewel ook een extra externe ligand is voorgesteld6-8. De structuur-functierelatie van deze eiwitten is een onderwerp van intensief onderzoek9.
In de hier gepresenteerde studie werd een peptidemodel gesynthetiseerd dat de geconserveerde sequentie van koper-metallochaperones omvat en werd gereageerd met Cu (I) onder een inert milieu. Het gepresenteerde protocol beschrijft de stappen van structuurbepaling door NMR, inclusief monstervoorbereiding, dataverzameling, dataverwerking, structuurgeneratie en structurele analyse. De analyse werd in twee stappen uitgevoerd: eerst werden structuren gegenereerd zonder informatie over de bindingsmodus van het peptide aan het koperioon. Zodra de bindingsmodus empirisch was vastgesteld, werden deze beperkingen geïntroduceerd om een hoge resolutiestructuur te verkrijgen. De bindingsmodus is het essentiële punt in het model en werd dus op een onbevooroordeelde manier bepaald.
De NMR-structurele bepaling van modelpeptiden is een uiterst waardevolle techniek die vaak wordt gebruikt door chemici en biologen. Het kan relatief eenvoudig worden toegepast op verschillende peptiden onder verschillende omstandigheden en kan dus licht werpen op relevante mechanismen10. Het begrijpen van het structuurophelderingsproces biedt een beter begrip van de sterktes en zwakheden van de voorgestelde structuren.

<table><tbody><tr><td>Avance DMX 600 MHz Spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR sample tubes&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Glove box</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer&nbsp;&nbsp;</td><td>VirTis</td><td>benchtopK</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>BioChemia</td><td>Op bestelling</td><td>>95% zuiverheid</td></tr><tr><td>Koper (1) chloride</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimethylsulfoxide</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1d en 2d 1h nmr

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Koper (I) binding door metallochaperone transporteiwitten voorkomt koperoxidatie en vrijlating van de toxische ionen die kunnen deelnemen aan schadelijke redoxreacties. Het Cu (I) complex van het peptidemodel van een Cu (I) bindend metallochaperone-eiwit, dat de sequentie MTCSGCSRPG bevat (onderstrept is geconserveerd), werd in oplossing onder inerte omstandigheden bepaald door NMR-spectroscopie.
NMR is een algemeen aanvaarde techniek voor de bepaling van oplossingsstructuren van eiwitten en peptiden. Vanwege de moeilijkheid in kristallisatie om enkele kristallen te leveren die geschikt zijn voor röntgenkristallografie, is de NMR-techniek uiterst waardevol, vooral omdat het informatie geeft over de oplossingstoestand in plaats van de vaste toestand. Hierin beschrijven we alle stappen die nodig zijn voor volledige driedimensionale structuurbepalingen door NMR. Het protocol omvat monstervoorbereiding in een NMR-buis, 1D en 2D dataverzameling en -verwerking, piektoewijzing en integratie, moleculaire mechanica berekeningen en structuuranalyse. Belangrijk is dat de analyse eerst werd uitgevoerd zonder enige vooraf ingestelde metaal-ligandenbindingen, om een betrouwbare structuurbepaling op een onbevooroordeelde manier te verzekeren.

Als onderdeel van een lopende studie naar koperbindende eiwitmodellen werd de structuur van de geconserveerde sequentie MT/HCXXC binnen het lineaire peptide MTCSGCSRPG bepaald via NMR in oplossing. Het peptide werd in een inerte omgeving gereageerd met CuCl en de pH werd gemeten op ~3.0 met een universele pH-strip. Het amidegebied van het peptide vertoonde een verbreding na reactie met koper, van 6.7-8.5 naar 6.6-9.0 ppm (Figuur 2). Lijnverbreding als gevolg van lichte koperoxidatie is zichtbaar in de ba...

De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de structuur van een mimetisch peptide van een metallochaperonne-eiwit in complex met koper. Dit wordt bereikt door eerst het monster voor te bereiden in een zuurstofvrije omgeving. De tweede stap is het verkrijgen van kernspinresonantie- of NMR-spectroscopiegegevens die de interacties tussen waterstofatomen tonen.Vervolgens worden de ruimtelijke interacties geprojecteerd op een lineair peptide-sjabloon. De laatste stap is het vinden van een representatieve structuur met een lage energie die bij de gegevens past. Uiteindelijk worden de uit NMR afgeleide structuren gebruikt om de bindingsmodus te bepalen en om een structurele analyse van het kopergebonden complex uit te voeren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals röntgendiffractie, is dat deze kan worden gebruikt om zwak bindende complexen te bestuderen, alsmede moleculen en complexen die niet kristalliseren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in koperbindende eiwitten, kan zij ook worden toegepast op andere systemen, zoals andere metaalchaperonnes, om te bestuderen hoe eiwitten de veilige levering van essentiële, maar po

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Dit protocol beschrijft het gebruik van amide koppelingsreacties van isonicotinezuur en diaminoalkanes te overbruggen liganden geschikt voor gebruik in de synthese van meerkernige platina complexen, die aspecten van de antikankergeneesmiddelen BBR3464 en picoplatin combineren vormen.

Amidekoppeling reactie voor de synthese van Bispyridine-gebaseerde liganden en hun Complexatie naar Platinum als dinucleair antikankermiddelen

Dit artikel beschrijft de constructie van een reeks waterstofbruggende supramoleculaire clusters in kristallen met behulp van primaire ammoniumtrifenylacetaat, dat opnieuw wordt gekristalliseerd uit niet-polaire oplosmiddelen. Deze selectieve constructie van de supramoleculaire clusters leidt tot effectieve systematische symmetrische studies over een correlatie tussen de supramoleculaire clusters en hun componenten.

Bouw en Systematische Symmetric Studies van een serie van Supramoleculaire Clusters met binaire of ternaire ammonium Triphenylacetates

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Cysteïne-rijke peptides vouwen in verschillende driedimensionale structuren afhankelijk van hun verbindingen bisulfide. Gerichte synthese van individuele bisulfide isomeren is vereist wanneer de buffer oxidatie leidt niet tot de gewenste bisulfide-connectiviteit. Het protocol behandelt de selectieve synthese van peptiden 3-bisulfide-gebonden en hun structurele analyse met behulp van NMR- en MS/MS studies.

Synthese en structuurbepaling van µ-Conotoxin PIIIA-isomeren met verschillende Disulfide Connectivities

Een nieuwe groep IV Metal Catalyst voor imine meta thesis wordt bereid door het enten van Amine metalen complex op gedehydroxylated silica. Oppervlakte metaal fragmenten worden gekenmerkt met behulp van FT-IR, elementair micro analyse, en Solid-state NMR spectroscopie. Verder dynamisch nucleair polarisatie oppervlak verbeterde NMR-spectroscopie-experimenten complementeren de bepaling van de coördinatie sfeer.

Imine-meta thesis door silica-ondersteunde katalysatoren met behulp van de methodologie van de Oppervlakteorganometaalchemie

Ion Mobility-massaspectrometrie en moleculaire modelleringstechnieken kunnen de selectieve metaal chelerende werking van ontworpen metaal bindende peptiden en de koper bindende peptide methanobactin karakteriseren. Ontwikkeling van nieuwe klassen van metaal chelerende peptiden zal helpen leiden tot therapieën voor ziekten in verband met metaalionen misbalans.

Ion Mobility-massaspectrometrie technieken voor het bepalen van de structuur en de mechanismen van metaalionen herkenning en redox activiteit van metaal bindende Oligopeptides

De voorbereiding van SNS tang kobalt (II) modelcomplexen van leveralcohol dehydrogenase wordt hier gepresenteerd. De complexen kunnen worden voorbereid door te reageren op de ligand voorloper met CoCl2·6H2O en kunnen vervolgens worden geherkristalliseerd door dat diethylether langzaam diffuus in een acetonitril oplossing die het kobaltcomplex bevat.

Bereiding van SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexen van Lever Alcohol Dehydrogenase

Dit artikel richt zich op het gebruik van elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie om de thermodynamica van Cu (II) binding aan peptiden en eiwitten te onderzoeken en te kwantificeren.

Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

Lijnvormanalyse van NMR-spectra verzameld over een temperatuurbereik dient als leidraad voor de herschikking van inwendige coördinatie-bolatomen op een chiraal, achtcoördinaat, renium(V) polyhydridecomplex, ReH5(PPh3)2(sec-butylamine). Lijnvormanalyse wordt ook gebruikt om de activeringsparameters ΔH‡, ΔS‡ en ΔG‡ voor die atoomherschikkingen te bepalen.

Lijnvormanalyse van dynamische NMR-spectra voor het karakteriseren van coördinatiesfeerherschikkingen bij een chiraal reniumpolyhydridecomplex

Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.

Anticancer Metal Complexen: Synthese en cytotoxiciteit Evaluatie door de MTT-test

Leer de structuur van koper-gebonden metallochaperone-peptiden bepalen met 1D en 2D 1H NMR-spectroscopie. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van bindingsmodi en moleculaire interacties mogelijk.

Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D ¹H NMR

Meer video's verkennen