Name: Micro-injectie wondproef en In vivo Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in Drosophila Embryos. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer micro-injectie wondproeven voor epidermale wondrespons in Drosophila embryo's. Deze methode maakt real-time visualisatie van genexpressie mogelijk voor onderzoek naar weefselherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol is ontwikkeld in samenwerking met de vorige leden van de McGinnis Lab, Kim A. Mace en Joseph C. Pearson. Wij danken de voortdurende inspanningen van de Bloomington Drosophila Stock Center voor hun werk om waardevolle bestanden te organiseren en te distribueren. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01 GM077197 en K12 GM68524) en de familie van Herbert Stern. MTJ wordt momenteel ondersteund door Grant Number 5G12RR003060-26 van het National Center for Research Resources en Grant Number 8G12MD7603-27 van het National Institute on Minority Health and Health Verschillen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor Gezondheid van de Minderheid En Health Verschillen of de National Institutes of Health.

De Drosophila embryonale wond protocol kan worden samengevat in vijf stappen: (1) Embryo Collection, (2) Embryo Voorbereiding (3) Embryo Verwonden, (4) Embryo micro-injectie, en (5) Embryo Fixation. 1. Embryo Collection <ol><li> Verzamel volwassen vliegen, 2-3 dagen na eclosing, voeg 50 vrouwtjes en 25 mannetjes om een ​​embryo kooi. </li><li> Plaats een verse appelsap agar plus gist plaat elke ochtend voor 3 dagen. Opmerkingen: Voor een optimale embryo&#39;s worden verzameld, cyclus het vliegen op een 12 uurs schema overdag in een 25 ° C incubator (05:00 lights &quot;ON&quot; en 17:00 lights &quot;OFF&quot;); vrouwtjes reageren op veranderingen in de licht-cyclus en zullen tijdens een overstap van lichten &quot;ON&quot; lichten &quot;OFF&quot; 10,11 grotere hoeveelheden eieren deponeren. </li><li> In de namiddag van dag-3, plaats een verse appelsap plus gist agar plaat op de kooi en het verzamelen van embryo&#39;s voor 2 uur. Plaats een nieuwe gist plaat op de kooi en sla de2 hr collectie plaat. </li><li> Bewaar de collectie dienblad eens 14 uur bij 25 ° C om de embryo&#39;s rijpen. Opmerkingen: De wondgenezing kan worden getest in elk stadium tijdens Drosophila ontwikkeling, de wond geïnduceerde transcriptie verslaggevers beschreven in dit document hebben een optimale activiteit tussen fasen 15-16 december. Door het late stadium 17, het embryo is te oud om gemakkelijk doorboren de rijping nagelriem en efficiënt activeer de wond reporters of sporen-wond geïnduceerde transcriptie. Om de collectie tijd en het verwonden tijd optreden tijdens de piek lab uur, volgen we een schema van het embryo gedurende 2 uur (16:00-18:00), wisselen de collectie plaat met een nieuwe plaat op 18:00, leeftijd het verzamelen plaat bij 25 ° C gedurende 14 uur (overnacht) en gewikkeld op de embryo 08:00 (volgende dag). </li></ol> 2. Embryo Voorbereiding Opmerkingen: Dit protocol omvat het gebruik van vele instrumenten en objecten die scherp zijn of gemaakt van glass. Behandel alle slijpsel en glazen voorwerpen met zorg om letsel te voorkomen. <ol><li> Verwijder voorzichtig embryo&#39;s uit de collectie van platen met een penseel door het toevoegen van 2-3 ml water aan de plaat en zwenken. Transfer water en embryo&#39;s van plaat tot nylon gaas en collectie buis. </li><li> Voeg 4-5 ml bleekwater om de dop van een plastic petrischaal plaat en genieten van het gaas overdekte einde van de collectie buis met de embryo&#39;s in bleekwater gedurende 2 min, waarbij de buitenste eierschaal van het embryo verwijdert. Handmatig draaien de collectie buis een paar keer om embryo&#39;s te voorkomen klonteren in het bleekmiddel. Spoel embryo&#39;s met water 10x en droog het gaas bedekt collectie buis die de dechorionated embryo&#39;s op een papieren handdoek. </li><li> Gebruik een dissectie naald ~ 50 embryo&#39;s te dragen van nylon mesh naar een agar plaat. We voegen groene kleurstof om de agar plaat om het contrast en hulp in embryo uitlijning toe te voegen. Onder een microscoop ontleden, maken twee parallelle rijen van ~ 25 embryo&#39;s, het uitlijnen van de embryos op de dia zodat ze loodrecht op de punctienaald op de micro-injectie inrichting. Laat een beetje ruimte (ongeveer 1 embryo lengte) tussen de embryo&#39;s voor gasuitwisseling doeleinden. De twee parallelle rijen moeten elkaar ongeveer 5 mm. </li><li> Plaats een dia met dubbele plakband op de top van de lijn embryo&#39;s en druk voorzichtig op de dia om embryo&#39;s te dragen van de groene plaat aan de dia. Vervolgens aan de lucht drogen de embryo&#39;s ~ 25 min om de interne druk op het embryo te verminderen en te voorkomen dat een uitbarsting toen verwondde. </li><li> Plaats 2-3 druppels Halocarbonolie mix over de embryo&#39;s om verdere uitdroging te voorkomen. </li></ol> 3. Embryo Verwonden <ol><li> Plaats de embryo dia in de injectie microscoop podium. Vind de embryo&#39;s in het gezichtsveld en praktijk bewegen het stadium van het omgekeerde microscoop. Opmerkingen: Voor het werken met de naald, focus op midden vlak van embryo langs de dorsoventral as. Om te zorgen voor een efficiënte verwonden van deuitgelijnd embryo&#39;s, beginnen verwondde de rij dichter bij de naald apparaat. Verplaats de fase naar de top van de rij uitgelijnde embryo&#39;s in het gezichtsveld brengen. </li><li> Zorgvuldig plaats en zorgen voor een getrokken-naald in de naaldhouder. Gebruik de micromanipulator om de naald omlaag te verplaatsen in de richting van dia. Breng de naald met het embryo, in dezelfde focal plane. Zodra de naald in focus met het embryo, niet bewegen de naald met de micromanipulator. </li><li> Verplaats het podium om het embryo te prikken door en door, ga dan naar de volgende embryo in de rij. Als je klaar bent verwondde de eerste rij, gebruik dan de micromanipulator om de naald volledig op en af ​​te stappen van het stadium vóór het verplaatsen van de schuif, handmatig draaien de glijbaan 180 ° en wond de tweede rij. </li><li> Sla de embryo&#39;s onder Halocarbonolie bij kamertemperatuur en doorgaan met embryo fixatie als dit in situ hybridisatie of antilichaam kleuring (zie Procedure stap 5). Als alternatief, slaan de embryo&#39;s voor 4-6 uuronder halogene olie en doorgaan met gewonden transcriptionele fluorescerende reporter visualisatie (Representatieve resultaten). Opmerkingen: Voor de visualisatie van de fluorescente reporter verdoven we de embryo&#39;s met 50% 1-fenoxy-2-propanol 13. De embryo&#39;s worden uit de halogene olie en geplaatst op een nieuwe dia. Wij plaatsen glazen kralen rond de embryo&#39;s, voeg een paar druppels van de verdoving, en plaats een dekglas op de embryo&#39;s. </li></ol> 4. Embryo Microinjection Opmerkingen: De micro-injectie apparatuur die we gebruiken in het protocol is niet geautomatiseerd te specifiek volume te leveren tijdens de test. We voegen een kleurstof aan de oplossing van het micro-injectie visualiseren en probeert het volume geleverde normaliseren. Als er te veel oplossing wordt geïnjecteerd in het embryo, de vitelline membraan barsten. <ol><li> Laad naald uit de achterzijde met 1 pl van chemische oplossing plus kleurstof (bv. 0,6 MH 2 O 2). Laat capillaireactie om de chemische oplossing op de punt van de naald te trekken. </li><li> Om een ​​naald breken, plaats een deksel slip onder een hoek op een dia en de vacht van de rand met halogene olie mix. Breng de gemonteerde naald in focus met de rand van de schuine dekglas en beweeg dekglas rand over de punt van de naald tot het breekt. Oefen druk uit op micro-injectie apparaat en controleer of de chemische oplossing plus kleurstof stroomt uit de naald. </li><li> Plaats de dia met uitgelijnd embryo&#39;s op de microscoop podium. Ga verder met het embryo en de naald in hetzelfde vlak richten. Tegelijkertijd doorboren en microinject chemische oplossing plus kleurstof in elk embryo. Opmerkingen: Verstopte naalden komen vaak voor, breek een nieuwe naald onvolledige micro-injectie te vermijden. Een stompe naald niet zo schoon als een schuine naald wond. Aanpassen dekglaasje een niet-90 ° hoek tijdens breuk optimaal een schuine naaldpunt produceren. </li></ol> 5. Formaldehyde Fixation Opmerkingen: De chemicaliën die worden gebruikt in deze Drosophila fixatie zijn schadelijk. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, labjas en veiligheidsbril) bij het ​​hanteren van de chemicaliën. Volg individuele institutionele richtlijnen voor het verwijderen van gereguleerde stoffen. <ol><li> Na verwonding Wacht 15, 30, 60 of meer minuten in de transcriptionele activering van wond geïnduceerde genen optreden. Om embryo&#39;s van injectie dia&#39;s te verwijderen, laat u de halogene olie mix van de dia&#39;s, leunen de glijbaan tegen een rek en dep het einde met een Kimwipe. </li><li> Gebruik een glazen pipet om heptaan spoelen over de glijbaan en was de spoeling vloeistof in een glazen petrischaal. Heptaan zal de band te ontbinden en laat de embryo&#39;s. Blijf spoelen totdat alle embryo&#39;s uit de dia. Ga door naar de volgende dia, totdat alle embryo&#39;s worden verwijderd van dia&#39;s. </li><li> Breng de heptaan plus embryo oplossing uit de glazen schaal in een 20 ml scintillation flacon. Schud de flacon voor 2-3 min, verwijder de heptaan en voeg 5 ml vers heptaan. </li><li> Voeg 5 ml verse, fixatie-oplossing (zie lijst reagentia voor recept). Cap de flacon en hechten aan een orbitale platform shaker. Schud de flacon met de embryo&#39;s gedurende 25 min bij 220-230 rpm. </li><li> Na het schudden, laten de bubbels op het grensvlak pop. Volledig verwijderen van de bodem, waterige fase met een pipet, het vermijden van het trekken van de embryo&#39;s. De onderste laag bestaat uit de fixatie-oplossing en moet goed worden afgevoerd. </li><li> Voeg 5 ml methanol, dop op de flacon en schud krachtig met de hand gedurende 20-30 sec, swirl en plaats het op de bank. Gewonde embryo&#39;s blijft bij de interfase en zal niet zinken naar de bodem. Opmerkingen: Na fixatie van de vitelline membraan van een gewonde embryo normaal zal barsten tijdens de dehydratatiestap met methanol. Echter, de vitelline membraan in een gewonde embryo al gebroken en de uitdroging stap zal de vitelline memb niet verwijderenrane. Hand-devitellinzation moet de fixatie protocol voltooien. </li><li> Verwijder voorzichtig de bovenste heptaanlaag en voeg dan 5 ml verse methanol. Schud de flacon en de embryo&#39;s moeten zinken. </li><li> Verwijder de methanol plus embryo oplossing met een glazen pipet overdracht en verzamelen in een nylon mesh collectie buis in een glazen schaal. </li><li> Verwijder de methanol en spoel de embryo&#39;s met 1x PBS oplossing. </li><li> Breng de embryo&#39;s uit de nylon mesh om een ​​appelsap plaat. Spreid de embryo langs het oppervlak van de plaat. </li><li> Breng de embryo&#39;s om een ​​dubbele plakband glasplaatje. Bedek de embryo&#39;s met 1x PBS. Opmerkingen: De embryo neiging om klonteren als gevolg van de vitelline-membraan. Met behulp van een appelsap plek zorgt voor een snelle scheiding van de samengeklonterd embryo. De embryo&#39;s moeten van de plaat worden verwijderd en overgebracht naar een dubbele plakband glasplaatje omdat embryo&#39;s zinken in de agar plaat wanneer kracht wordt uitgeoefend op het embryo uit het verwijderenvitelline membraan. </li><li> Duw de embryo&#39;s met een dissectie naald om &quot;pop&quot; de vitelline membraan. Het embryo moet zinken in de PBS. </li><li> Gebruik een glazen pipet om de 1x PBS plus embryo overbrengen naar een 1,5 ml buis. Spoel de embryo&#39;s met 1x PBS en bewaar bij 4 ° C. Ga verder naar de embryo&#39;s met behulp van een Ethanol uitdrogen: PBS serie en ga verder met in situ hybridisatie of immunolocalization protocol 14. </li></ol>

<ol><li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li>
<li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li>
<li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li>
<li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li>
<li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li>
<li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duox%2C+Flotillin-2%2C+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424(2011).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li>
<li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12%3A12+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li>
<li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li>
<li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846(2004).</li>
<li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Drosophila+transgenic+reporters%3A+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li>
<li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773(2013).</li>
<li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696(2010).</li>
<li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347(2012).</li>
<li>Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li>
<li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een onmiddellijke transcriptionele regelende reactie op externe stimuli cellen toestaat een gelokaliseerde respons op extracellulaire stimuli, die zijn stress, beschadiging of infectie coördineren. De onjuiste controle van een lokale reactie kan schadelijke effecten hebben op naburige cellen, evenals een verspilling van middelen om de schade te repareren. De Drosophila embryo een uitstekend systeem basis wondgenezing experimenten op een goedkope en gemakkelijk te onderhouden modelorganisme. Het potentieel voor samenwerking tussen onderzoek in andere modelorganismen en Drosophila biedt een unieke gelegenheid om vele biologische vragen te verkennen. Een extra techniek van de wond reporters is de genetische combinatie van mutanten, die een efficiënte methode voor het testen van de bijdrage van nieuwe genen tot de activatie van de epidermale wond reactieweg. We hebben epidermale-wond geïnduceerde transcriptie verslaggevers avBESCHIKBARE op zowel de 2 e en 3 e chromosomen 5. In dit onderzoek gebruiken we UAS en GAL4 systemen overexpressie 16. Voor studies met dodelijke mutant allelen bepalen we de genetische achtergrond met behulp van een fluorescerende balancer chromosoom, bijvoorbeeld Kruppel-GFP 17. We hebben de wond verslaggever lokalisatie in verschillende genetische achtergronden (tabel 1) geanalyseerd. Een mogelijke modificatie van de techniek is micro-injectie en verwonding combineren. Micro-injectie kan worden gebruikt om een ​​chemische oplossing in de embryo voeren. Verschillende chemische verbindingen zijn getest en bleken de activiteit van de epidermale wond reporters 9 reguleren. Deze werkwijze van gelijktijdige verwonden en micro-injectie kan nuttig zijn om het aantal cellen in de Drosophila embryo dat een wond signaal reageren en kan direct worden gebruikt om genexpressie veranderingen volgen na verwonding 18 vergroten. Een toekomstige toepassing van de micro-injectie techniek zal zijn om nieuwe chemicaliën te testen voor de regulering van de epidermale wond reactie. Drosophila als een modelsysteem voor genetisch onderzoek biedt een breed scala van eenvoudige protocollen om doeltreffend op te complexe vragen. Recente rapporten over de haalbaarheid van Drosophila technieken hoogtepunten van het gebruik van hemocyte migratie 19 en sluipwesp infectie 20 als een middel om de impact van de Drosophila onderzoeksgemeenschap verder te verbreden. Naast wondheling studies, Drosophila biedt een klassiek model voor regeneratie met de imaginaire disc systeem 21,22. De gecombineerde vooruitgang in imaginal disc regeneratie studies en punctie / micro-injectie verwonding biedt een uitstekend systeem om goed bewaarde onderdelen van weefselherstel te ontdekken.

Manipulatie van Drosophila embryo&#39;s met behulp van een micro-injectie techniek is een gevestigde assay 1. De betekenis van de epidermale wond reporter respons methode is het protocol doorboren / micro-injectie gecombineerd met fluorescerende reporters en een in vivo reactie op epidermale schade in Drosophila embryo zichtbaar. Het doel van deze methode is om een ​​bredere reeks van wetenschappers in staat te stellen Drosophila gebruiken als een instrument om de processen die de transcriptionele respons op epidermale punctie letsel reguleren onderzoeken. De single-gelaagde epidermis in Drosophila biedt een eenvoudig systeem om een epidermale wond reactie studeren na een lekke blessure 2. Het Drosophila embryo een robuust modelsysteem genetisch ontleden stadia van wondheling, zoals wond reactie, ontsteking en reepithelialization 3. Dit komt deels omdat veel of de meeste zygotische mutanten te overleven tot het einde van embryogenesis en ontwikkelen epidermale barrières zelfs wanneer ontwikkelingsstoornissen patronen gaat diep mis. Vorige karakterisering van een goed geconserveerd transcriptiefactor korrelige hoofd (Grh), geïdentificeerd die Grh-target genen Dopa decarboxylase (DDC)-en tyrosine hydroxylase (ple) transcriptioneel geactiveerd rond de sites van de schade 4. Drosophila als modelorganisme voor wond reactie voorziet in een extra lijn van onderzoek naar studies gaan in zoogdieren wondgenezing 5. Latere studies hebben extra Drosophila-wond geïnduceerde genen geïdentificeerd en ontwikkelde een &quot;toolkit&quot; van vele TL wond verslaggevers te zien op de in vivo epidermale wond reactie te reinigen verwonden 6. Recente rapporten over de regulering van Drosophila wondgenezing hebben zich gericht op het dichten van wonden in fenotype, waardoor ontdekking van de vele paden reguleren cel migratie 7,8. Met de analyse van defluorescerende wond verslaggevers, hebben onze studies een nieuwe set genen die nodig zijn voor de gelokaliseerde expressie van epidermale wondinduceerbare genen 9 geïdentificeerd. Een van de verdiensten van de wond reactie verslaggever methode is dat de resultaten geven meer inzicht in een mechanisme van hoe signalen worden getransduceerd van de plaats van schade aan de naburige cellen. Een van de nadelen van de wond respons reporter werkwijze is dat de resultaten niet direct te koppelen aan fenotypes bij wondgenezing en reparatie. Ruimer gebruik van de schone wond punctie protocol in de genetische en chemische schermen zal nieuwe regulatoren van de transcriptionele respons op epidermale verwonding te identificeren en verder de vertaling van wondgenezing ontdekkingen in zoogdieren modellen van blessure behandelingen.

<table><tbody><tr><td>gist</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>appelsap</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>bleekmiddel</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halogeenkoolstof olie, 700 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>halogeenkoolstof olie, 27 W</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1-fenoxy-2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>waterstofperoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>methyl-β-cyclodextrine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>toluidineblauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, 16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>giftige chemische stof</td></tr><tr><td>heptaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td>giftige chemische stof</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>giftige chemische stof</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase vrij H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila incubator</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>vliegkooi</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>embryo collectiebuis</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>plastic petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>dubbelzijdig plakband</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwast</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissectie naald</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965A</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>glas dekglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>3306</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>microscoopglaasje</td><td>Thermo Scientific</td><td>4445</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>dissectie microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>capillaire naald</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>naaldtrekker</td><td>Narishige</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>microinjectienaalden houder</td><td>Narishige</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>invertede microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Primo-Vert</td><td></td></tr><tr><td>glas petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>glas Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-063-172</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>transfer bulb</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>scintillatie fleskje</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td>scherp voorwerp</td></tr><tr><td>orbitale shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml buisje</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>laser scanning confocal</td><td>Leica</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>fixatieoplossing</td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>2.5 ml</td><td></td><td>giftige chemische stof</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase vrij H2O</td><td>1.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halogeenkoolstof olie mix</td><td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halogeenkoolstof olie, 700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>halogeenkoolstof olie, 27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

micro-injectie wondproef en<em&gt; in vivo</em&gt; lokalisatie van epidermale wound response verslaggevers in<em&gt; drosophila</em&gt; embryo&#39;s.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

De Drosophila embryo ontwikkelt een robuuste epidermale laag die dient zowel de interne cellen tegen een harde externe omgeving alsook cellulaire homeostase. Punctie letsel met glasnaalden een directe methode om een ​​snelle reactie epidermale wond die wond transcriptionele reporters, die kan worden gevisualiseerd door een gelokaliseerde reporter signaal in levende embryo&#39;s of larven activeert activeren. Punctie of laser letsel geeft ook signalen dat de aanwerving van hemocytes bevorderen om de wond. Verrassend, ernstige (door en door) punctie letsel in een vergevorderd stadium embryo&#39;s slechts zelden verstoort de normale embryonale ontwikkeling, als meer dan 90% van deze gewonden embryo&#39;s overleven naar volwassenheid wanneer embryo&#39;s worden geïnjecteerd in een olie medium dat onmiddellijke lekkage van hemolymph op de injectieplaats minimaliseert . De wond procedure vereist micromanipulatie van de Drosophila embryo&#39;s, waaronder handmatige uitlijning van de embryo&#39;s op agar platen en de overdracht van de uitgelijnde embryo&#39;s om dia microscoop. De Drosophila epidermale wond respons assay biedt een snelle systeem om de genetische eisen van diverse biologische functies wondgenezing, evenals een manier om te screenen op potentiële chemische verbindingen die wondheling bevorderen bevorderen testen. De korte levenscyclus en gemakkelijk kweken routine Drosophila een krachtige modelorganisme. Drosophila schoon wondgenezing blijkt de epidermale regeneratieve respons te coördineren, met de aangeboren immuunrespons, op een manier die nog in onderzoek zijn, die een uitstekend systeem om geconserveerde regelgevende vinden biedt mechanismen gemeen Drosophila en zoogdieren epidermale verwonden.

Om de in deze methode resultaten te verkrijgen, is het open leesraam van groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd aan een promotor / wond geïnduceerde enhancer sequentie uit dopadecarboxylase (Ddc) en DsRed gefuseerd aan een wond versterkende sequentie van tyrosine hydroxylase ( ple) 4,6. In een levende Drosophila embryo, rijping van de wond fluorescente reporter proteïne optimaal 4-6 uur na verwonding, waarin de tijd voor het verzamelen van voldoende eiwit te visualiseren, en tijd voor het fluorescente proteïne te oxideren tot de fluorescerende toestand 15. De verslaggever lokalisatie observeren, een verbinding fluorescentiemicroscoop is voldoende. Een hogere vergroting van de reporter lokalisatie observeren, een confocale microscoop optimaal maximaal projectie van meerdere optische secties (figuur 1) te genereren. Confocale in vivo beeldvorming van Drosophila embryo wordt gecompliceerd door de rapid golvingen van het embryo. . Een volledige weergave van embryo kan worden verkregen met 20X objectief en een close-up bekijken van de wond site kan worden verkregen met 40X objectief. Een bovenaanzicht van de epidermale wond reporter lokalisatie kunnen worden afgebeeld met 10 opeenvolgende 1 pm optische secties. Een zij-aanzicht epidermale wond reporter lokalisatie kan worden afgebeeld met 40 achtereenvolgens 1 urn optische secties. Met standaard genetische kruising werkwijzen is het mogelijk om wond reporters combineren met genetische mutaties. Een voorbeeld in dit document is Flotillin-2 (Flo-2), omdat het verlies-van-functie (nul-allel gegenereerd met P-element inbrengen) en gain-of-function (overexpressie gegenereerd met alomtegenwoordige expressie in alle cellen) mutanten van flo-2 tonen de Flo-2 genproduct noodzakelijk en voldoende om de lokalisatie van DDC-GFP remmen gewikkeld reporters 9 (figuren 2A en 2B). Met behulp van de microinjection protocol is het mogelijk om te testen of introductie van chemische oplossingen superactivates of remt de lokalisatie van wond reporters. Chemisch-gewonden embryo&#39;s werden gelijktijdig gewond en geïnjecteerd met een 01:04 verhouding van 1% toluïdineblauwkleurstof en opgeloste verbindingen. Toluïdineblauwkleurstof termijn voor visuele bevestiging van oplosbaar verbindingen worden geïnjecteerd in de lichaamsholte. Controle embryo&#39;s werden verwond met een gebroken naald met 01:04 verhouding van 1% toluïdineblauwkleurstof en opgeloste stof zonder chemische. Twee voorbeelden in dit document zijn waterstofperoxide (H 2 O 2) en methyl-β-cyclodextrine (MβCD), omdat beide chemische oplossingen voldoende zijn om globaal activeren van de lokalisatie van de Ddc-GFP wond reporters 9 (figuren 2C en 2D) . Waterstofperoxide (H 2 O 2) werd verdund in H2O tot 0,6 M. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) werd opgelost in 1 mM NaOH tot 3 mM. De embryo fixatie protocol, is het mogelijk om de transcriptie activatie opgewikkeld respons genen detecteren in een gelokaliseerd gebied, rondom een ​​wond. Een voorbeeld in dit document is de in situ hybridisatie van RNA probes detecteren Ddc en PLE transcripten 4,6,9 (Figuren 3A en 3B). <img alt="Figuur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> Figuur 1. Ddc-GFP en ple-DsRed wond reporter lokalisatie. Brightfield en fluorescerende afbeeldingen in gewonde wild type embryo. (A) Top-view van Ddc-GFP wond reporter. (B) Top-view van ple-DsRed wond reporter. Alle beelden werden verzameld op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in het data-scherms markeren de contouren van embryo&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> Figuur 2. Lokalisatie van de Ddc-GFP wond verslaggever in genetische mutant achtergronden en chemische gemicroinjecteerd embryo. Brightfield en fluorescerende beelden van gewonde Flotillin-2 (Flo-2) mutant embryo&#39;s. (A) verlies-van-functie Flo-2 {KG00210} mutanten, uitbreiding van de reporter-activiteit in alle epidermale cellen. (B) Gain-of-function Flo-2 (gordeldier-GAL4, UAS-FLO2) mutanten, remming van de reporter-activiteit in alle epidermale cellen. (C) waterstofperoxide (H 2 O 2 ) oplossing micro-injectie, uitbreiding van reporter activiteit in alle epidermale cellen. (D) Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) oplossing micro-injectie, uitbreiding van reporter-activiteit in alle epidermale cellen. Alle beelden werden verzameld op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in de gegevens panelen markeren de contouren van embryo&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> Figuur 3. Detectie wond respons gen RNA transcripten. Fluorescerende beelden van in situ hybridisatie en RNA detectie in gewonde wildtype embryo. Ddc (A) en PLE (B) RNA transcripten accumuleren rond de wond. Alle beelden waren collectieveted op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in de gegevens panelen markeren de contouren van embryo&#39;s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> . <img alt="Tabel 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> Tabel 1. Samenvatting van de epidermale wond reactie verslaggevers. Invoegingen van de vier wond reactie verslaggevers (Ddc, PLE, msn, KKV) zijn beschikbaar op zowel de tweede als derde chromosomen. In een beperkt aantal epidermale cellen rondom de plaats van de punctie letsel in het wild type achtergrond (bijv. &quot;lokale&quot; fenotype) Alle van de wond reactie verslaggevers activeren de fluorescentie gen (GFP of DsRed). Ddc en msn wond reactie verslaggevers nodig Grh voor activering van de fluorescence gen na punctie letsel (bijvoorbeeld &quot;geen&quot; fenotype). Alle van de wond verslaggevers vereisen Flo-2 voor lokalisatie van de fluorescentie-gen na punctie letsel (bijv. &quot;globale&quot; fenotype). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding</a> .

De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo&#39;s verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.

Micro-injectie wondproef en<em&gt; In vivo</em&gt; Lokalisatie van epidermale Wound Response Verslaggevers in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Het algemene doel van deze procedure is om in vivo de reporter voor de epidermale wondrespons in het embryo van drosophila te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst het ontwikkelingsstadium te verzamelen waarin de reporteractiviteit consistent kan worden gedetecteerd. De tweede stap van de procedure is het doorprikken van het embryo met een glazen naald en een micro-injectieapparaat.De derde stap is het anesthetiseren van het embryo voor visualisatie van de reporter. De laatste stap is het valideren van de lokalisatie van de reporter door het expressiepatroon van RNA-probes te detecteren. Uiteindelijk kunnen de resultaten via confocale microscopie de specifieke activatie van de reporter voor de epidermale wondrespons aantonen, uitsluitend in de cellen rondom de plaats van de punctiewond.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden waarbij wordt gekeken naar wondsluiting, is dat we in levende embryo's genexpressie kunnen waarnemen die wordt getriggerd door wonding via punctie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van weefselherstel, zoals de wijze waarop cellen rondom een letsel een onmiddellijke wondrespons reguleren om herstel te bevorderen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot therapie of diagnose van weefselregeneratie, aangezien de regulatie van de wondrespons de eerste stap is.Wondgenezing kan in elke ontwikkelingsfase worden geanalyseerd. Echter, tegen stadium 17 is de cuticula te volgroeid. Bekende wondreporters zullen dan niet worden geactiveerd.Om dit te demonstreren, zullen embryo's in stadium 15 tot 16 worden gewond voor de oogst. Verzamel twee tot drie dagen oude volwassen vliegen, 50 vrouwtjes en 25 mannetjes. Plaats ze in een kooi voor embryo-verzameling met een verse plaat van appelsap, agar en een klontje gistpasta.Huisvest de kooi elke ochtend gedurende de volgende drie dagen bij 25 °C. Vervang de plaat door een nieuwe. Laat op de middag van de derde dag gedurende twee uur eieren verzamelen op een nieuwe plaat.Bewaar deze plaat gedurende 14 uur bij 25 °C. Een legperiode van twee uur zou de volgende dag ongeveer 200 embryo's moeten opleveren. Voeg enkele milliliters water toe aan de plaat en draai deze voorzichtig rond.Breng vervolgens met een penseel het water en de embryo's van de plaat over naar een nylon gaasmandje in een opvangbuis. Maak nu een ondiep bleekbad en laat de embryo's hier gedurende twee minuten in weken. Deze stap verwijdert de COR's, de eieren.Kruislingse bewegingen in het bad maken om te voorkomen dat de embryo's gaan klonteren. Spoel de embryo's na twee minuten af met stromend water en spoel de petrischaal vijf seconden lang schoon. Verplaats vervolgens het embryomandje naar een papieren handdoek om de embryo's te drogen.Verplaats vervolgens met een dissectienaald ongeveer 50 embryo's van het gaas naar een agarplaat die is gemaakt met groene voedselkleurstof. De kleurstof dient om de zichtbaarheid van de eitjes te vergroten. Maak onder een dissectiemicroscoop twee parallelle rijen embryo's met een onderlinge afstand van ongeveer vijf millimeter.Positioneer de rijen met een tussenruimte ter grootte van een embryo om gasuitwisseling mogelijk te maken. Druk vervolgens voorzichtig een objectglas met dubbelzijdige plakband op de embryo's, zodanig dat de rijen loodrecht staan op de lengte van het objectglas. Laat de embryo's aan de lucht drogen om de interne druk te verlagen.Op deze manier zullen ze niet knappen wanneer ze gewond raken. Na 25 minuten zou het eerste geprepareerde preparaat droog moeten zijn. Bedek de embryo's nu met twee tot drie druppels halogeenkoolwaterstofolie om verdere uitdroging te voorkomen en ga onmiddellijk over tot het verwonden van de droge embryo's.Plaats het objectglas met de embryo's op de tafel van de injectiemicroscoop. Zoek de embryo's in het gezichtsveld en oefen met het bewegen van de tafel van de omgekeerde microscoop. Focus nu op het middenvlak van het embryo langs de dorso-ventrale as en breng het bovenste embryo van de eerste uitgelijnde rij in het gezichtsveld.Plaats vervolgens voorzichtig een getrokken naald in de naaldhouder en zet deze vast. Gebruik de micromanipulator om de naald naar het preparaat te bewegen. Lijn de naald uit met het embryo in hetzelfde brandvlak.Pas nu de micromanipulator niet verder aan. Verplaats nu de tafel om het embryo volledig te doorboren. Ga vervolgens naar het volgende embryo in de rij.Nadat de eerste rij is gewond, beweegt u de naald volledig omhoog en weg van de tafel. Draai vervolgens het preparaat en ga verder met het doorprikken van de embryo's in de tweede rij. Zodra ze allemaal gewond zijn, kunnen de embryo's onmiddellijk worden gefixeerd voor in situ hybridisatie of antilichaamkleuring.Wacht vier tot zes uur om fluorescente reporters te onderzoeken en breng het embryo over naar een nieuwe slide; plaats glaskralen rond de embryo's. Voeg vervolgens een paar druppels 50% 1-fenoxy-2-propanol toe, wat een anestheticum is, en plaats een dekglas op de embryo's voor micro-injecties. Laad de injectienaald van achteren met 1 µL chemische oplossing plus kleurstof, zoals 0,6 M waterstofperoxide.Laat de capillaire werking de chemische oplossing naar de punt van de naald trekken. Breek vervolgens de punt van de naald af tegen de rand van een dekglas in een mengsel van halo-carbonolie. Breng eerst de gemonteerde naald in focus met de rand van het schuin geplaatste dekglas onder een hoek van net minder dan 90 graden.Beweeg vervolgens voorzichtig de rand van het dekglas over de punt van de naald tot deze breekt. Oefen daarna druk uit op het micro-injectieapparaat en controleer of de oplossing uit de naald stroomt. Als er geen vloeistof stroomt, breek de naald dan nog iets verder open.Voer nu dezelfde procedure uit die werd gebruikt om enkel de embryo's te puncteren. Micro-injecteer deze keer de oplossing gelijktijdig met de punctie. Injecteer idealiter 10 nanoliters.Als er te veel oplossing in het embryo wordt geïnjecteerd, zal het Vitale-membraan scheuren tijdens de fixatieprocedure in het tekstprotocol; besteed daarom nauwgezet aandacht aan de volgende stappen. Gebruik een glazen pipet, geen plastic, om het heptaan over het objectglas te spoelen en gebruik glas om de embryo's naar het midden van de glazen Petrischaal te wervelen. Schud de embryo's vervolgens gedurende 25 minuten in het fixatief bij 220 tot 230 RPM.Laat na het schudden de bellen op het grensvlak knappen voordat de onderste waterige fase volledig wordt verwijderd. Pas daarnaast op dat de embryo's niet worden meegetrokken. Na het toevoegen van de methanol zullen de gewonde embryo's later op het grensvlak clusteren; spreid de embryo's op deze manier uit over het oppervlak van de plaat en breng ze vervolgens op deze wijze over naar een glazen objectglas met dubbelzijdige plakband.Duw vervolgens de embryo's voorzichtig met de dissectienaald om het vitelline membraan te doorbreken en ga verder met de dehydratie. Wild-type vliegen werden getransformeerd met fluorescente reporters gefuseerd aan DOPA-decarboxylase- of tyrosinehydroxylase-enhancers en onderworpen aan de beschreven assay. Onder brightfield-microscopie was het mogelijk om de wondplaats te zien, terwijl onder fluorescentieverlichting de activiteit van de DCD-wondreporter zichtbaar was.De tyrosinehydroxylase-reporter vertoonde een vergelijkbaar resultaat. Beide beelden zijn vastgelegd met een Leica SP twee confocale microscoop met een 20 x objectief. De procedure is uitgevoerd in een loss-of-function flow twee mutant.Achtergrond: DOPA-decarboxylase reporteractiviteit was uitgebreid over de epidermale cellen in gain-of-function flow two-mutanten die waren gegenereerd met ubiquitaire expressie in alle cellen. Remming van de reporter werd waargenomen in de epidermale cellen. Vervolgens werden embryo's gelijktijdig gewond en geïnjecteerd met een gesolubiliseerde verbinding en udine blue kleurstof; waterstofperoxide en water breidden de DOPA-decarboxylase reporteractiviteit in de epidermale cellen uit, evenals een injectie van methyl-β-cyclodextrine in natriumhydroxide, waarbij in situ hybridisatie werd gebruikt.De transcriptionele activering van wondresponsgenen werd bepaald via een assay voor endogene DOPA-decarboxylase. Er werd waargenomen dat de RNA-expressie gelokaliseerd was rond de wondplek en uiteraard werd er ook vastgesteld dat RNA-transcripten van tyrosinehydroxylase zich ophoopten bij de wondplek. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in 60 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om niet te veel tijd te besteden aan het uitlijnen van de embryo's en door te gaan naar de volgende stappen van de procedure.

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

Drosophila larven zijn een aantrekkelijk model systeem voor live-imaging vanwege hun doorschijnende cuticula en krachtige genetica. Dit protocol beschrijft hoe u een single-layer PDMS apparaat, genaamd de 'larve chip' voor live-beeldvorming van cellulaire processen binnen neuronen van 3 e instar Drosophila larven benutten.

Met behulp van Microfluidics Chips voor Live Imaging en Studie van Injury Reacties in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

De huid van de volwassen C. elegans is een hanteerbaar model voor studies van epitheliale wondreacties, inclusief wondgenezing, littekenvorming en aangeboren immuniteit.

Methoden voor de huid De verwondingen en Testen voor Wond Reacties in C. elegans

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Wond-geïnduceerde polyploïdie is een geconserveerde weefsel herstel strategie waar cellen groeien in grootte in plaats van te delen om te compenseren voor celverlies. Hier is een gedetailleerd protocol over hoe de fruitvlieg te gebruiken als een model om ploidy en de genetische regulatie in epitheelwond herstel te meten.

Een Drosophila Model om wound-geïnduceerde polyploïdie te bestuderen

Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo's en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer micro-injectie wondproeven voor epidermale wondrespons in Drosophila embryo's. Deze methode maakt real-time visualisatie van genexpressie mogelijk voor onderzoek naar weefselherstel.

Micro-injectie wondproef en

Meer video's verkennen