Name: Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Leer een in vivo mutagenese-assay voor hematopoëtische cellen met het LacI-transgene muizenmodel. Deze methode detecteert spontane en geïnduceerde DNA-mutaties om genotoxiciteit te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen David R. Rodriguez, MA bedanken voor de grafische vormgeving en fotografie in dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door financiering van de GCCRI, de NIH / NIA (5R21AG033339) en het Cancer Support Grant (P30CA054174) aan de UTHSCSA flowcytometrie Core faciliteit en de UTHSCSA Geavanceerde nucleïnezuren Core Facility.

<ol><li>Maslov, A. Y., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%2C+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Genome instability, cancer and aging.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).</li>
<li>Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability%3A+a+mechanistic+view+of+its+causes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences.</a> Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).</li>
<li>Milyavsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+DNA+damage+response+in+human+hematopoietic+stem+cells+reveals+an+apoptosis-independent+role+for+p53+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal.</a> Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).</li>
<li>Mohrin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+quiescence+promotes+error-prone+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis.</a> Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).</li>
<li>Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+polymerase+chain+reaction-based+cell+free+in+vitro+non-homologous+end+joining+assay+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells.</a> PLoS ONE. 7 (3), (2012).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+and+accelerated+DNA+repair+mediates+resistance+of+hair+follicle+bulge+stem+cells+to+DNA-damage-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).</li>
<li>Prasher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hematopoietic+reserves+in+DNA+interstrand+crosslink+repair-deficient+Ercc1-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice.</a> EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).</li>
<li>Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulating+defect+of+mismatch+repair-deficient+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells.</a> Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).</li>
<li>Carney, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-related+myelodysplastic+syndrome+and+acute+myeloid+leukemia+following+fludarabine+combination+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy.</a> Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).</li>
<li>Jankowska, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+excision+repair+dysfunction+in+a+subgroup+of+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome.</a> Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).</li>
<li>Tam, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment-related+myelodysplasia+following+fludarabine+combination+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy.</a> Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).</li>
<li>Webb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeroderma+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Xeroderma pigmentosum.</a> BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).</li>
<li>Ben-Yehuda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+instability+and+p53+mutations+in+therapy-related+leukemia+suggest+mutator+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype.</a> Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).</li>
<li>Casorelli, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+treatment+in+the+development+of+mismatch+repair+defective+acute+leukemia+and+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome.</a> DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).</li>
<li>Olipitz, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+DNA-mismatch+repair%3A+a+potential+mediator+of+leukemogenic+susceptibility+in+therapy-related+myelodysplasia+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia.</a> Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).</li>
<li>Haase, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+prognostic+impact+of+the+karyotype+in+MDS+and+correlation+with+subtypes%3A+evidence+from+a+core+dataset+of+2124+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients.</a> Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).</li>
<li>Kohler, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+spontaneous+and+induced+mutations+in+transgenic+mice+using+a+lambda+ZAP%2FlacI+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector.</a> Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).</li>
<li>Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intralaboratory+optimization+and+standardization+of+mutant+screening+conditions+used+for+a+lambda%2FlacI+transgenic+mouse+mutagenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay.</a> 327 (1-2), 57-66 (1995).</li>
<li>Jakubczak, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+instability+during+mammary+tumor+progression+using+a+novel+selection-based+assay+for+in+vivo+mutations+in+a+bacteriophage+lambda+transgene+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).</li>
<li>Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Escherichia+coli-derived+mutation+detected+with+the+Big+Blue+cII+mutant+selectable+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).</li>
<li>Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nonsense+sites+in+the+lacI+gene+with+specific+codons+in+the+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence.</a> Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).</li>
<li>Provost, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+in+vivo+mutation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for in vivo mutation analysis.</a> Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).</li>
<li>Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spontaneous+mutagenesis%3A+an+analysis+of+the+spectrum+of+spontaneous+mutation+in+the+Escherichia+coli+lacI+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene.</a> J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).</li>
<li>Schaaper, R. M., Dunn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+mutation+in+the+Escherichia+coli+lacI+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene.</a> Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).</li>
<li>Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENU-induced+mutagenesis+at+a+single+A%3A+T+base+pair+in+transgenic+mice+containing+phi+X174%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174.</a> Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).</li>
<li>Valentine, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mutant+spectra+generated+by+a+forward+mutational+assay+for+gene+A+of+Phi+X174+from+ENU-treated+transgenic+mouse+embryonic+cell+line+PX-2%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2.</a> Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).</li>
<li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).</li>
<li>Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+and+isolation+of+murine+hematopoietic+stem+cells+and+lineage-committed+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low%2Fnegative+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpack+packaging+extract+for+lambda+transgenic+shuttle+vector+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery.</a> Instruction manual. , (2001).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecoverEase+DNA+isolation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">RecoverEase DNA isolation kit.</a> Instruction manual. , (2009).</li>
<li>Stratagene, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Big+Blue+transgenic+mouse+mutagenesis+assay+system%5BTitle%5D)+AND+%22Instruction+manual%22%5BJournal%5D)">Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system.</a> Instruction manual. , (1992).</li>
<li>Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+validation+of+the+Big+Blue+transgenic+mouse+mutagenesis+assay%3A+the+mutational+spectrum+of+ex+vivo+pinpoint+mutant+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Muta.+Res%22%5BJournal%5D)">Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques.</a> Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).</li>
<li>Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+analysis+of+lacI+mutations+in+sectored+plaques+from+Big+Blue+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice.</a> Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).</li>
<li>Bielas, J. H., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+is+necessary+for+both+repair+and+mutation+in+transgenic+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).</li>
<li>Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+spontaneous+somatic+mutations+and+sectored+plaques+detected+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice.</a> Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).</li>
<li>de Boer, J. G., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lacI+gene+as+a+target+for+mutation+in+transgenic+rodents+and+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli.</a> Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).</li>
<li>Piegorsch, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+design+and+sample+sizes+for+a+lacI+transgenic+mouse+mutation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lin%28-%29Sca1%28%2B%29kit%28%2B%29CD34%28%2B%29Flt3-+short-term+hematopoietic+stem+cells+capable+of+rapidly+reconstituting+and+rescuing+myeloablated+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients.</a> Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).</li>
<li>Hilbe, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilbe%2C+JM+%22Negative+Binomial+Regression.+second+edn%22">Negative Binomial Regression. second edn</a>. , Cambridge University Press. (2011).</li>
<li>de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+mutation+in+lacI+transgenic+mice%3A+a+comparison+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues.</a> Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).</li>
<li>Huffman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+approximation+to-sample+poisson+test%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Stat%22%5BJournal%5D)">An improved approximation to-sample poisson test.</a> Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De in vivo mutagenese test hierin beschreven is het Lacl transgene muismodel oorspronkelijk gegenereerd door Kohier et al.. 18 Dit model maakt gebruik van een λ faag vector die een lacl reportergen. De twee cos plaatsen aan weerszijden van de vector zodat een relatief eenvoudige terugwinning en daaropvolgende verpakkingsmateriaal infectieuze faagdeeltjes, gebruikt infecteren E. coli. Een blauwe plaquette zal worden gegenereerd door faag-geïnfecteerde E...

In de meeste weefsels, gedifferentieerde cellen hebben een beperkte levensduur. Om functionele integriteit, langlevende, weefselspecifieke stamcellen continu produceren progenitorcellen die op hun beurt aanleiding geven tot de volledig gedifferentieerde cellen vereist voor de functie van dat weefsel. Stamcellen hun eigen compartiment vullen ook door een proces genaamd zelfvernieuwing. Aldus stamcellen zijn verantwoordelijk voor de functionele integriteit van het weefsel waaruit ze wonen inch Daarom is het noodzakelijk dat ze uitgerust met robuuste mechanismen te voelen en mogelijk repareren beschadigd DNA. Anders kan deze meerdere genomische (mogelijk schadelijke) verstoringen, die worden overgenomen door hun nageslacht te verkrijgen. Inzicht in hoe stamcellen vrijwaren hun genoom tijdens de levensduur van een organisme is een belangrijke vraag en kan ons helpen begrijpen waarom genomische instabiliteit is verbonden met kanker en andere ouderdomsziekten (beoordeeld in 1,2). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Controlling genomische integriteit van een weefsel op het niveau van stamcellen of voorlopercellen vroege celpopulaties kan worden bereikt door ofwel het elimineren defecte stam (of progenitor cellen) via celdood, senescentie of differentiatie en / of efficiënte reparatie van beschadigd DNA. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is bepaalde DNA herstel direct deze zeldzame populaties 3-6 meten. Er werd gevonden dat bijvoorbeeld in het hematopoietische systeem, dubbelstrengs DNA breuken kunnen worden gerepareerd door homologe recombinatie (HR) of niet-homologe eind mee (NHEJ), waarbij de laatste een reparatieproces lagere betrouwbaarheid en dus meer kans maken fouten. Beide worden gebruikt in hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) 4,5, maar in muizen lijkt het overwegend NHEJ in HSC terwijl vroege voorlopercellen cellen te gebruiken HR 4. Een vergelijkbare waarneming werd gedaan voor stamcellen in de huid 6. Interessant is dat in menselijke HSCs HR, niet NHEJ,lijkt het herstelmechanisme van de keuze voor dubbelstrengsbreuken 3 zijn. Of dit functioneel verschil tussen de twee species echt is of slechts vertegenwoordigt een technologische of experimentele verschil nog te bezien. Repertoire Een stamcel om beschadigd DNA te repareren waarschijnlijk andere DNA herstel mechanismen, zoals base excisie reparatie (BER), nucleotide excisie reparatie (NER) en mismatch repair (MMR) bevatten. BER en NER zijn verantwoordelijk voor het repareren van een of meerdere basenparen laesies in enkelstrengs DNA, terwijl MMR fixes base-base mismatches en insertie / deletie lussen, deze vormen van DNA-schade niet kan worden gerepareerd door NHEJ of HR. Ondersteunende dit begrip verschillende onderzoeken van het hematopoëtische systeem het verband aantoont tussen veranderingen in een van deze wegen en afwijkingen in de HSC compartiment 7-9, en een verhoogd risico op myelodysplastisch syndroom 10-16, een ziekte die ontstaat in deHSC en dat bij hogere genomische instabiliteit als de ziekte vordert 17. Tot nu toe, hebben metingen van BER, NER, en MMR direct HSC niet gemeld. Naast het ophelderen van de verschillende processen die weefselintegriteit op een mechanistische niveau beheersen, is het noodzakelijk om in staat om de mate van gemuteerde DNA te meten, waardoor de gevolgen van afwijkingen in een van deze processen kunnen worden getest, bijvoorbeeld in normale versus genetisch gemanipuleerde stamcellen of in oud versus jong. De ontwikkeling van een relevante assay is moeilijk vanwege het gebrek aan weefselspecifieke stamcellen en het ontbreken van kweekomstandigheden die &quot;stemness&quot; behoudt. Bovendien moet een dergelijke test wijzigbaar milieu en genetische manipulaties. Een mogelijke oplossing voor deze beperkingen en eisen is het gebruik van muismodellen die specifiek zijn ontworpen om DNA-mutaties te detecteren. Multiple transgene muismodellen voor mutatiedetectie zijn ontwikkeld. Bijvoorbeeld LacI transgene muizen 18 dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reportersysteem, waarbij de Lacl gen codeert voor een suppressor van Lac operator en dient als de mutatie reporter. Na mutatie van het Lacl gen, is de Lac operator geactiveerd en β-galactosidase geproduceerd. β-galactosidase splitst het chromogene substraat X-gal (5-broom-4-chloor-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), die blauw wordt. De cos plaatsen aan weerszijden van de LacI vector maakt een eenvoudige herstel door lambdafaag eiwitten en de daaropvolgende infectie van E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de X-gal substraat bevat, kan plaques worden gescoord. Blauwe plaques bevatten een vermeende mutant Lac-I dragende faag, terwijl heldere plaques haven niet-mutanten. De frequentie van blauwe plaques (onder the duidelijk zijn) geeft de mutant frequentie in de oorspronkelijke cel bevolking het DNA werd geëxtraheerd uit. Bovendien kan de faag λ gastheer van de Lacl doel gemakkelijk worden gesequenced met behulp van PCR-technieken relatief hoge doorvoer analyse. Sequencing meerdere gemuteerde LacI genen zullen belangrijke informatie over de mutatie spectrum, die op hun beurt kunnen wijzen op eventuele tekortkomingen in specifieke DNA repair pathways of om specifieke genotoxische gebeurtenissen onthullen. Het Lacl transgene systeem is gestandaardiseerd verschillende laboratoria 19 en reagentia zijn commercieel verkrijgbaar. Een groot nadeel van het Lacl systeem is de beperkte mogelijkheid om grote deleties of herschikkingen detecteren, daarom, andere methoden, zoals multi-color FISH metafase smeersels moeten worden gebruikt om deze tekortkoming complimenteren. Binnen de λ faag vector van de Lacl muismodel er een veel kleinere gen, CII, Beschikbaar voor mutatie analyse. De omvang en het feit dat mutanten kunnen worden gekozen maakt dit een minder arbeidsintensief en goedkoper assay 20 dan de Lacl gen analyse. Echter, de Lacl gen uitvoeriger bestudeerd voor mutagenese 21 en de gevoeligheid van het gen mutaties is goed gekarakteriseerd, zodat er een duidelijk begrip van de aminozuurresten die een fenotypische reactie op een chromogeen substraat 22-25 genereren. Andere muismodellen voor mutatie detectie omvatten het gebruik van de ΦX174 of LacZ transgenen. De ΦX174 transgeen muismodel, met de originele A: T → G: C terugkeer mutatieassay 26 of de forward mutatie assay 27 dat maakt de ontdekking van een spectrum van substituties van baseparen, betekent een minder kostbaar systeem dan de LacI model. Echter, het mutatie-scherm in de forward test is niet triviaal en de mutatie spectrum van de ΦX174 transgen is minder goed gekarakteriseerd als die van de Lacl. In muismodellen dragen LacZ transgenen, wordt de LacZ mutatie-verslaggever hersteld met behulp van E. coli gastheercellen die gevoelig galactose en medium met galactose 28 zijn. Een nadeel van dit systeem is dat het herstel van het LacZ doel ook betrekking restrictie endonuclease digestie gevolgd door ligatie en elektroporatie van E. coli gastheer, waardoor het moeilijk is om het systeem aan te passen voor kleine aantallen cellen. Hoewel het geen absoluut vereiste voor de bewerking van stam / voorlopercellen celpopulaties (men altijd beginnen met meer muizen), als grote aantallen cellen zijn (bijv. miljoen of meer) zal snel onpraktisch en duur is geworden. Ook de relatief grote omvang van LacZ, terwijl een mutatie gevoelige reporter, is omslachtig en kostbaar voor DNA-sequentieanalyse en bepaald tenzoek van mutatie spectra. Een groot voordeel van dit model is echter het vermogen om grote deleties en inserties detecteren en chromosomale herschikkingen. Aangezien alle cellen in de Lacl, LacZ ΦX174 en transgene muismodellen dragen de reporter systeem, kan elk van deze muizenmodellen worden gebruikt om mutagenese te meten op elk celtype, waaronder stamcellen en progenitorcellen, zolang zij betrouwbaar kunnen worden geoogst en in voldoende aantallen. Omdat we veel ervaring met de LacI muismodel en de LacI mutatie assay, hebben we besloten om dit systeem verder voor mutagenese analyse voort te zetten in de hematopoietische stamcellen en populaties. De hematopoietische weefsel is goed gekarakteriseerd in termen van celoppervlak fenotype van de individuele componenten, inclusief langdurige herbevolken stamcellen, die herkenbaar zijn als de uiterst zeldzame bevolking van Lin zijn - IL7R <sup&gt; - Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - cellen 29. . Mohrin et al. 4 aangetoond dat de iets grotere populatie van LSK/Flk2 - cellen zijn nog steeds goed vertegenwoordigers voor HSC en significant verschillend van de meest primitieve gecommitteerde myeloïde voorlopercellen (CMP) bevolking als het gaat om het bestuderen van DNA-herstel. Bovendien, wanneer de HSC-verrijkte LSK (Flk-2 + en Flk-2 -)-cellen vergeleken met de Lin - IL7R - Sca-1-cKit + + (LS-K progenitorcellen), was er nog steeds een significant verschil in NHEJ vermogen 5 tussen de minder zuiver, stamcellen verrijkte LSK bevolking en de voorlopercellen. In ons onderzoek gebruiken we HSC-verrijkte LSK (Flk-2 + en Flk-2 -) cellen omdat we vonden dat ten minste 2 x 10 5 cellen voor consistente, betrouwbare resultaten in deze bepaling mutagenese, dit aantal cellen is uiterst moeilijkte verkrijgen als men sorteert de LSK/Flk2 - CD150 + CD48 bevolking of zelfs de LSK/Flk2 - bevolking (in termen van muizen, kosten en uitvoerbaarheid). Dit protocol, gebaseerd op een oorspronkelijk ontwikkeld door Kohier et al.. 18 beschrijft in detail hoe de spontane mutatiefrequentie DNA kan worden bepaald LSK cellen en gedefinieerde populaties van myeloïde cellen gedifferentieerde en voorspannen beenmerg en milt cellen.

<table><tbody><tr><td>LacI transgene muizen&nbsp;</td><td>BioReliance Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RecoverEase DNA-isolatiekit, inclusief de RNace-It ribonuclease cocktail</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract, inclusief de oranje en blauwe transpackbuizen en de SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>DNA-maatstaven &ndash; lambda ladder</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0.025 mM Poregroottemembranen&nbsp;</td><td>Fisher (Millipore)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 Bioassay schaaltjes (bakken)&nbsp;</td><td>Fisher (Corning)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>NZY-bouillon (poeder)</td><td>Fisher (Teknova)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Fisher</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>PCR Extender Taq Polimerase kit</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP cleanup kit</td><td>Beckman/Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr></tbody></table>

het identificeren van dna-mutaties in gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

De laatste jaren is gebleken dat genomische instabiliteit nauw gerelateerd aan vele ontwikkelingsstoornissen, kanker en veroudering. Gezien het feit dat stamcellen zijn verantwoordelijk voor weefselhomeostase en reparatie gedurende het hele leven, is het redelijk om te veronderstellen dat de stamcel populatie is van cruciaal belang voor het behoud van genomische integriteit van de weefsels. Daarom is er aanzienlijke belangstelling ontstaan ​​bij de beoordeling van de impact van de endogene en omgevingsfactoren op genomische integriteit in stamcellen en hun nakomelingen, gericht op de etiologie van stamcel-ziekten te begrijpen. Lacl transgene muizen dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reporter systeem, waarbij de Lacl gen dient als mutatie reporter. Het resultaat van een gemuteerd Lacl gen de productie van β-galactosidase, dat een chromogeen substraat klieft, draaien blauw. De LacI reporter systeem is uitgevoerd in alle cellen, met inbegrip van stam / voorlopercellen en kan eenvoudig worden teruggewonnen en gebruikt vervolgens infecteren E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de juiste substraat bevat, kan plaques worden gescoord; blue plaques wijzen op een mutant LacI gen, terwijl heldere plaques haven wild-type. De frequentie van blauwe (onder duidelijke) plaques geeft de mutatiefrequentie in de oorspronkelijke celpopulatie het DNA werd geëxtraheerd uit. Sequencing van de gemuteerde Lacl gen zal de locatie van de mutaties in het gen en het soort mutatie vertonen. De LacI transgene muismodel is goed ingesteld als een in vivo mutagenese test. Bovendien, de muizen en de reagentia voor de test zijn commercieel verkrijgbaar. Hier beschrijven we in detail hoe dit model kan worden aangepast aan de frequentie van spontaan optredende mutanten DNA stamcellen verrijkte Lin meten - IL7R - Sca-1 + cKit + + (LSK) cellen en andere subpopulaties van het hematopoietische systeem.

<html> De in vivo mutagenese test meet een zeldzame gebeurtenis (mutant pfu&#39;s) onder vele evenementen (alle pfu&#39;s). Door het uitvoeren van de assay met klein aantal cellen, is het mogelijk dat het resultaat sterk wordt beïnvloed door vals-positieve en vals-negatieve resultaten. Om dit probleem aan te pakken hebben we een seriële verdunning experiment met niet-gefractioneerde beenmergcellen, geoogst uit drie verschillende dieren. We maten de mutant frequentie in het beenmerg van dieren die met 1,4 x 10 <s...

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De kolonievormende cel (CFC) assay is een in vitro assay waarin hematopoietische voorlopercellen vormen kolonies in een semi-vast medium. Een combinatie van kolonie morfologie, celmorfologie en flowcytometrie worden gebruikt om het vermogen van de voorouders te laten groeien en differentiëren langs de verschillende hematopoietische lijnen te beoordelen.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Dit protocol biedt stapsgewijze richtlijnen voor het opzetten van competitieve muisbeenmergtransplantatie-experimenten om hematopoëtische stam-/voorlopercellenfunctie te bestuderen zonder voorafgaande zuivering van stamcellen door celsortering.

Concurrerende Transplantaties om hematopoietische stamcellen Fitness Evalueer

Kwantificering van donor-afgeleide cellen is vereist voor het controleren van engraftment na stamceltransplantatie bij patiënten met Hemoglobinopathieën. Een combinatie van stroom cytometry gebaseerde cel sorteren, kolonie vorming assay, en na diverse analyses van korte tandem herhalingen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de proliferatie en differentiatie van de progenitoren in het compartiment van de erythroid.

Detectie van residuele Donor Erythroid voorlopercellen na hematopoietische stamceltransplantatie voor patiënten met Hemoglobinopathieën

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

We beschrijven het gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) te beoordelen van de kwaadaardige potentieel van genetisch gemanipuleerde hematopoietische cellen. HSCT is handig voor de evaluatie van verschillende kwaadaardige hematopoietische cellen in vivo , alsmede het genereren van een grote cohort van muizen met myelodysplastic syndromes (MDS) of leukemie ter evaluatie van nieuwe therapieën.

Gebruik van hematopoietische stamceltransplantatie te beoordelen van de oorsprong van myelodysplastisch syndroom

Somatische mutatie patronen in cellen weerspiegelen de eerdere mutagene blootstelling en kunnen ontwikkelings relaties met de afstamming onthullen. Hier gepresenteerd is een methodologie voor het catalogiseren en analyseren van somatische mutaties in individuele hematopoietische stam-en voorlopercellen.

Karakteriseren van Mutationele belasting en klonale samenstelling van menselijk bloed

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde hematopoietische stam- en voorlopercel (HSPC) kweekprocedure voor de robuuste engraftment van gen-bewerkte cellen in vivo.

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

Leer een in vivo mutagenese-assay voor hematopoëtische cellen met het LacI-transgene muizenmodel. Deze methode detecteert spontane en geïnduceerde DNA-mutaties om genotoxiciteit te bestuderen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Meer video's verkennen