Structuur- en coördinatiebepaling van peptide-metaalcomplexen met behulp van 1D en 2D 1H NMR
December 16th, 2013
De NMR-oplossingsstructuur van een metallochaperone modelpeptide met Cu (I) werd bepaald, en een gedetailleerd protocol van monstersvoorbereiding en 1D en 2D dataverzameling tot een driedimensionale structuur wordt beschreven.
Het algemene doel van deze procedure is om de structuur van een metallochaperon-eiwitmimetisch peptidecomplex met koper te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst de monster voor te bereiden in een zuurstofvrije omgeving. De tweede stap is het verkrijgen van de kernspinresonantie of NMR-spectroscopiegegevens die interacties tussen waterstofatomen laten zien.
Vervolgens worden de ruimtelijke interacties gekarteerd op een lineair peptidemodel. De laatste stap is het vinden van een representatieve laagenergetische structuur die past bij de gegevens. Uiteindelijk worden door NMR afgeleide structuren gebruikt om de bindingsmodus te bepalen en om structurele analyse uit te voeren op het kopergebonden complex.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande technieken zoals röntgenkristallografie, is dat je het kunt gebruiken om zwak bindende complexen te bekijken en ook voor moleculen en complexen die niet kristalliseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in koperbindende eiwitten. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals andere metaalchaps om te bestuderen hoe eiwitten de veilige afgifte van essentiële, maar potentieel giftige metaalionen in de cellijnomgeving mogelijk maken.
Om te beginnen, bereidt u monsters voor in een zuurstofvrije omgeving om te voorkomen dat het koper oxideert. Om het APO-monster voor te bereiden, lost u ongeveer een tot twee milligram van het peptide op in 450 tot 500 microliters gedeutereerd NMR-kwaliteitsoplosmiddel voor het met koper gereacteerde monster, lost u dezelfde hoeveelheid op als het APO-peptide met een EQU-molaar equivalent aan metaalzout in 450 tot 500. Microliters van het NMR-oplosmiddel. Filter elke oplossing met behulp van een centraal glasfiltraatpapier of een andere techniek die geschikt is voor de onderzochte verbindingen en ze niet absorbeert. Dit is essentieel om eventuele metaaldeeltjes te verwijderen, die de homogeniteit zullen beïnvloeden.
Breng de oplossingen over naar NMR-buisjes en sluit de monsters in de buisjes. Voordat u de handschoenenkast verlaat, haalt u de monsters uit de handschoenenkast en verzegelt u ze. Neem het eendimensionale protonenspectrum van de APO- en met koper gereacteerde monsters op in de NMR-machine en vergelijk deze.
Het APO-peptide is flexibel en vertoont een gemiddelde bevestiging, maar na reactie met koper hebben de gebonden peptideamiden een stiferdere structuur. Daarom zou het koperhoudende peptidespectrum een significante verandering in de chemische verschuiving in het amidegebied moeten vertonen, en de pieken kunnen worden opgelost. Stel geoptimaliseerde, cozy tox, nosy of rosy NMR-experimenten in onder identieke omstandigheden zoals beschreven in het tekstprotocol en voer ze in volgorde uit.
Voer eendimensionale experimenten uit tussen elk experiment in om ervoor te zorgen dat de monstersamenstelling constant blijft tijdens de gegevensverwerving. Nadat u de gegevens hebt verwerkt zoals besproken in het tekstprotocol, bereidt u een set van cozy en to spectra voor die op de noea- en rosy-spectrum worden geplaatst. Om alle NOE-pieken in het spectrum toe te wijzen.
Begin met het toewijzen van pieken die overlappen toxis-signalen in het vingerafdrukgebied. Omdat dit de toekomstige piektoewijzingsvermeldingen met het Sparky-programma zal vergemakkelijken, neemt u de toegewezen pieken op, vertaalt u H alfa naar amide-eiwitkoppelingswaarden in dedal-hoeken. Vertaal ook pieken in afstandsbeperkingen door de pieken binnen het programma te integreren en ze te vertalen met behulp van een interactie van bekende afstand.
Als de pieken overlappen of automatische integratiemethoden niet kunnen worden gebruikt, kunnen de pieken worden gelabeld als sterk, medium, zwak of zeer zwak door visuele schatting, en deze aanduidingen kunnen worden vertaald in afstanden tot 2,5, 3,5, 4,5 en 5,5 ångström respectievelijk. Importeer de afstandsbeperkingen en dedal-hoeken met het juiste formaat voor explorer. Explorer zal de conformationele ruimte doorzoeken om structuren te vinden die voldoen aan de canonische chemische geometrie.
Naast de experimenteel gevonden afstandsbeperkingen om een ensemble te genereren waarin geen van deze parameters wordt geschonden. Dit zal het startensemble vormen. Voer de eerste structuurbepaling uit zonder gebruik te maken van enige beperkingen voor het metaal om te achterhalen welke residuen deelnemen aan metaalbinding zonder enige vooringenomenheid.
Introduceer de beperkingen geleidelijk om fouten in de toewijzing te identificeren, evenals NOE-energie en gesimuleerde knielingsparameters zoals beschreven in het tekstprotocol voordat u de structuren minimaliseert met behulp van conjugaatgradiëntenergieminimalisatie gedurende 4.000 iteraties, creëer een laatste ensemble van gewoonlijk 50 leden door de introductie van beperkingen in een iteratieve wijze op het hele ensemble te rapporteren het aantal van elk type NOE-interactie dat wordt gevonden. Maak tenslotte een ensemble van structuren die voldoen aan de canonieke chemische geometrie en de empirische NMR-afgeleide beperkingen. Rapporteer het totale aantal bevestigingen, het aantal daarvan dat schendingen van de NMR-afgeleide beperkingen heeft en de RMSD van het hele ensemble, inclusief zowel ruggengraat als alle zware atoom RMSD-waarden.
Analyseer het laagenergetische ensemble en bepaal welke residudezijketens in de juiste nabijheid tot elkaar zijn om het metaalioon te kunnen binden. Zodra deze zijn bepaald, herhaalt u de analyse, inclusief de koperbindende gegevens. Voeg naast de NMR-afgeleide afstandsbeperkingen nu metaalbindende beperkingen toe aan de bepaalde residuen.
Voeg geschikte parameters toe om het metaalioon en zijn topologie te beschrijven. Voer de juiste fysische informatie in, zoals massabondenlengten met andere atomen, hoeken en niet-bindende afstotingsparameters in het parameterbestand. Voeg de bindingsinformatie toe aan het topologiebestand.
Deze informatie omvat welke bindingen worden gevormd en gebroken en welke formele ladingen worden gewijzigd als gevolg van binding. Verkrijg tenslotte een ensemble van structuren zoals eerder, de opgeloste ensemble vertegenwoordigt de conformationele ruimte die door het peptide wordt geadopteerd. Tijdens de NMR-meting importeert u alle bevestigingen van de structuur naar het Mal Mall-programma om een startensemble te maken.
<View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het bepalen van de structuur van een metallochaperone-eiwit-mimetisch peptidecomplex met koper met behulp van NMR-spectroscopie. Het protocol omvat monstervoorbereiding in een zuurstofvrije omgeving, gegevensverzameling en structurele analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Kernspinresonantie (NMR)-spectroscopie
- Metallochaperone-onderzoek
Achtergrond
- Metallochaperones zijn eiwitten die helpen bij de aflevering van metaalionen.
- Koper is een essentieel metaal dat een cruciale rol speelt in verschillende biologische processen.
- NMR-spectroscopie is een krachtige techniek voor het bestuderen van moleculaire structuren.
- Het begrijpen van de structuur van metallochaperones kan inzicht geven in hun functie en interacties.
Doel van de studie
- Om de structuur van een koper-gebonden metallochaperone-modelpeptide te bepalen.
- Om de bindingsmodus van koper aan het peptide te analyseren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor NMR-gegevensverzameling en -analyse.
Gebruikte methoden
- Stempelvoorbereiding in een zuurstofvrije omgeving.
- Verkrijgen van NMR-spectroscopiegegevens om waterstofatoominteracties waar te nemen.
- Het in kaart brengen van ruimtelijke interacties op een lineair peptide-sjabloon.
- Identificatie van een representatieve laagenergiestructuur die overeenkomt met de gegevens.
Belangrijkste resultaten
- De NMR-oplossingsstructuur van het metallochaperone-modelpeptide werd met succes bepaald.
- Gegevensanalyse onthulde de bindingsinteracties van koper met het peptide.
- Er werd een laagenergiestructuur geïdentificeerd die overeenkomt met de NMR-gegevens.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de structurele basis van de functie van metallochaperones.
Conclusies
- De studie biedt een uitgebreid protocol voor het bepalen van metallochaperone-structuren met behulp van NMR.
- Inzichten uit dit onderzoek kunnen toekomstige studies over metallochaperone-mechanismen informeren.
- De methodologie kan worden toegepast op andere metalloproteïnen voor structurele analyse.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Determining the solution-state structure of peptide-metal complexes enables mechanistic de-risking in target validation for metalloprotein drug discovery. NMR-derived structural insights support predictive confidence in early discovery by clarifying binding modes without crystallization bias. This approach informs portfolio triage for targets involving essential yet toxic metal ions like copper.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping metal-binding residues in peptide models under unbiased conditions.
- Operational Value: Enables biological de-risking through structural analysis of metal coordination without preset ligand constraints.
- Predictive Value: Supports target confidence by identifying low-energy conformations that satisfy experimental NOE and dihedral constraints.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows via oxygen-free sample handling to preserve metal redox state.
- Quantitative Outputs: Generates distance and angle constraints from NOESY, COSY, TOCSY, and ROESY spectra for structural modeling.
- Reproducibility: Ensures spectral consistency through 1D proton monitoring between 2D experiments to detect sample degradation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metallochaperone function in copper homeostasis, a pathway implicated in neurodegenerative and oncological disorders.
- Translational Continuity: Links discovery-stage structural data to preclinical validation by defining metal-binding geometry and electrostatic potential maps.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by characterizing binding affinity proxies through residue proximity and hydrogen-bond network analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing atomic-resolution insights into metalloprotein-ligand interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by determining which residues participate in metal binding without bias.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible peptide-metal complexes with defined structural ensembles for compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dihedral angles and distance constraints (up to 5.5 Å) that enable comparative analysis of binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical work via structural ensembles that inform mutagenesis and binding affinity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable NMR workflow applicable to other metallochaperones and metal-ion systems beyond copper.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metalloprotein function through unbiased structure determination.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via oxygen-free sample preparation and iterative constraint refinement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural evidence for target engagement and binding specificity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metalloprotein targets based on solvable, biologically relevant conformations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, protein/peptide chemistry, and molecular modeling software (e.g., Sparky, Explore, MALMOL, KYMERA).
- Dependent on high-field NMR instruments capable of 1D and 2D experiments (COSY, TOCSY, NOESY, ROESY) under anaerobic conditions.
- Necessitates cross-team standardization for sample handling, data processing, and constraint validation across structural biology and medicinal chemistry groups.
- Involves adaptation considerations when extending to other metal ions (e.g., Zn, Fe) due to differences in coordination geometry and redox sensitivity.
- Practical limitation: Structural accuracy depends on NOE completeness and assignment quality, particularly in flexible regions as noted in the apo-state peptide.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Sample Preparation
2:45
NMR Data Collection and Processing
3:50
Peak Assignment and Integration Using SPARKY
5:07
Molecular Mechanics Calculations to Generate Structure Ensemble Using XPLOR
8:07
Structure Analysis
14:04
Conclusion
10:39
Results: Structural Analysis of a Metallochaperone Protein-mimetic Peptide-copper Complex
